CN103025342A - 蛋白质样品的比较 - Google Patents
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Abstract
提供了定性和/或定量检测蛋白质样品中突变、修饰或杂质的存在的方法。该方法利用在蛋白质消化之前将同位素标记的氨基酸变体掺入到蛋白质中,以使得能够在自下而上液相色谱中比较两种蛋白质样品。由本发明所实现的测量不仅考虑蛋白水解消化期间所产生的肽的质量,而且亦考虑各所得肽的丰度。通过在蛋白质消化之前利用与未标记的蛋白质混合的SITR样品,使得可经MS来测量肽的丰度。本文所用术语“SITRS样品”或“SITRS标准品”意为具有已知序列的蛋白质(例如抗体),其用存在于蛋白质中的至少一个氨基酸的稳定同位素标记的变体来标记。
Description
相关申请
本申请主张于2010年6月16日提交的美国临时申请序列号61/355,269的优先权权益,其全部通过引用并入本文中。
发明背景
本发明涉及使用具有带稳定同位素标签参考标准(Stable Isotope
- Tagged Reference Standard, SITRS)的自下而上液相色谱-质谱法(LC-MS)来比较两种或两种以上蛋白质样品的分析方法。
在蛋白质分析中使用具有质谱法(MS)检测的肽作图以确认一级序列。已知的分析方法主要定性确认预期肽的存在情况。
发明简述
在一个方面,本发明涉及表征蛋白质样品的方法,所述方法包括:(i)提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白质样品,其中该第一蛋白质中的至少一个氨基酸被同位素标记的氨基酸取代;(ii)提供未标记的第二蛋白质样品,其包含对应于第一蛋白质中同位素标记变体的未标记的氨基酸;(iii)将第一样品与第二样品混合以形成混合物;(iv)对该混合物进行蛋白质消化以形成第一消化物;(v)对该第一消化物进行自下而上液相色谱-质谱,以形成包括一个或多个双峰或单峰的第一波谱,每一双峰表明存在来自第一样品的同位素标记的肽和来自第二样品的相应的未标记的肽,每一单峰表明存在具有突变、修饰或杂质的肽。在某些实施方案中,该方法进一步包括(vi)比较双峰中的峰的相对强度以测定各肽的相对量的步骤,其中1:1峰比率表明第一和第二肽基本上相同,并且其中峰强度的差异反映存在化学上不同的肽。在另一实施方案中,该方法进一步包括基于峰强度的相对降低来定量该化学上不同的肽的量的步骤。在另一实施方案中,该方法进一步包括(vii)对消化物进行串联质谱以测定由波谱中的单峰代表的肽序列的步骤。
在另一方面,本发明为定性检测蛋白质样品中的突变、修饰或杂质存在情况的方法。该方法允许通过将两种或两种以上蛋白质样品中的各样品与稳定同位素标签参考标准(SITRS)蛋白质比较来相互比较这些样品。该方法包括提供第一蛋白质的样品,其中在具有已知氨基酸序列的第一蛋白质(SITRS)中的至少一个氨基酸被同位素标记的氨基酸取代;提供未标记的蛋白质样品,其包括对应于第一蛋白质中的同位素标记氨基酸的未标记的氨基酸;将第一蛋白质与未标记的蛋白质标准品混合以形成混合物;对该混合物进行消化,随后通过自下而上液相色谱-质谱法进行分析,以确定波谱是否包括表明各蛋白质中存在该特定肽的双峰。若未观察到双峰,则单峰可能对应于因以下可能性之一而产生的肽:(1)该肽不含标记的氨基酸;(2)该肽含有修饰;(3)该肽含有突变、***或缺失;(4)该肽对应于杂质,且不含蛋白质样品中存在的氨基酸序列。然后可通过MS/MS分析单峰来揭示肽的序列,并确定存在以上所列四种可能性中的哪种。
在另一方面,本发明为定量测定蛋白质样品中突变或修饰的存在情况的方法。该方法包括提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白(SITRS)的样品,其中在该第一蛋白质中的至少一个氨基酸被同位素标记的氨基酸取代;提供未标记的蛋白质样品的样品,其包括对应于第一蛋白质中的同位素标记氨基酸的未标记的氨基酸;将第一蛋白质与未标记的蛋白质样品混合以形成混合物;对该混合物进行消化,随后通过自下而上液相色谱-质谱法进行分析,以确定波谱是否包括表明SITRS和未标记的蛋白质样品中都存在该特定肽的双峰;并比较双峰中峰的强度以测定各蛋白质中该特定肽的相对丰度。可通过首先与如上文所述相同的SITRS抗体比较,然后比较各未标记的蛋白质样品的结果,来相互比较另外的未标记的蛋白质样品。
本领域普通技术人员在查阅说明书后将会理解并明了本发明的这些和其它方面。
附图简述
图 1为按照本发明的SITRS实验的示意图。
图 2为按照本发明在存在其SITRS对应物时通过胰蛋白酶消化所产生的MAb-1肽的代表性质谱。
图 3为按照本发明的SITRS实验的提取离子质谱(extracted ion mass spectra),其中将wt mAb-1与掺加突变型达20%的mAb-1进行比较(显示在wt与突变型mAb中都存在的wt HC (255-273)肽)。
图 4为按照本发明的来自图3的HC (255-273)的单同位素峰强度的表格。
图 5为按照本发明的SITRS实验的提取离子质谱,其中将wt mAb-1与掺加突变型达20%的mAb-1进行比较(显示突变型mAb中经修饰的wt HC (218-247)肽)。
图 6为按照本发明的来自图5的HC (218-247)的单同位素峰强度的表格。
图 7为按照本发明的SITRS实验的提取离子质谱,其中将wt mAb-1与掺加突变型达20%的mAb-1进行比较(显示仅存在于突变型mAb中且不存在于SITRS样品中的突变型HC (218-247)肽)。
图 8为按照本发明的LC色谱图,其显示利用尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)进行抗体去盐。
图 9为来自(A)纯的未标记的MAb-1及(B)污染有10% MAb-2的MAb-1的肽的质谱比较。让SITRS以1:1比率与每一种混合,随后按照本发明进行胰蛋白酶消化及分析。
图 10为按照本发明的图示,其描绘污染有10%
MAb-2的MAb-1样品的定量中所研究的6种肽的SITRS值。
图 11为按照本发明的来源于人胚肾293细胞与中国仓鼠***的MAb-1肽的SV比较。
图 12为按照本发明的SITRS实验的SITRS柱状图,其中将wt mAb-1与掺加突变型达20%的mAb-1进行比较。
图 13为按照本发明的SITRS实验的SITRS柱状图,其中将wt mAb-1与掺加突变型达2.5%的mAb-1进行比较。
图 14为按照本发明的掺加突变型的抗体相对于野生型抗体中肽HC
(218-247)、HC (344-359)及HC (288-300)的量的图,其如通过各种掺加突变型的mAb-1样品的SITRS分析所测量。
图 15为按照本发明的用于比较通过使用两种不同方法由两种不同细胞系产生的(CHO产生的(图15A)及HEK产生的(图15B))各批MAb-1样品的SITRS柱状图。
图 16为按照本发明的用常规分析呈现于图15B中的稳定同位素标签参考标准(SITRS)结果的表格。将来自第2批(CHO产生的)及第3批(HEK产生的)mAb-1的SITRS分析(n=6)的所选结果与通过常规方法(n=3)所获得的结果进行比较。
图 17为按照本发明的在两种不同配制缓冲液(formulation
buffer)中受到适度压力的mAb-1样品的比较的SITRS柱状图。
图 18为按照本发明的DTPA-MAb-1缀合物与未经修饰MAb-1的比较的SITRS柱状图。
优选实施方案详述
现将详细地提及本发明的实施方案,其中的一个或多个实施例如下文所示。通过解释本发明而非限制本发明的方式提供每一实施例。事实上,对本领域技术人员明显的是,可在不脱离本发明的范围或精神下对本发明进行各种修改及改变。例如,作为一个实施方案部分所阐明或阐述的特征可用于另一实施方案,以得到又一个实施方案。
因此,本发明意欲涵盖这样的修改和变化,其同样落入随附权利要求书及其等同物的范围之内。本发明的其它目标、特征及方面在以下详述中公开或根据以下详述而明了。本领域普通技术人员应了解,本发明的讨论仅为说明例示性实施方案,并非意欲限制本发明的更广泛的方面。
本文所用术语“蛋白质”或“多肽”指10个或更多个氨基酸(例如50个、100个、200个、300个、400个、500个或更多个氨基酸)的聚合物。本发明的例示性蛋白质包括但不限于重组蛋白质、生物治疗蛋白质、单克隆抗体和其它抗体、抗体-药物缀合物或其它生物缀合物、成像抗体、融合蛋白或聚乙二醇化蛋白(PEGylated
proteins)。
本文所用术语“单克隆抗体”指在一个特定位点(抗原位点)与特定靶分子(抗原)结合的一类抗体蛋白。
由本发明所实现的测量不仅考虑在蛋白水解消化期间所产生的肽的质量,而且亦考虑每种所得肽的丰度。通过利用在蛋白质消化前与未标记的蛋白质混合的SITRS样品使得能够经MS对肽的丰度进行测量。本文所用术语“SITRS样品”或“SITRS标准品”,意为用存在于蛋白质中的至少一个氨基酸的稳定同位素标记变体来标记的已知序列的蛋白质(例如抗体)。
因此,在一个方面,本发明为比较两种蛋白质(例如抗体)样品以定性和/或定量鉴别这些样品中的差异(例如突变、修饰或杂质)的方法。所述测量可通过利用在蛋白质消化和LC-MS前与未标记的蛋白质(例如未标记的抗体)混合的SITRS样品来进行。
引入稳定同位素标记的变体作为内标减少由可能会影响定量的样品处理和MS检测所导致的变化及假象。本发明减少的潜在变化的实例包括蛋白质消化程度、由于样品处理引起的假象形成和/或MS检测期间电离效率的变化。通过利用本方法,所述参数可相对于SITRS样品标准化。
在一个方面,本方法包括制备标记的蛋白质(SITRS样品)和将该标记的蛋白质与未标记的蛋白质样品混合。然后可对混合的样品进行自下而上LC-MS,以定性和/或定量测定未标记的样品中的低水平突变、修饰或杂质。亦可将该分析用于确定表达细胞系的选择不当、生长培养基的效率低下、细胞培养条件的效率低下、纯化过程的效率低下或配制缓冲液的不适当。
在一个例示性实施方案中,未标记的抗体在实验性生长培养基中形成,或由实验性细胞系/克隆产生,将所得未标记的抗体与SITRS样品混合,然后对混合的样品进行蛋白质消化及自下而上LC-MS,其可用于确定该实验性生长培养基细胞系/克隆是否可接受用于产生所需抗体。
在标准反相-高效液相色谱(RP-HPLC)条件下,标记的和未标记的肽具有几乎相同的保留时间并因此一起迁移。虽然不可通过色谱将其分离,但可通过MS检测来区分标记的和未标记的肽,产生相当于特定肽中标记的残基数目的道尔顿(Da)差异。因此,当SITRS样品与未标记的抗体或其它蛋白质混合时,表明Da差异的双峰将出现在质谱中,这表明标记的氨基酸掺入到SITRS样品中,以及在SITRS样品和未标记的抗体二者中都存在具有相同氨基酸序列的肽。与其未标记的对应物(在1:1混合物中)的唯一差异为存在标记的氨基酸的SITRS样品,将产生其中各峰具有相同强度的双峰。
可使用本领域已知的方法来制备SITRS样品,其中使用重氨基酸代替标准氨基酸。例如,当制备包括精氨酸和赖氨酸残基的蛋白质时,生长培养基可包括由6个13C原子而非天然丰富的12C原子构成的精氨酸及赖氨酸残基(精氨酸-6和赖氨酸-6)。
考虑本领域已知的重同位素标记的变体可用于本发明。本领域技术人员将认识到,重同位素标记变体的选择将视所形成的蛋白质和对制备用于LC-MS检测的蛋白质进行的蛋白质消化而定。例如,当所产生的蛋白质包括精氨酸和/或赖氨酸并将经受胰蛋白酶消化时,可能期需重精氨酸和/或赖氨酸。类似地,当所产生的蛋白质包括天冬氨酸并将经受内切蛋白酶AspN消化时,可能期需重天冬氨酸。当所产生的蛋白质包括谷氨酸并将经受内切蛋白酶GluC消化时,可能期需重谷氨酸。当所产生的蛋白质包括天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸链并将经受肠激酶消化时,可能期需重天冬氨酸和/或重赖氨酸。当所产生的蛋白质包括异亮氨酸-谷氨酸或天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸链并将经受因子Xa消化时,可能期需重异亮氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和/或精氨酸。当所产生的蛋白质包括精氨酸-X-X-精氨酸链并将经受弗林蛋白酶消化时,可能期需重精氨酸。当所产生的蛋白质包括组氨酸-酪氨酸连接并将经受麦芽糖酶(genease) I消化时,可能期需重组氨酸及/或酪氨酸。当所产生的蛋白质包括具有芳香族侧链的氨基酸并将经受胰凝乳蛋白酶消化时,可能期需具有芳香族侧链的重氨基酸。当所产生的蛋白质包括赖氨酸并将经受Lys-C或Lys-N消化时,可能期需重赖氨酸。当所产生的蛋白质包括甲硫氨酸并将经受CNBr消化时,可能期需重甲硫氨酸。当所产生的蛋白质包括精氨酸并将经受内切蛋白酶ArgC消化时,可能期需重精氨酸。本发明并非意欲限于特定同位素标记的变体或特定蛋白质消化方法,并且同位素标记的变体及方法可视蛋白质而变化。
本发明可进一步包括蛋白质纯化步骤。考虑本领域已知的蛋白质纯化方法可用于本发明并可被利用。蛋白质纯化步骤可在蛋白质消化之前进行,在一些实施方案中,可能期需在混合样品之前进行蛋白质纯化步骤。在其它实施方案中,可能期需在混合样品之后但在蛋白质消化之前进行蛋白质纯化步骤。
在一些实施方案中,可能需要在蛋白质消化之前使混合样品变性、还原和/或烷基化。可通过本领域已知的方法来实施变性、还原和烷基化步骤。例如,可使用透析、脱机(off-line)固相萃取(SPE)、在线SPE或液相色谱(LC)例如尺寸排阻色谱-高效液相色谱(SEC-HPLC)或反相-高效液相色谱(RP-HPLC))来实施变性步骤。在在线SPE或LC方法中,可控制流速,可监测紫外(UV)信号,并且可定时进行流分收集以仅收集经纯化的蛋白质而非任何残余缓冲液或来自生长过程或样品处理的其它污染物。
图 1提供示意性SITRS分析。图 3 和 5显示来自对两种混合样品的SITRS分析的质谱,这些混合样品包括未标记的MAb及其相应的SITRS标准品(无修饰或突变)。由此可见,以1:1比率混合SITRS标准品和未标记的MAb,对其进行蛋白质(胰蛋白酶)消化,然后进行自下而上LC-MS。所得到的未标记的样品与SITRS标准品所共有的肽质谱的独特之处在于质荷比(m/z)峰表现为双峰,这是由于SITRS标准品中存在标记的氨基酸。因此,化学组成与其SITRS对应物相同且以与其SITRS对应物相同的量存在的肽,将具有等于标准品的强度(在1:1混合物中)的强度(见例如图 3)。
其群体部分地由点突变型或位点特异性修饰分子例如脱酰胺化、N-末端焦谷氨酸化(N-terminal
pyroglutamate)或差异糖基化构成的肽将具有如下质谱:其中与SITRS标准品相比,来自未标记样品的峰强度降低了反映化学上不同的肽的丰度的量,其可如图5中所见。因此,通过将SITRS标准品与未标记的蛋白质制品混合并对混合样品进行蛋白质消化及自下而上LC-MS,可鉴别及定量未标记的蛋白质制品中的突变、修饰和/或位点特异性修饰分子的存在。
可利用上述策略比较来自不同细胞系的抗体制品。例如,可采用本发明的方法,来定性鉴别实验性生长培养基中生长或由实验性克隆/细胞系产生的未标记抗体中的突变和/或修饰的存在情况。在本实施方案中,将包括至少一个同位素标记氨基酸的标准样品(“SITRS标准品”)与由实验细胞系产生的未标记的抗体混合。然后可对混合样品进行蛋白质消化及自下而上LC-MS,以确定实验细胞系是否可接受用于产生所需抗体。
类似于上述实施方案,若未标记的抗体和SITRS标准品的差异仅在于SITRS标准品中存在标记的氨基酸,则两种样品将一起迁移通过MS,并且质谱中的唯一显著差异将以双峰形式出现,这表明SITRS标准品中存在标记的氨基酸。
若未观察到双峰,则单峰可能对应因以下可能性之一而产生的肽:(1)该肽不含标记的氨基酸;(2)该肽含有修饰;(3)该肽含有突变、***或缺失;(4)该肽对应于杂质,且不含在抗体样品中存在的氨基酸序列。然后可通过MS/MS分析单峰以揭示肽的序列,并确定存在这四种可能性中的哪一种。例如,图 7显示存在突变型肽,其不具有姐妹双峰(sister doublet)。因此,可通过将SITRS标准品与未标记的抗体混合,并对混合样品进行蛋白质消化及自下而上LC-MS,来鉴别未标记的抗体中的突变、修饰和/或位点特异性修饰分子的存在情况。然后为了选择最佳克隆,可利用上述相同策略来比较由不同细胞系所制备的若干未标记的MAb。
在本发明的另一方面,标记的SITRS标准品使能够通过质谱法来定量蛋白质,其经由比较各双峰中各标记的SITRS标准肽的m/z峰强度与其未标记样品的相应未标记肽的m/z峰强度。这进而使得可比较几乎涵盖整个蛋白质序列的所有肽。然后可利用上述策略对若干未标记的蛋白质进行相互比较。
在本发明的这一方面,制备未标记的蛋白质。另外,获得对应于未标记的MAb的SITRS标准品。未标记的蛋白质和SITRS标准品应基本上相同,并且若混合则应在MS中显示1:1双峰,例如在图 1中所见。为定量未标记的蛋白质中任何突变或修饰的存在,将相应的SITRS标准品与未标记的样品混合。然后可对相应的SITRS标准品与未标记的样品的混合物进行蛋白质消化和自下而上LC-MS。然后可分析所得波谱以确定双峰的强度是否相同。
另外,为验证未标记的MAb与SITRS标准品除了SITRS标准品中的同位素标记变体以外都相同,可将未标记的MAb与SITRS标准品混合在一起,对其进行蛋白质消化并进行自下而上LC-MS。所得质谱图案应产生如图 1中所见的基本上1:1的峰。然而,其群体部分地由点突变型或位点特异性修饰分子(例如脱酰胺化、N-末端焦谷氨酸化或差异糖基化)构成的肽将具有如下质谱:其中与SITRS标准品相比,来自未标记的标准样品的峰强度降低了反映化学上不同的肽的丰度的量(图 1)。
当相互比较两种未标记的蛋白质样品时,例如比较未标记的样品A与未标记的样品B时,可能需要进一步使可能由移液误差及MS检测引起的变化减至最少。为了使这些变化减至最少,如公式1中所示,可将未标记的样品A与SITRS标准品的比率与未标记的样品B与SITRS标准品的比率进行比较。所得值称为SITRS值(SV)。
在公式1中,IA为未标记的样品A的峰强度,ISITRS-A为与未标记的样品A混合的SITRS标准品的峰强度,IB为未标记的标准样品B的峰强度,ISITRS-B为与未标记的标准样品B混合的SITRS标准品的峰强度。通过乘以c将未标记的样品A与未标记的标准样品B的峰强度比率转换成预期信号百分比,其中c为通过获得公式2 [(IA/ISITRS-A)/(I
B/ISITRS-B)]的最相似比率的平均值而以实验方式测定的常数。两次运行之间的共有肽将具有相似比率,而具有差异的肽将具有不同比率。
或者,如公式3中所示,可将未标记的样品A与SITRS标准品的比率与未标记的样品B与SITRS标准品的比率进行比较:
在公式3中,A和B分别为样品A中的肽及样品B中相同肽的相对量。IA、IB、ISITRS-A及ISITRS-B分别为样品A、B、与样品A混合的SITRS标准品及与样品B混合的SITRS标准品中相同肽的m/z离子峰的强度。常数c为解释SITRS标准品可能不相等地添加至样品A及样品B中的标准化因子。具体而言,c为B/A值的修正平均值,其排除了通常不经历翻译后修饰的一组肽的B/A值的95%置信区间以外的离群值。因此,对于大多数所定量的肽,IA/ISITRS-A乘以c产生等于IB/ISITRS-B比率的结果。
因此,单一定量实验可涉及运行至少两次蛋白质消化,一次含有未标记的样品A (例如充分表征的参考抗体)及SITRS标准品,另一次含有未标记的样品B (例如目的抗体样品)加SITRS标准品。
以下实施例阐述本发明的例示性实施方案。本领域技术人员通过考虑如本文所公开的本发明说明书或实践,将明了本文权利要求书范围内的其它实施方案。意欲将本说明书以及实施例视为仅例示性的,且本发明的范围和精神由实施例后的权利要求书来表明。
实施例
除非另外指出,否则在本发明实施例中利用以下材料及设备。然而,本文所述方法并不限于仅利用这些材料和/或设备的方法:
用于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养基的材料和氨基酸包括:
• 撤除Lys/Arg的培养基(Lys/Arg dropout media),可自Invitrogen,Carlsbad,California获得;
• L-精氨酸(Arg-6)单盐酸盐,可自Cambridge Isotope Laboratries, Andover, MA获得,目录号CLM-2265-0.25(MW 216.62);
• L-赖氨酸(Lys-6)二盐酸盐,可自Cambridge Isotope Laboratries获得,目录号CLM-2247-0.25(MW 225.07);
• L-精氨酸单盐酸盐,可自Sigma,
Milwaukee, WI获得,目录号A5131-1G(MW 210.66);和
• L-赖氨酸单盐酸盐,可自Sigma,
Milwaukee, WI获得,目录号L5626-1G(MW 182.65);
• Milli-Q水或等同物。
用于蛋白质A纯化的材料包括:
• rProtein A Sepharose Fast Flow,可自GE Healthcare,Wauwatosa,WI获得,目录号17-1279-03;
• 1 M tris缓冲盐水(Tris),pH 8.5;
• 1×磷酸盐缓冲盐水(PBS),pH 7.4;
• 乙酸;
• 氯化钠;
• Poly-Prep色谱柱;可自Bio-Rad, Hercules, CA获得,目录号731-1550;
• 真空歧管;
• UV-Vis分光光度计,型号:Cary 50;可自Varian, Palo
Alto, CA获得;和
• Microcon YM-30,可自Millipore, Billerica, MA获得,目录号42410。
用于肽作图分析中的胰蛋白酶消化的材料包括:
• 碘乙酸(IAA),可自Sigma获得;目录号14386-10G;
• 二硫苏糖醇(DTT),可自Sigma获得;目录号D-9163;
• 胰蛋白酶,可自Worthington,
Lakewood, NJ获得,目录号TRSEQZ,4.61
u/mgP;
• 1 M Tris-HCl,pH 8.0;
• 1 M Tris-HCl,pH 7.5;
• 盐酸胍(Gua-HCl),可自Calbiochem,
Gibbstown, NJ获得;目录号369075;
• 5 N盐酸(HCl);JT Baker, Phillipsburg, NJ;目录号5618-02;和
• 0.22 μm (CA)一次性无菌过滤装置,可自Corning Life
Sciences获得;目录号430015。
用于凝胶过滤以去除变性剂和其它杂质的SEC-HPLC***:
• Agilent 1200四元HPLC***,可自Agilent Technolgies, Santa Clara,CA获得;
• Agilent贮存盘(reservoir tray),可自Agilent获得;
• Agilent G1311A四元泵,可自Agilent获得;
• Agilent G1322A脱气器(线内),可自Agilent获得;
• Agilent G1367B HiP-ALS高效自动取样器,可自Agilent获得;
• 带有温度控制的Agilent
G1316A TCC柱隔室,可自Agilent获得;
• Tosoh TSK-Gel SW3000XL保护柱,6.0 mm ID×40 mm L,7 μm颗粒,可自Tosoh,Tokyo,Japan获得,目录号08543;
• Agilent G1364C分析性流分收集器,可自Agilent获得;
• 用于流分收集器的Agilent
G1330B温度控制器,可自Agilent获得;
• Agilent G1365D MWD(UV-VIS检测仪),可自Agilent获得;和
• 带有计算机的Agilent
Chemstation数据获取***,可自Agilent获得。
用于通过RP-HPLC和MS检测进行肽作图的材料包括:
• 三氟乙酸(TFA);可自JT Baker获得;目录号9470-00;
• 甲酸(FA);可自EMD Chemicals获得;目录号FX0440-5;和
• 乙腈(ACN),HPLC级,可自Honeywell
Burdick and Jackson, Morris Township, NJ获得,目录号AH015-4。
用于通过RP-HPLC和MS检测进行肽作图的LC-MS***:
• Agilent贮存盘,可自Agilent获得;
• Agilent G1376A毛细管二元泵,可自Agilent获得;
• Agilent G1379B微真空脱气器(线内),可自Agilent获得;
• Agilent G1377A Micro WPS自动取样器,可自Agilent获得;
• Agilent G1330B FC/ALS Therm自动取样器恒温器,可自Agilent获得;
• 带有温度控制的Agilent
G1316B TCC SL柱隔室,可自Agilent获得;
• Agilent G6510A-6510 Q-TOF LC/MS***,可自Agilent获得;
• Higgins Analytical Proto 200 C18,5 μm,250×1.0 mm,目录号RS-2501-D185,可自Higgins
Analytical, Mountain View获得,序列号157337;
• 带有计算机的Agilent
MassHunter数据获取***,可自Agilent获得;
• Agilent MassHunter工作站软件定性分析;B.03.00版;其带有Bioconfirm,可自Agilent获得;和
• Microsoft Excel 2003软件;可自Microsoft获得。
实施例1
在本实施例中,在缺乏精氨酸和赖氨酸氨基酸的化学成分明确的培养基中产生未标记的及标记的单克隆抗体(MAb)。接着给该培养基补充未标记的或标记的L-精氨酸(Arg)和L-赖氨酸(Lys),分别至3.97 mM及5.95 mM。使用本领域已知的标准方法产生抗体的未标记及标记形式,然后储存于-80℃下直至需要。
标记的
MAb-1 (SITRS)
和未标记的
MAb-1
的蛋白
A
纯化:
柱装填
使用rProtein A Sepharose Fast Flow来纯化MAb-1 (标记的和未标记的)。通过剧烈振荡使树脂再悬浮。将Sepharose (1.65 mL,约1.2
mL树脂)转移至含有10 mL
1×PBS的Bio-Rad
Poly Prep柱中(给柱底部加盖)。
让树脂沉降至底部。然后打开盖子让缓冲液流过,但在恰好到达树脂床前停止。
蛋白
A
纯化
通过使20 mL的1×PBS (约2柱体积)以约3-5 mL/分钟的速率穿过来使树脂平衡。将样品(10 mL,约10
mg)以约1 mL/分钟的速率施加于柱上。处理10 mg标记的MAb-1和10 mg未标记的MAb-1。
然后用4×10 mL (约2柱体积)的1×PBS以约3-5 mL/分钟的速率清洗柱,用5 mL 0.1 M乙酸、0.15 M氯化钠(pH 3.5)通过重力流动来洗脱样品。
样品重构
用洗出液的10×稀释液测量所洗脱的MAb-1的A280。具体而言,通过添加180 μL的10 mM Tris (pH
8.0)缓冲液将20 μL蛋白质稀释至200 μL。MAb-1的消光系数为1.43 mL/mg*AU。
用0.5 mL 1 M Tris (pH 8.5)中和所洗脱的MAb-1(5
mL),这使pH值达到7-8范围,并且提高样品中Tris的最终浓度至100 mM。
使用Microcon YM-30离心过滤器进一步浓缩经纯化的MAb-1。因为该过滤器的容量为0.5 mL,所以分两个阶段进行浓缩。在10,000
g下离心样品10-15分钟以使体积减少至约0.25
mL (4×浓缩)。对于未标记的MAb-1,最终样品浓度为6.07 mg/mL,而标记的MAb-1为5.63 mg/mL。然后将样品冷冻于-80℃下。
用于
SITRS
实验的样品制备:
按照以下程序制备样品:
• 用Milli-Q水将未标记的MAb-1、MAb-2 (MAb-1的双重点突变型)、来源于HEK的MAb-1和标记的MAb-1样品稀释至4 mg/mL。
• 将MAb-1 (4 mg/mL)与其双重点突变型MAb-2 (4 mg/mL)混合,得到掺加20%、10%、5%、2.5%、1.25%和0.625% MAb-2突变型的MAb-1样品。
• 将MAb-1和掺加突变型的MAb-1样品(25 μL,4 mg/mL)与25 μL 4 mg/mL标记的MAb-1混合。
• 将MAb-1 (来源于HEK,25 μL,4 mg/mL)与25 μL 4 mg/mL标记的MAb-1混合。
样品的变性、还原和烷基化
将各掺加SITRS的样品(25 μL)添加至75 μL 8 M盐酸胍(0.1
M Tris,pH 8.0)中。在室温下孵育样品15分钟。
通过向各样品中添加1 μL 1 M DTT,接着在37℃下孵育30分钟来进行还原。
通过添加5 μL 0.5 M IAA,然后在37℃下在箔覆盖下孵育30分钟来使样品烷基化。孵育后,通过向各样品中添加1.5 μL 1 M
DTT来使过量IAA失活。
使用
SEC-HPLC
对变性、还原和烷基化的样品进行凝胶过滤
对于SEC-HPLC使用以下条件及材料:
• 柱:Tosoh
TSKgel SW3000XL保护柱,6.0 mm ID×40 mm L,7 μm颗粒
• 流动相A:10 mM Tris,pH
7.5
• 梯度:等度
• 流速:0.25
mL/分钟,恒定
• 自动取样器和FC冷却器温度:4℃
• 柱烘箱温度:环境温度
• 波长:280
nm
• 总运行时间:6分钟
• 注射体积:100 μL (约100 μg)
• 流分收集:在室温下基于时间收集一种在2分钟与3分钟之间的流分。
通过
SEC-HPLC
进行凝胶过滤
将100 μL各样品注入SEC-HPLC中,其间进行洗涤步骤。图8中显示典型色谱图。通过流分收集回收250 μL经纯化的样品;因此,假定在纯化期间未发生样品损失,其最终浓度将为约0.4
mg/mL。
在每次样品运行之间,通过注射100 μL洗涤液(含6 M Gua-HCL的75 mM Tris (pH 8.0))进行柱洗涤。除了流速为0.4
mL/分钟持续6分钟和不收集流分外,柱洗涤方法与上述相同。
胰蛋白酶消化
将8 μL
0.25 mg/mL胰蛋白酶(重悬浮于1 mM
HCl中)添加至200 μL (80 μg)经SEC-HPLC纯化的样品中(酶与样品重量比为1:40)。然后在37℃孵育混合物30分钟。孵育后,通过添加4 μL 1 M HCl至20 mM的终浓度来终止反应。将20 μL (或约8 μg)样品加载于HPLC上进行MS分析。
经胰蛋白酶消化的抗体的
LC-MS
分析
对于LC-MS使用以下条件及材料:
• 柱:Higgins
Analytical Proto 200 C18 RP柱(5 μm,200 Å,1×250 mm)
• 流动相A:0.02% TFA、0.08%甲酸/水
• 流动相B:0.02% TFA、0.08%甲酸/ACN
• 梯度:二元
• 流速:50 μL/分钟,恒定
• 初始条件:2% B
• 自动取样器冷却器温度:4℃
• 柱烘箱温度:60℃
• 总运行时间:120分钟
• 注射体积:20 μL (8 μg样品)
• 二元梯度程序:
该方法在最初四分钟将洗脱液转移至废液中,然后将其导入质谱仪中。在运行期间不收集MS/MS信息以改良结果的定量。
对各双峰的峰强度进行定量测定,其对应于涵盖几乎整个抗体序列的肽的组合序列。如图 10 、 11 、 12 和 13中所示,数据以“SITRS柱状图”的形式呈现。
由以上实施例可看出,使用SITRS使能够利用MS产生的数据用于蛋白质样品的定性和定量比较两者。
以上实施例利用先前所论述的通过SEC-HPLC凝胶过滤来去除变性剂及其它杂质。图 8中可看出,监测洗脱液,最终结果为经纯化和与用传统去盐技术所获得相比更稀的抗体样品。另外,从样品中几乎完全消除胍盐使得胰蛋白酶消化时间明显缩短,因此可使因长时间孵育而引入的样品处理假象减至最少。
将MAb-1注射于SEC-HPLC柱上三次以去除胍及其它污染物。在整个运行中监测280 nm下的吸光度。图 8中的箭头指示样品收集的开始和结束。从胍和其它污染物中基线分离抗体。
在去除胍和其它污染物后,在等摩尔量的SITRS标准品存在下消化MAb-1样品,产生特征为具有适当信号强度的预期双峰的肽质谱。图 2显示来自以等摩尔比率与SITRS标准品混合的MAb-1的胰蛋白酶消化物的峰的典型质谱。除预期的899.9418 m/z峰(对应于LC的肽127-142的[M+2H]+2峰)加上来自未标记肽的天然存在的含13C肽的单同位素峰外,还存在另一组来自SITRS的峰。MAb-1:SITRS的峰强度的预期比率为1。通过计算所有相关峰的峰高度的总和来进行实验性比率测量,值为0.811。计算色谱图中来自轻链的11个峰的比率产生0.823±0.014的平均比率。此数值在所检验的所有42个肽中一致,其标准偏差为2%。不受理论束缚,认为与预期比率1的偏离很可能归因于***因素,例如初始蛋白质浓度的移液误差。
图 3显示来自以等摩尔比率与SITRS标准品混合的MAb-1的胰蛋白酶消化物的峰的另一典型质谱。除重链的肽255-273的预期m/z 1070.5085 [M+2H]2+加上来自未标记肽的天然存在的含13C肽的单同位素峰外,还有另一组SITRS的峰(1073.5184
[M+2H]2+的m/z加上天然存在的含13C肽的单同位素峰)。MAb-1:SITRS的峰强度的预期比率为1 (若样品以1:1比率混合且不发生对该特定肽的修饰)。通过计算所有相关峰的峰高度的总和进行实验比率测量,值为1.07 (图 4)。掺加20%突变型的MAb-1中的相同肽HC (255-273)获得相同比率。此数值在所检验的大多数肽中一致。然而,当检验肽HC
(218-247) (835.15的m/z)时,对应于掺加20%突变型的MAb-1中的未标记肽的峰强度的相对丰度(相对于SITRS标准品中相同序列的标记肽)降低(图 5)。已定量测定峰强度比率的明显改变且呈现于图 6中。通过计算野生型MAb样品(0%突变型)中所有相关峰的峰高度的总和进行实验性比率测量,值为1.11,而掺加20%突变型的MAb-1的相同测量值为0.87。来自掺加20%突变型的MAb-1的未标记肽HC
(218-247)的相对强度的这种降低与MAb-1的突变型(MAb-2样品)中该经修饰的肽一致。
除上述SITRS实验获得的定量数据外,亦可获得关于样品的定性信息。图 7显示一组无双峰的单同位素峰。该峰对应于MAb-2 (MAb-1的双重点突变型)的肽HC (218-247),其在野生型MAb-1中不存在。
实施例
2
来自SITRS标准品的m/z峰的存在使得能够定量测定给定肽的丰度差异。本实施例详述定量测定MAb-1样品被除MAb-1以外的抗体(例如具有不完全匹配MAb-1序列的氨基酸序列的MAb-2抗体)污染的程度。
在一项实验中,给MAb-1样品掺加MAb-2至10%的终浓度(90% MAb-1+10%
MAb-2)。本实验意欲模拟含有不同量的带有点突变的抗体的样品,这种似乎可能的情况可能偶然发生或在制造期间经由天然生物过程发生。因为高度同源,通过胰蛋白酶消化所产生的大多数肽为两种抗体所共有,预期产生100%的STIRS值(SV)。选择6种这样的肽用于研究。然而,有少数相差1个或更多个氨基酸的肽,且预期其具有90%的SV。图 9显示来自一种这样的“突变型”肽的两个质谱。第一波谱来自与SITRS混合的未标记的抗体标准品(未添加污染MAb-2) (图 9A),而第二波谱来自与SITRS混合的含有10% MAb-2的受到污染的未标记样品(图 9B)。对于此含有突变的肽所观察到的SV为约93.3%。更广泛而言,在MAb-1与MAb-2之间不同的肽具有93%的平均SV,而共有肽具有约100%的预期值(图 10)。未解释该差异,但不受理论束缚,可通过移液或浓度的误差来解释。因此,SITRS方法成功地用于鉴别在10%总蛋白质水平的分子中的点突变。
图 11和表 1显示使用来源于CHO和来源于293细胞系的材料进行的SITRS实验的数据。与来自CHO的MAb-1相比,来源于293的材料在重链中具有少20%的脱半乳糖基化(agalactosylated)糖形(NGA2F)的糖基化。此外,该两个批次亦在重链上的C末端赖氨酸的量以及N末端焦谷氨酸形成的量方面不同。在SITRS实验中,含有这些修饰的肽因其SV的显著差异(图 11中标有星号的柱)而显而易见。此外,预计未显示丰度水平差异的肽(亦即所有共有肽)在其SITRS比率方面相似,其中未经修饰的肽的平均标准偏差为1.4% (范围为0.22-6.31%)。
表 1 通过SITRS与标准方法所鉴别的修饰的比较
因此,可以看出,设计了一种新颖方法,其使用带稳定同位素标签的蛋白质作为内参标准来定量各批次指定蛋白质之间的差异。可通过使用补充有标记的氨基酸的缺乏赖氨酸和精氨酸的化学成分明确的培养基在细胞培养物中产生MAb-1,来实现将赖氨酸-6和精氨酸-6均匀掺入MAb-1中。通过质谱法比较未标记的MAb-1与其SITRS标准品对应物,证明由此方法产生的数据一致,且标准偏差为2%。将该方法应用于由HEK 293细胞系产生的MAb-1,正确鉴别出含有修饰水平差异(例如N末端焦谷氨酸、C末端赖氨酸及NGA2F水平)的肽。此外,该方法成功地用于鉴别约10%水平的在MAb-2与MAb-1之间含有1个氨基酸差异的肽。
实施例
3
在另一项实验中,给MAb-1样品掺加含有2个点突变的突变型MAb-1 (MAb-2)。具体而言,一个突变存在于肽HC
(218-247)中,另一个存在于HC (344-349)中。添加该突变型至终浓度为20% (90% MAb-1+20%突变型MAb-1,图 12)至2%
(98% MAb-1、2%突变型MAb-1,图 13)范围内。图 12 和 13显示野生型与突变型MAb-1二者所共有的肽具有大约100%的预期值。两种突变型肽具有约80% (图 12)或98% (图 13)的预期值。糖肽HC
(G0F-288-300)及HC (439-446)亦在两种样品之间不同。这是所预期的,因为已知两种样品中的糖肽和C末端肽分别在其寡糖组成和C末端赖氨酸含量方面不同。图 14显示向野生型MAb中掺加各种量的突变型MAb-1的野生型肽HC (218-247)、HC (344-349)及HC
(G0F-288-300)的水平差异百分比,其如通过SITRS所测量。该方法对所存在的突变型的量具有线性反应,并具有2.4%的方法检出限。
实施例
4
为进一步测试SITRS方法在样品之间进行区别的能力,通过在HEK细胞系中产生MAb-1来模仿制造方法的改变。来源于CHO和HEK的mAb的SITRS分析分别示于图 15A和图 15B中。由该分析可明显区分三种肽。首先,含有N末端焦谷氨酸残基的HC (1-39)在HEK样品中更丰富,多7.1%。与此结果一致,含有N末端未环化谷氨酰胺残基的HC (1-39)在来源于CHO的mAb中更丰富,多74%。第二差异位点位于C末端重链肽HC
(439-446)中。这归因于Lys446的蛋白水解加工(mAb中常见的翻译后事件)的差异较小。第三显著的差异为各种糖肽的相对丰度。
为验证这些差异,用PNGase F使MAb去糖基化,并在用2-氨基苯甲酸标记后通过HPLC定量测定寡糖。通过SITRS方法与酶促消化所测定的寡糖含量的差异概括于图 16中。图 16中亦包括SITRS与无标记MS分析之间的N末端谷氨酰胺转化和C末端赖氨酸去除的程度比较,其如通过经由来自Agilent的带Bioconfirm软件包的MassHunter比较去电荷及去同位素峰的强度所测定。这两种正交方法的结果合理地充分一致,尤其对于丰富的肽而言。
相比之下,由相同制造方法在CHO细胞中产生的两批mAb显示非常相似(图 15A)。在肽HC (1-39)中观察到N末端焦谷氨酸的量差异小于3%。类似地,HC (392-445)中的相对差异仅为3.3%。不同于HEK细胞中所产生的批次,两个来源于CHO的批次亦显示相当的糖基化模式,此结果得到寡糖分布分析(profiling)的支持。
实施例
5
SITRS方法亦成功地用于评估压力对抗体的影响。对来源于在4℃下在两种不同缓冲液中储存6个月或12个月的mAb的肽进行比较,似乎揭示两种样品之间仅存在较小差异(图 17)。然而,可定量这种较小差异。例如,在12个月样品的HC (1-39)中的焦谷氨酸量增加6.2%。该结果与6个月样品中含有N末端Gln的HC (1-39)损失至26.8%相关。另外,HC (370-391)降低4.7%。这种降低可归因于脱酰胺作用增加,因为脱酰胺的肽在12个月的样品中的丰度大231%。在12个月的样品中观察到部分消化的肽HC (60-72) (图 17)的丰度比在6个月样品中所观察到的丰度大911%。该结果与HC (60-65)、HC
(66-72)和HC (68-72)的同时发生的降低相关。
实施例
6
SITRS方法亦用于监测小分子、药物或蛋白质成像剂的生物缀合实验。例如,图 18显示来自SITRS实验的数据,其中金属螯合成像剂CHX-A"-DTPA与抗体的赖氨酸残基缀合。原则上,mAb中存在92个可能的反应位点。然而,SITRS实验揭示仅3个位点(标有箭头的肽)反应程度>20%。这些反应位点可通过以下事实得以区分,即相邻C末端肽的相对丰度亦降低与经修饰的N末端肽近似相等的量。该现象归因于与CHX-A"-DTPA缀合时失去了胰蛋白酶切割位点。
本说明书中所引用的所有参考文献,包括但不限于所有论文、出版物、专利、专利申请、报告书、教科书、报导、手稿、小册子、书籍、因特网告示、期刊文章和/或杂志,均以其整体通过引用并入本说明书中。本文中参考文献的论述仅意欲概括由其作者所作的主张,并非承认任何参考文献构成现有技术。申请者保留向所引用参考文献的准确性和相关性提出异议的权利。
本领域普通技术人员可在不脱离本发明精神和范围下,实施本发明的这些和其它修改及变化,所述本发明精神和范围更明确地陈述于所附权利要求书中。另外,应理解各种实施方案的方面可整体或部分互换。此外,本领域普通技术人员应了解,以上阐述仅为了举例说明,并非意欲限制在所述所附权利要求书中进一步阐述的本发明。因此,所附权利要求书的精神和范围不应限于其中所含形式的阐述。
Claims (24)
1. 表征蛋白质样品的方法,所述方法包括:
(i)提供具有已知氨基酸序列的第一蛋白质样品,其中所述第一蛋白质样品中至少一个氨基酸被同位素标记的氨基酸取代;
(ii)提供未标记的第二蛋白质样品,其包含对应于所述第一蛋白质中的同位素标记变体的未标记的氨基酸;
(iii)将所述第一样品与所述第二样品混合以形成混合物;
(iv)对所述混合物进行蛋白质消化以形成第一消化物;
(v)对所述第一消化物进行自下而上液相色谱-质谱以形成包括一个或多个双峰或单峰的第一波谱,各双峰表明存在来自所述第一样品的同位素标记的肽和来自所述第二样品的相应的未标记的肽,各单峰表明存在具有突变、修饰或杂质的肽,
藉此表征所述第二蛋白质样品。
2. 权利要求1的方法,其进一步包括步骤(vi):比较所述双峰中各峰的相对强度以测定各肽的相对量,其中1:1峰比率表明所述第一肽与所述第二肽基本上相同,且其中峰强度的差异反映存在化学上不同的肽。
3. 权利要求1或2的方法,其进一步包括基于峰强度的相对降低来定量所述化学上不同的肽的量的步骤。
4. 前述权利要求中任一项的方法,其进一步包括步骤(vii):对所述消化物进行串联质谱以测定由波谱中单峰所代表的肽的序列。
5. 前述权利要求中任一项的方法,其中在所述第一蛋白质中基本上所有等同的氨基酸都经同位素标记。
6. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述同位素标记的氨基酸包含至少一个重同位素。
7. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述蛋白质消化和所述同位素标记的氨基酸选自:
(a)胰蛋白酶消化和一个或多个重精氨酸、重赖氨酸及其组合;
(b)内切蛋白酶GluC消化和重谷氨酸;
(c)肠激酶轻链消化和所述同位素标记变体选自一种或多种重天冬氨酸、重赖氨酸及其组合;
(d)因子Xa消化和一个或多个重异亮氨酸、重谷氨酸、重天冬氨酸、重甘氨酸、重精氨酸及其组合;
(e)弗林蛋白酶消化和重精氨酸;
(f)麦芽糖酶I消化和一个或多个重组氨酸、重酪氨酸及其组合;
(g)胰凝乳蛋白酶消化和重芳香族氨基酸;
(h) Lys-C或Lys-N消化和重赖氨酸;和
(i)内切蛋白酶ArgC消化和重精氨酸。
8. 前述权利要求中任一项的方法,其进一步包括在蛋白质消化之前纯化所述标记的蛋白质和所述未标记的蛋白质的步骤。
9. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述蛋白质选自:重组蛋白质、生物治疗蛋白质、抗体、单克隆抗体、抗体药物缀合物、成像抗体、融合蛋白和聚乙二醇化蛋白质。
10. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述蛋白质为抗体。
11. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述消化物包含肽群,其具有代表所述蛋白质的完整氨基酸序列的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多的组合序列。
12. 权利要求11的方法,其中所述组合序列包含所述蛋白质的完整氨基酸序列。
13. 前述权利要求中任一项的方法,其进一步包括以下步骤:
(i)提供未标记的第三蛋白质样品,其包含对应于所述第一蛋白质中的所述同位素标记变体的未标记的氨基酸;
(ii)将所述第一样品与所述第三样品混合以形成第二混合物;
(iii)对所述第二混合物进行第二蛋白质消化以形成第二消化物;和
(iv)对所述第二消化物进行自下而上液相色谱-质谱以形成包括一个或多个双峰或单峰的第二波谱,各双峰表明存在来自所述第一样品的同位素标记的肽和来自所述第三样品的相应的未标记的肽,且各单峰表明存在具有突变、修饰或杂质的肽,
藉此表征所述第三蛋白质样品。
14. 权利要求13的方法,其进一步包括步骤(v):比较来自所述第二消化物的波谱中所述双峰的相对强度以测定各肽的相对量。
15. 权利要求13或14的方法,其进一步包括比较所述第一消化物和所述第二消化物的结果,以测定所述第二蛋白质样品与所述第三蛋白质样品之间的任何差异。
16. 权利要求13-15中任一项的方法,其中所述比较包括将来自所述第一消化物的波谱的峰信号比率与来自所述第二消化物的波谱的相应峰信号比率进行比较。
17. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一蛋白质样品为创新生物制品,而所述第二蛋白质样品为所述创新生物制品的生物相似制品。
18. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一蛋白质样品为未缀合的蛋白质,而所述第二蛋白质样品为缀合蛋白质。
19. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一蛋白质样品和所述第二蛋白质样品在不同细胞系、不同细胞类型或不同制造方法中产生。
20. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一蛋白质样品和所述第二蛋白质样品已在不同储存条件下储存。
21. 前述权利要求中任一项的方法,其中采用所述方法来检测所述第二蛋白质样品中的突变、修饰或杂质。
22. 权利要求21的方法,其中所述突变、修饰或杂质选自:寡糖含量改变、N-末端谷氨酰胺转化、C-末端赖氨酸去除、焦谷氨酸含量改变和脱酰胺作用或氧化作用增加。
23. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一样品和所述第二样品为基本上均质的蛋白质制品。
24. 前述权利要求中任一项的方法,其中所述第一样品和所述第二样品为药物组合物。
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