CN103030738B

CN103030738B - 一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物及其制备方法

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Publication number: CN103030738B
Application number: CN201210577816.1A
Authority: CN
Inventors: 袁建超; 贾宗; 苗承萍; 栗静; 宋凤英; 袁兵年; 王福州
Original assignee: Northwest Normal University
Current assignee: Northwest Normal University
Priority date: 2012-12-27
Filing date: 2012-12-27
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2032-12-27
Also published as: CN103030738A

Abstract

本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物，是将2-羟基-1,4-萘醌通过聚合的方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺上而形成的一种生物相容良好的高分子共聚物，属于高分子化学及应用领域。本发明的共聚物将2-羟基-1,4-萘醌与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的活性进行叠加，进一步促进了聚合物对肿瘤的抑制作用，而且降低了聚合物的毒性，同时体现出良好的生物水溶性。体内抑制肿瘤细胞生长实验证明，本发明共聚物对肝癌H22细胞具有较强的肿瘤抑制作用，这为制备抗肿瘤药物提供了一种新的思路。

Description

一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物及其制备方法

技术领域

本发明属于高分子化学领域，涉及一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物—N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-2-羟基-1,4-萘醌；本发明同时还涉及该共聚物的制备方法；本发明还涉及该共聚物对肝癌H22细胞的肿瘤抑制作用。

背景技术

癌症已经成为人类健康的主要威胁之一，且呈明显上升趋势。现今治疗癌症的主要方法包括放疗、化疗、手术疗法和基因疗法。其中放疗和化疗是极其重要的非手术疗法，但是放疗和化疗在杀死肿瘤细胞的同时也对机体正常细胞产生严重损伤。

萘醌类化合物是一类广泛存在于自然界中的小分子化合物，具有多种生物活性。根据母体结构的不同，该类化合物可分为萘茜类 (5,8-二羟基-1,4-萘醌)、1,4-萘醌类和1,2-萘醌类等。Kamei等进行了醌类化合物抑制细胞生长试验，发现散沫花主要抑制细胞生长的S期，而且化合物中酚羟基的个数越多细胞毒性越大。散沫花素，化学名为2-羟基-1,4-萘醌，其结构式如下：

由于散沫花素的水溶性差，选用助溶剂（无水乙醇，DMSO等）会引起多种毒副反应。另外，给药时经水稀释后，需要一个0.22 μm微孔膜滤过。

N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）是一种高分子药物载体，其结构式如下：

由于HPMA具有良好的生物相容性，不仅能够降低药物的毒副作用，减少抗药性，提高药物体内的稳定性，还能增加药物在肿瘤部位的累积，使药效得到更好的发挥等特点，被作为肿瘤靶向药物载体已应用于临床。因此，以水溶性好的N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺为药物载体，通过与散沫花素共聚得到具有具有抗肿瘤活性的高分子共聚物，可望为抗癌领域提供了更多的选择。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物。

本发明的另一目的是提供一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法。

（一）具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物

本发明具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物，是将散沫花素通过聚合的方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）上而形成的一种生物相容良好的高分子共聚物—N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺-2-羟基-1,4-萘醌，其结构如下：

式中，n=10~15，m=85~90；数均分子量Mn=2.4~3.2×10⁴，Mw/Mn=1.16~1.21。

本发明的共聚物2-羟基-1,4-萘醌与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的抗肿瘤活性进行叠加，进一步促进了聚合物对肿瘤的抑制作用，同时大大延长了抗癌药物在肿瘤的停留时间。而且高分子载体HPMA也降低了抗癌药物的毒性，同时体现出良好的生物相溶性，从而减少了对正常组织的伤害，是一种具有应用前景的抗肿瘤活性物质。

本发明具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，包括以下工艺步骤：

（1）中间体的制备：将2-羟基-1,4-萘醌溶于丙酮中，加入缚酸剂，在氮气保护下，加入甲基丙烯酰氯，于-5~5℃反应4~5 h时间；待反应完全后，反应液浓缩，经硅胶柱层析分离，得到中间体化合物。其结构式为：

所述2-羟基-1,4-萘醌与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1~1:1.2。

所述缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、三乙胺或三甲胺，甲基丙烯酰氯与缚酸剂的摩尔比为1:1.1~1:1。

所述硅胶柱层析所用洗脱剂为：乙酸乙酯与石油醚以1:40~1:50的体积比。

（2）目标化合物的制备：将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺与中间体化合物用DMSO和丙酮溶解，加入引发剂偶氮二异丁腈 (AIBN)，氮气保护下于50~60℃反应20~24 h，用丙酮和***的混合液沉淀，过滤，用无水甲醇溶解沉淀物，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标高分子共聚物。

所述中间体化合物与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺（HPMA）的投料摩尔比为1:4~1:20。

所述DMSO和丙酮的体积比为1:1~1:0.5。

所述引发剂偶氮二异丁腈的用量为中间体化合物与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺总质量的5%~10%。

图1为上述方法制备的具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的核磁共振氢谱。通过核磁共振氢谱分析可以得出，共聚得到的高分子聚合物，化学位移在6.5-9ppm之间有化合物2-羟基-1,4-萘醌中芳环上氢的出峰，化学位移在3.70ppm和2.81ppm左右会出现HPMA上的特征峰-CH-（和-OH相连）和-CH₂（和-NH-相连），同时化学位移在5-6ppm之间没有出峰，说明用上述方法共聚得到的产物与前面设计的结构一致。

二、抗肿瘤活性实验

1、体外抑制肿瘤细胞生长实验

采用四氮唑盐还原法（MTT）对H22细胞株进行试验：取处于生长对数期的肝癌H22细胞，将细胞浓度调为2×10⁴个／ml，在96孔培养板中加入90 μl/孔，边缘孔用无菌PBS填充。在5% CO₂，37℃孵育，培养箱中放置待贴壁后再加药。对于本发明高分子共聚物和散沫花素（2-羟基-1，4-萘醌），均分别设定浓度为0.2、1、5、25、125 μg/ml 5个梯度。实验组与对照组均设4个复孔，加药后细胞在温度37 ℃二氧化碳培养箱内继续分别培养24，48，72 h后，取出先离心，后弃去96孔板内的上清培养液，小心用PBS冲洗2~3遍后，每孔加人20 μl MTT （四氮唑，5 mg/ml，即0.5% MTT）溶液，置于37℃二氧化碳培养箱内继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150 μl的DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570 nm测定各孔的吸光OD值。细胞生长抑制率按以下公式计算：

抑制率= [(1－实验组平均OD值)/对照组平均OD值]×100％

测试结果见表1及图2。

表1高分子共聚物与散沫花素体外72h抗癌活性数据

其中共聚物的IC₅₀=7.7μg/ml, 2-羟基-1,4-萘醌的IC₅₀=25.9μg/ml.

2、体内抑制肿瘤细胞生长实验

采用静脉注射和瘤体直接注射对昆明小鼠接种的H22实体瘤进行试验：对接种好的昆明小数进行随机分组，每组6只。荷瘤小鼠用可他命（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（7 mg/kg）的混合液进行麻醉，在尾部静脉注射0.1 mL 100 μCi（3.7 MBq）的生理盐水，散沫花素，高分子共聚物，每日给药1次，连续18天，共计18次。给药期间每2日用游标卡尺测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)，计算移植瘤体积V = (L×W²)/2，瘤重抑制率(%)IR = (对照组肿瘤平均体积﹣给药组肿瘤平均体积)／对照组肿瘤体积×100。试验结果见表2及图3。

表2 散沫花素、散沫花素类高分子聚合物对肝癌H22细胞的抑制率（%）

综上所述，本发明制备的散沫花素类高分子聚合物体现出了良好的生物水溶性，同时降低了聚合物的毒性，而且对肝癌H22肿瘤细胞具有很好的抑制作用，为制备抗肿瘤药物提供了一种新的思路。

附图说明

图1为本发明具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的核磁共振氢谱；

图2为本发明高分子共聚物与散沫花素体外72h抗癌活性曲线；

图3为本发明高分子共聚物与散沫花素体内抗癌活性曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明高分子共聚物的合成及结构表征作进一步的说明。

实施例1

（1）中间体化合物 (a) 的制备：称取0.5279 g (3 mmol) 的2-羟基-1,4-萘醌于烧瓶中，用30 ml丙酮溶解，加入0.4146 g (3 mmol) 的无水K₂CO₃作为缚酸剂，在氮气保护下，冰水浴中，不断搅拌下，缓慢滴入0.3763 g (3.6 mmol) 的甲基丙烯酰氯，在室温下反应。反应过程中用TCL 监测反应进行程度。待反应结束后抽滤，滤液浓缩后粗产品用硅胶柱分离 (乙酸乙酯/石油醚 = 1/40（v/v）)，收集产物组分，蒸去溶剂，得到黄色固体0.7432 g，产率88%。

¹H NMR (400 MHz, CCl₃, δ, ppm): 2.111 (s, 3H, -CH₃), 5.915 (s, 1H, -C=CH₂), 6.455 (s, 1H, -C=CH₂), 6.862 (s, 1H, naphthyl ring), 7.809 (d, 2H, naphthyl ring), 8.138 (t, 2H, naphthyl ring). ¹³C NMR (100 MHz, CCl₃, δ, ppm): 18.148, 125.966, 126.885, 129.330, 130.986, 131.858, 133.949, 134.345, 154.571, 164.175, 178.583, 184.492。

（2）共聚物的制备：称取0.2720 g (95%，1.9 mmol) HPMA加入到Shleck瓶中，用0.5 ml的DMSO加热溶解，再加入0.5 ml的丙酮；称取0.0242 g (5%，0.1 mol)中间体化合物加入到Shleck瓶中，搅拌直至溶解，待冷却至室温时加入0.0149 g (5%, wt) 偶氮而异丁腈 (AIBN)，抽真空充氮气循环3~5次，密封后保持温度大约在55℃左右，反应24小时。用丙酮和***的混合液 (体积比为7:3) 沉淀，过滤后用1ml的无水甲醇溶解沉淀，用分子量为3000的超滤浓缩离心管进行离心，除去小分子，得到聚合物80mg，产率约27%。

M_n=3.2×10⁴，M_w/M_n=1.21. ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 0.712 (-CH₃), 0.975 (-CH₃), 1.375-1.871 (-CH₂-), 2.880-2.998 (-CH₂- connected with -OH), 3.714 (-CH- connected with -NH-), 6.894 (naphthyl ring), 7.892 (naphthyl ring) ,8.614 (naphthyl ring). ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 22.59, 31.77, 45.64, 48.63, 65.91, 122.37, 129.58, 129.94, 131.57, 133.41, 156.99, 163.74, 174.15, 176.58, 182.63。

实施例2

（1）中间体化合物的制备：同实施例1。

（2）共聚物的制备：称取0.1589 g (92%，1.15 mmol) HPMA加入到Shleck瓶中，用0.5 ml的DMSO加热溶解，再加入0.5 ml的丙酮；称取0.0242 g (8%，0.1 mol)中间体化合物加入到Shleck瓶中，搅拌直至溶解，待冷却至室温时加入0.0145 g (8%, wt) 偶氮而异丁腈 (AIBN)，抽真空充氮气循环3~5次，密封后保持温度大约在55℃左右，反应24小时。用丙酮和***的混合液 (体积比为7:3) 沉淀，过滤后用1ml的无水甲醇溶解沉淀，用分子量为3000的超滤浓缩离心管进行离心，除去小分子，得到聚合物56mg，产率约38.2%。

M_n=2.4×10⁴，M_w/M_n=1.16. ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 0.785(-CH₃), 0.942 (-CH₃), 1.521-1.639 (-CH₂-), 2.854-2.998 (-CH₂- connected with -OH), 3.541(-CH- connected with -NH-), 7.012 (naphthyl ring), 7.924 (naphthyl ring) , 8.607 (naphthyl ring). ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 23.89, 31.41, 46.74, 49.85, 67.90, 124.26, 130.14, 131.27, 133.46, 136.255, 158.30, 165.07, 176.89, 178.17, 182.90。

实施例3

（1）中间体化合物的制备：同实施例1。

（2）共聚物的制备：称取0.2488 g (90%，1.8 mmol) HPMA加入到Shleck瓶中，用0.2 ml的DMSO加热溶解，再加入0.2 ml的丙酮；称取0.0484 g (10%，0.2 mol)中间体化合物加入到Shleck瓶中，搅拌直至溶解，待冷却至室温时加入0.0238 g (8%, wt) 偶氮而异丁腈 (AIBN)，抽真空充氮气循环3~5次，密封后保持温度大约在55℃左右，反应24小时。用丙酮和***的混合液 (体积比为7:3) 沉淀，过滤后用1ml的无水甲醇溶解沉淀，用分子量为3000的超滤浓缩离心管进行离心，除去小分子，得到聚合物85mg，产率约28.6%。

M_n=2.4×10⁴，M_w/M_n=1.16. ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 0.808(-CH₃), 1.019 (-CH₃), 1.579-1.724 (-CH₂-), 2.914-3.042 (-CH₂- connected with -OH), 3.688(-CH- connected with -NH-), 7.504-7.554 (naphthyl ring), 7.853-7.869 (naphthyl ring). ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 23.64, 30.59, 46.17, 49.50, 67.15, 123.61, 129.86, 130.67, 132.71, 135.17, 157.46, 164.57, 176.26, 177.80, 182.86。

实施例4

（1）中间体化合物的制备：同实施例1。

（2）共聚物的制备：称取0.2032 g (88%，1.47 mmol) HPMA加入到Shleck瓶中，用0.5 ml的DMSO加热溶解，再加入0.5 ml的丙酮；称取0.0484 g (12%，0.2 mol)中间体化合物加入到Shleck瓶中，搅拌直至溶解，待冷却至室温时加入0.0252 g (10%, wt) 偶氮而异丁腈 (AIBN)，抽真空充氮气循环3~5次，密封后保持温度大约在55℃左右，反应24小时。用丙酮和***的混合液 (体积比为7:3) 沉淀，过滤后用1ml的无水甲醇溶解沉淀，用分子量为3000的超滤浓缩离心管进行离心，除去小分子，得到聚合物79mg，产率约31.2%。

M_n=2.4×10⁴，M_w/M_n=1.16. ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 0.796(-CH₃), 0.981 (-CH₃), 1.484-1.651 (-CH₂-), 2.875-2.980 (-CH₂- connected with -OH), 3.617(-CH- connected with -NH-), 6.968 (naphthyl ring), 7.871 (naphthyl ring) , 8.640 (naphthyl ring). ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 22.81, 30.27, 44.59, 48.73, 67.09, 122.48, 128.61, 130.09, 131.47, 135.85, 156.90, 164.72, 177.14, 178.23, 181.97。

实施例5

（1）中间体化合物的制备：同实施例1。

（2）共聚物的制备：称取0.3179 g (85%，2. 3 mmol) HPMA加入到Shleck瓶中，用0.2 ml的DMSO加热溶解，再加入0.2 ml的丙酮；称取0.0968 g (15%，0.4 mol)中间体化合物加入到Shleck瓶中，搅拌直至溶解，待冷却至室温时加入0.0415 g (10%, wt) 偶氮而异丁腈 (AIBN)，抽真空充氮气循环3~5次，密封后保持温度大约在55℃左右，反应24小时。用丙酮和***的混合液 (体积比为7:3) 沉淀，过滤后用1ml的无水甲醇溶解沉淀，用分子量为3000的超滤浓缩离心管进行离心，除去小分子，得到聚合物93mg，产率约22.4%。

M_n=2.9×10⁴，M_w/M_n=1.19. ¹H NMR (400 MHz, D₂O, δ, ppm): 0.789 (-CH₃), 0.986 (-CH₃), 1.259-1.261 (-CH₂-), 2.889-2.908 (-CH₂- connected with -OH), 3.684 (-CH- connected with -NH-), 7.017 (naphthyl ring), 7.894 (naphthyl ring) ,8.627(naphthyl ring). ¹³C NMR (400 MHz, DMSO-d6, δ, ppm): 20.17, 30.64, 43.57, 47.19, 63.74, 121.40, 128.09, 129.16, 132.71, 133.89, 154.72, 162.64, 173.05, 176.49, 180.87。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物，是将2-羟基-1,4-萘醌通过聚合的方式连接到N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺上而形成的一种生物相容良好的高分子共聚物，其结构如下：

式中，n=10~15，m=85~90。

2.如权利要求1所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，包括以下步骤：

（1）中间体化合物的制备：将2-羟基-1,4-萘醌溶于丙酮中，加入缚酸剂，在氮气保护下，加入甲基丙烯酰氯，于-5~5℃反应4~5 h；待反应完全后，反应液浓缩，经硅胶柱层析分离，得到中间体化合物；

（2）目标化合物的制备：将N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺与中间体化合物用DMSO和丙酮溶解，加入引发剂偶氮二异丁腈，氮气保护下于50~60℃反应20~24 h，用丙酮和***的混合液沉淀，过滤，用无水甲醇溶解沉淀物，最后用分子量为3000的超滤浓缩离心管离心，除去小分子即得目标高分子共聚物。

3.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述2-羟基-1,4-萘醌与甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1~1:1.2。

4.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述缚酸剂为氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、三乙胺或三甲胺。

5.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述甲基丙烯酰氯与缚酸剂的摩尔比为1:1.1~1:1。

6.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述硅胶柱层析所用洗脱剂为：乙酸乙酯与石油醚以1:40~1:50的体积比。

7.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述中间体化合物与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺的投料摩尔比为1:4~1:20。

8.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述引发剂偶氮二异丁腈的用量为中间体化合物与N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺总质量的5%~10%。

9.如权利要求2所述具有抗肿瘤活性的散沫花素共聚物的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述丙酮和***的混合液中，丙酮和***的体积比为7:3~7:1。