FI119190B

FI119190B - Modifioitu beta-laktamaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi

Info

Publication number: FI119190B
Application number: FI20065431A
Authority: FI
Inventors: Pertti Koski; Nina Wickstrand; Susanna Kaeaeriaeinen
Original assignee: Ipsat Therapies Oy
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2006-06-21
Publication date: 2008-08-29
Also published as: EP2038411A1; WO2007147945A8; JP2009540814A; BRPI0713726A2; ZA200810460B; EP2038411B1; ES2452321T3; JP5306191B2; RU2009101795A; AU2007262916A1; FI20065431A; BRPI0713726B1; NO342006B1; NZ573696A; US7989192B2; WO2007147945A1; CA2659691A1; CA2659691C; FI20065431A0; CN101484577A

Description

119190 .....

Modifioitu beta-laktamaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi Keksinnön ala

Bakteeri-infektioiden hoidossa käytetään useita erilaisia antibiootteja. Antibiootit eivät kuitenkaan käy ainoastaan patogeenien kimppuun vaan 5 ne vaikuttavat myös normaaliin bakteeriflooraan, mikä johtaa haitallisiin sivuvaikutuksiin esimerkiksi potilaan suolistossa. Näitä sivuvaikutuksia voidaan vähentää antamalla entsyymejä, jotka kykenevät hajottamaan suolistossa jäljellä olevaa antibioottia. Esillä oleva keksintö koskee modifioituja metallo-beta-lak-tamaaseja, jotka ovat käyttökelpoisia beta-laktaamirenkaan sisältävien anti-10 bioottien haitallisia vaikutuksia hoidettaessa ja ehkäistäessä tai tällaisia entsyymejä valmistettaessa. Keksintö kohdistuu myös menetelmään modifioitujen beta-laktamaasien valmistamiseksi sekä tässä käyttökelpoisiin nukleotidimole-kyyleihin, vektoreihin ja isäntäsoluihin.

Keksinnön tausta 15 Beta-laktamaasientsyymit ovat bakteereilla tärkein resistenssime- kanismi beta-laktaamiantibiootteja vastaan, joita ovat penisilliinit, kefalosporiinit ja karbapeneemit. Nämä entsyymit katalysoivat beta-laktaamirenkaan amidi-sidoksen palautumatonta hydrolyysiä, mistä muodostuu tehottomia antimikro-biaalisia aineita. Beta-laktamaasit voidaan molekyylien rakenneluokituksen ja 20 katalyyttisten mekanismien perusteella jakaa neljään ryhmään: A, B, C ja D.

•« • V Ryhmät A, C ja D ovat seriinientsyymejä ja ne muodostavat pääosan beta-lak- t’l· tamaaseista (Ambler, 1980). Nämä entsyymit inaktivoivat yleensä penisilliinejä • ;*: tai kefalosporiineja ja niiden toiminta kohdistuu usein ensisijaisesti toiseen ··* · . näistä kahdesta antibiootista.

• · · 25 Ryhmän B beta-laktamaasit ovat metalloentsyymejä, jotka vaativat • m entsyymiaktiivisuuden kofaktoriksi yhden tai kaksi sinkki-ionia. Metallo-beta- .. laktamaasit muodostavat ryhmän 3 Bushin, Jacobyn ja Madeiros'in toiminnalli- • · · sessa luokittelussa (Bush, 1998). Tämä jaottelumalli perustuu pääasiassa sub- • · '”·* straattiprofiileihin, kyseisten entsyymien EDTA-herkkyyteen ja kyseisten ent- : 30 syymien vastustuskykyyn seriini-beta-laktamaasin inhibiittoreita kohtaan. Me- • · · tallo-beta-laktamaasit voidaan jakaa kolmeen alaryhmään B1, B2 ja B3, perus- φ · · *. tuen sinkin sitoutumista koordinoivan alueen rakenteellisiin samankaltaisuuk- • · · siin (Galleni et ai., 2001). Alaryhmässä B1 on kolme histidiiniä ja yksi kysteiini tärkeimpinä sinkkiä koordinoivina tähteinä. Kristallografiset rakenteet on kuvat-35 tu monille alaryhmän B1 entsyymeille, kuten Bacillus cereuksen Bell:Ile (Carfi 119190 2 et ai, 1998), Bacteroides fragiliksen CcrA:lle ja (Carfi et ai., 1998) ja Pseudomonas aeruginosan IMP-1 :lle (Concha et ai., 2000). Vastaavasti alaryhmän B2 laktamaaseilla on tärkeimmän sinkkiä sitovan motiivin NXHXD:n ensimmäisessä asemassa histidiinin tilalla arginiinitähde. Garau et ai. (2005) ovat jokin aika 5 sitten ratkaisseet B2-alaryhmän entsyymin (CphA) ensimmäisen kiderakenteen. Alaryhmä B3 sisältää rakenteeltaan multimeerisiä entsyymejä (Walsh et ai., 2005).

Metallo-beta-laktamaaseilla on laajakirjoinen substraattiprofiili, johon sisältyvät penisilliinit ja kefalosporiinit, ja ne ovat vastustuskykyisiä yleises- 10 ten tavanomaisten seriini-beta-laktamaasin inhibiittoreiden, kuten klavulaani-hapon, sulbaktaamin ja tatsobaktaamin, vaikutusta kohtaan. Lisäksi toisin kuin useimpien beta-laktamaasien suhteen on asianlaita, metallo-beta-laktamaasit kykenevät hydrolysoimaan karbapeneemejä, kuten meropeneemiä ja imipe-neemiä. Useiden bakteereiden tiedetään tuottavan metallo-beta-laktamaaseja.

15 Niitä ilmentyy yleisesti Enterobacteriae-suvun (Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freudii, Shigella flexneri mukaan lukien), Pseudomonas aeruginosan, Stenobacterium maltophilan, Acinetobacter-suvun, Bacteroides fragiliksen, Bacillus cereuksen, Flavobacteruim odoratumin ja Bacteroides fragiliksen (Walsh et ai., 2005) joukossa.

20 Beta-laktamaaseja voidaan käyttää farmaseuttisina proteiineina inaktivoimaan imeytymättömiä beta-laktaameja maha-suolikanavassa beta- • · .. . laktaamien indusoimien sellaisten haitallisten vaikutusten estämiseksi, joita

• » I

·* i ovat suolen normaalin mikrobiston muutokset ja beta-laktaamiresistenttien ;··; bakteereiden liikakasvu (WO 93/13 795, WO 2004/016 248). Jotta beta-lakta- :.J : 25 maasihoito olisi ohutsuolessa tehokasta, niin entsyymin on kestettävä suolen proteaasien vaikutusta sappihappojen mukana ollessa ja säilytettävä suuri ent-symaattinen aktiivisuus laajalla pH-alueella (5,5-7,5).

Kohteeseen annettavan entsyymihoidon on osoitettu olevan toteut- :*:*· tamiskelpoista koira- ja hiirimalleilla käyttämällä parenteraalisen ampisilliinilää- • · 30 kityksen aikana Bacillus licheniformiksen seriini-beta-laktamaasia (Harmoinen ” et ai., 2004, Mentula et ai., 2004, Stiefel et ai., 2003). Tämän entsyymin sub- • · · *;“* straattiprofiili rajoittaa kuitenkin olennaisella tavalla entsyymin käyttöä lääkeai- neena, koska entsyymin kyky hydrolysoida kefalosporiineja, karbapeneemejä ··· tai penisilliinejä beta-laktamaasin inhibiittoreiden mukana ollessa on heikko.

* ·« .·*·. 35 Tämän johdosta uusi beta-laktaamikirjoltaan laaja-alainen proteaaseja kestävä beta-laktamaasientsyymi on välttämätön beta-laktamaasihoidon käytön laajen- 3 119190 tamiseksi sellaisten sairaalassa hoidettavien potilaiden joukossa, joita lääkitään suonensisäisesti erilaisilla beta-laktaameilla.

Metallo-beta-laktamaasien tiedetään inaktivoivan erilaisia beta-lak-taamityyppejä ja ne ovat vastustuskykyisiä seriini-beta-laktamaasien inhibiitto-5 reita kohtaan. Bacillus cereus -kantojen tiedetään tuottavan B1 -ryhmään kuuluvaa metallo-beta-laktamaasia. Kliinisestä Bacillus cereus 98ME1552 -isolaa-tista yhdistelmämenetelmin valmistetun puolipuhdistetun metallo-beta-lakta-maasinäytteen osoitettiin eliminoivan potentiaalisten patogeenisten bakteerei-den liikakasvun hiirimallissa (Stiefel et ai., 2005). Esillä olevat keksijät havaitsi-10 vat kuitenkin, että tämä metallo-beta-laktamaasivalmiste sisälsi beta-laktamaa-sivarianttien seoksen, mikä heikentää valmisteen arvoa farmaseuttisena proteiinina, koska lääkeaineen vaihtelut pienentävät valmistusmenetelmän häiriön-sietokykyä, lisäävät valmistuseräkohtaisia vaihteluita ja vaikeuttavat kliinisiä kokeita, mikä vaikuttaa luonnollisesti kielteisesti valmisteen rekisteröintiin lääk-15 keeksi.

Esillä olevassa keksinnössä onkin saatu aikaan keino vähentää aminopäiden heterogeenisyyttä, jonka havaittiin liittyvän metallo-beta-lakta-maasin rekombinanttituotantoon. Keksinnössä on saatu lisäksi aikaan modifioituja metallo-beta-laktamaaseja, joita voidaan valmistaa olennaisesti puhtaassa 20 muodossa ja joita voidaan käyttää farmaseuttisten koostumusten valmistuk-sessa.

• · ·· · : Keksinnön yhteenveto

Keksinnössä on saatu aikaan modifioitu metallo-beta-laktamaasi- • · :.· · proteiini, jolla on yleinen kaava: f: NH2-K-T-E-ABL-COOH, (I) • · · jossa ♦ · · K on lysiini, • » ‘V 30 T on treoniini, E on glutamiinihappo ja '·[[[· ABL on metallo-beta-laktamaasiproteiini, joka on typistetty amino- päästä ennen mainitun proteiinin toista beta-juostetta.

Keksinnössä on lisäksi saatu aikaan eristetty nukleotidimolekyyli, **** 35 joka käsittää nukleotidisekvenssin, joka kykenee ilmentämään mainittua modi fioitua metallo-beta-laktamaasiproteiinia, sekä ekspressiovektori, joka sisältää 4 119190 nukleotidisekvenssin, ja isäntäsolu, joka kykenee ilmentämään vektorin koodaamaa metallo-beta-laktamaasiproteiinia.

Keksinnössä on myös saatu aikaan modifioitu metallo-beta-lakta-maasiproteiini, jolla on yleinen kaava: 5 NH2-E-ABL-COOH, (II) jossa E ja ABL ovat edellä määritellyt.

10 Keksinnössä on vielä lisäksi saatu aikaan menetelmä modifioidun metailo-beta-laktamaasiproteiinin valmistamiseksi, joka mainittu menetelmä käsittää sen, että mainittua isäntäsolua viljellään olosuhteissa, joissa kyetään ilmentämään metallo-beta-laktamaasia, jolla on yleinen kaava: 15 NHz-K-T-E-ABL-COOH, (I) jossa K on lysiini, T on treoniini, 20 E on glutamiinihappo ja t ABL on metallo-beta-laktamaasiproteiini, joka on typistetty amino- / päästä ennen mainitun proteiinin toista beta-juostetta, • · · ·’ ja suoritetaan translaation jälkeinen modifikaatio, josta on tulokse- na modifioitu metallo-beta-laktamaasi, jolla on yleinen kaava: • · • · · _ _ !»· ! 25 NH2-E-ABL-COOH, (II) ··· • * • · ··· jossa E ja ABL ovat edellä määritellyt, ja ;v. valinnaisesti eristetään ja puhdistetaan saatu translaation jälkeen .···. 30 modifioitu proteiini.

• ·

Keksinnön lisäkohteina on saatu aikaan kaavan II mukaisen modi- m fioidun metallo-beta-laktamaasiproteiinin käsittävä farmaseuttinen koostumus, «i· lääkkeenä käytettäväksi tarkoitettu kaavan II mukainen modifioitu metallo-beta- laktamaasi sekä kaavan II mukaisen modifioidun metallo-beta-laktamaasin [···. 35 käyttö sellaisen lääkkeen valmistukseen, joka on tarkoitettu beta-laktaami- • · antibiootin suolistossa indusoimien haitallisten vaikutusten poistamiseen.

119190 5

Lopuksi keksinnössä on saatu aikaan menetelmä beta-laktaami-antibiootin suolistossa indusoimien haitallisten vaikutusten hoitamiseksi, joka menetelmä käsittää sen, että annetaan vaikuttava määrä kaavan II mukaista modifioitua metallo-beta-laktamaasia tai tätä sisältävää farmaseuttista koostu-5 musta tätä tarvitsevalle henkilölle.

Tämän keksinnön erityisiä suoritusmuotoja esitetään epäitsenäisissä vaatimuksissa.

Esillä olevan keksinnön muut tavoitteet, yksityiskohdat ja edut käyvät ilmi seuraavista piirroksista, yksityiskohtaisesta selityksestä ja esimerkeis-10 tä.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuvio 1 esittää B. cereus 98ME1552:n beta-laktamaasigeenin täydellistä nukleotidisekvenssiä ja johdettua aminohapposekvenssiä.

Kuvio 2 esittää pRSH315-ilmentämiskonstruktista peräisin olevan 15 B, cereus 98ME1552:n beta-laktamaasigeenin täydellistä nukleotidisekvenssiä ja johdettua aminohapposekvenssiä. Bacillus amylollquefaciensin 31 aminohappotähteen pituisen signaalisekvenssin pilkkoutumiskohdan ennustetaan esiintyvän kohdassa -1 olevan alaniinin ja kohdassa +1 olevan glutamiinin välissä. Hind III -kloonauskohdasta peräisin oleva NH2-pään NH2-QAS-tripep-20 tidijatke on esitetty lihavoituna.

Kuvio 3 esittää pRSH318-ilmentämiskonstruktista peräisin olevan ·· * : B. cereus 98ME1552:n beta-laktamaasigeenin täydellistä nukleotidisekvenssiä ja johdettua aminohapposekvenssiä. Bacillus amylollquefaciensin 31 amino-happotähteen pituisen signaalisekvenssin pilkkoutumiskohdan ennustetaan ; 25 esiintyvän kohdassa -1 olevan alaniinin ja kohdassa +1 olevan glutamiinin vä- * * .···. Iissä. Hind III -kloonauskohdasta peräisin oleva NH2-pään NH2-QAS-tripep- tidijatke ja KT-insertio on esitetty lihavoituina.

* · \v Keksinnön yksityiskohtainen selitys •

Metallo-beta-laktamaasivalmiste valmistettiin ensin Bacillus subtilis m : 30 -tuotantojärjestelmässä, joka sisälsi täydellistä metallo-beta-entsyymiä koo- • · · .**·. daavan täydellisen metallo-beta-laktamaasigeenin ilmentämiskonstruktin. Yksi- \ tyiskohtaisesta massaspektrometria-analyysistä kävi ilmi, että metalloentsyy- ··» ·;·· mivalmiste sisälsi useita entsyymivariantteja, joilla oli heterogeenisiä amino- pään sekvenssejä. Aminopään sekvenssien vaihteluiden arveltiin johtuvan 35 isäntäsolun proteaasien translaation jälkeisestä modifioitumisesta. Havaitut 6 119190 metalloentsyymin aminohapposekvenssin muutokset lisäävät Bacillus subtilis -tuotantojärjestelmällä valmistettavan entsyymin valmistuseräkohtaisia vaihteluita ja siten viranomaismääräysten kannalta katsottuna vähentävät sen käytettävyyttä farmaseuttisena proteiinina. Tästä syystä tutkittiin molekyylibiologista 5 keinoa metallo-beta-laktamaasientsyymin aminopään sekvenssin havaittujen vaihteluiden vähentämiseksi.

Aminopään alueen ei odoteta vaikuttavan olennaisesti entsyymin katalyyttisiin ominaisuuksiin. Lisäksi aminopään alueen havaittiin olevan herkkä proteaasien translaation jälkeisille modifikaatioille Bacillus subtilis -tuotanto-10 järjestelmässä, jossa yhdistelmäproteiini erittyy bakteerisolun ulkopuolelle. Tämän aminopään alueella esiintyvän mikroheterogeenisyyden vähentämiseksi tätä ennustettua aluetta koodaava nukleotidisekvenssi deletoitiin PCR-menetelmällä. Pelkkä deletointi ei kuitenkaan itsessään tuottanut aminopään heterogeenisyyden merkittävää vähentymistä. Yllättäen kuitenkin deletointi yh-15 distettynä sellaisen dipeptidin liittämiseen, joka oli suunniteltu edistämään translaation jälkeistä modifikaatiota, johti siihen, että muodostui yhtä ainoaa metallo-beta-laktamaasivarianttia, jonka aminopää oli modifioitunut yhtenäisellä tavalla.

Tämä keksintö koskee farmaseuttisena proteiinina käyttökelpoista 20 modifioitua beta-laktamaasia yleensä, ja myös yhdistelmä-beta-laktamaasiväli-t tuotetta, joka valmistetaan typistämällä ja liittämällä molekyylin aminopäähän ,* dipeptidi, mistä on tuloksena normaalia pienempiä määriä beta-laktamaasi- • · · : variantteja. Nämä modifikaatiot edistävät entsyymin valmistusta yhdistelmä- menetelmin homologisessa muodossa käytettäväksi lääkeaineena beta-lakta- • · : 25 maasihoidossa, joka on tarkoitettu sellaisten sivuvaikutusten poistoon, jotka !.:,i syntyvät käytettäessä beta-laktaameja (kefalosporiineja, karbapeneemejä ja penisilliinejä tunnettujen beta-laktamaasi-inhibiittorien, kuten klavulaanihapon, sulbaktaamin ja tatsobaktaamin mukana ollessa tai näiden puuttuessa). Kek-sintö koskee erityisesti aktiivisen metallo-beta-laktamaasin translaation jälkeis-.···. 30 tä modifikaatiota, joka tehdään kohdennetusti typistämällä entsyymiä ja liittä- mällä aminopään alueeseen dipeptidi ja jolla on tarkoitus vähentää aminopään heterogeenisyyttä Bacillus subtilis -tuotantojärjestelmässä.

IM

“Metallo-beta-laktamaasit” tarkoittavat tässä keksinnössä ryhmän B

» beta-laktamaaseja, toisin sanoen beta-laktamaaseja, joiden aktiivisuuteen 35 vaaditaan vähintään yhtä kahdenarvoista metalli-ionia (Zn2+); ja nämä muodos- • · tavat ryhmän 3 Bushin, Jacobyn ja Madeirosin toiminnallisessa luokittelussa 119190 7 (Bush, 1998). Metallo-beta-laktamaasit voidaan jakaa kolmeen alaryhmään B1, B2 ja B3, perustuen sinkin sitoutumista koordinoivan alueen rakenteellisiin samankaltaisuuksiin (Galleni et ai., 2001). Keksinnön mukainen metallo-beta-laktamaasi kuuluu edullisesti alaryhmään B1. Tällä alaryhmällä on tärkeimpinä 5 sinkkiä koordinoivina tähteinä kolme histidiiniä ja yksi kysteiini. Lisäyksityiskoh-tia alaryhmistä esitetään tämän patenttiselityksen taustaa koskevassa osassa.

Metallo-beta-laktamaasit ovat jäseniä suuressa, monimuotoisessa proteiinien superperheessä, joille on yhteistä samanlaiset neljä αβ/βα-kerros-rakennetta. Polypeptidiketju jakautuu kahteen domeeniin, jotka käsittävät vas-10 taavasti juosteita ja kierteitä seuraavassa järjestyksessä: βι β2 β3 β4 βδ oci β6 α2 β7 α3 ja β8 βθ βίο βιι 04 βΐ2 as (Carfi et ai., 1995 ja Galleni et ai., 2001). Keksinnön mukaiset metallo-beta-laktamaasit on typistetty aminopäästä ennen toista betajuostetta. Ne on typistetty edullisesti ensimmäisen ja toisen betajuosteen välistä, ja erityisesti välittömästi ensimmäisen ja toisen betajuosteen välissä si-15 jaitsevan aminohapon E edeltä.

Esillä olevassa yhteydessä käytetään tavanomaisia yksikirjaimisia aminohappokoodeja. Siten A tarkoittaa alaniinia, R tarkoittaa arginilnia, N tarkoittaa asparagiinia, D tarkoittaa asparagiinihappoa, C tarkoittaa kysteiiniä, E tarkoittaa glutamiinlhappoa, Q tarkoittaa glutamiinia, G tarkoittaa glysiiniä, H 20 tarkoittaa histidiiniä, I tarkoittaa isoleusiinia, L tarkoittaa leusiinia, K tarkoittaa tt4#; lysiiniä, M tarkoittaa metioniinia, F tarkoittaa fenyylialaniinia, P tarkoittaa prolii- .! ,* nia, S tarkoittaa seriiniä, T tarkoittaa treoniinia, W tarkoittaa tryptofaania, Y tar- i t i : koittaa tyrosiinia ja V tarkoittaa valiinia. Aminohapposekvenssit on esitetty si- • * 9

···· ten, että aminopää on vasemmalla ja karboksyylipää oikealla. NH2- ja -COOH

i 25 on joko merkitty tai jätetty merkitsemättä sekvensseihin.

Tämän keksinnön yhden suoritusmuodon mukaisesti isäntäsolu transformoidaan ekspressiovektorilla, joka kykenee ilmentämään beta-lakta-maasia, jolla on yleinen kaava I: • · » i » « · · 30 NH2-K-T-E-ABL-COOH, (I) • ·« :·ί·: jossa K on lysiini, T on treoniini, E on glutamiinihappo ja ABL on • · · metallo-beta-laktamaasiproteiini, joka on typistetty aminopäästä ennen maini-tun proteiinin toista beta-juostetta, minkä avulla proteiini, jolla on yleinen kaava «··· 35 II: • · »a· 8 119190 NH2-E-ABL-COOH, (II) muodostuu kaavan I mukaisen proteiinin translaation jälkeisen modifikaation tuloksena. Yleisen kaavan I mukainen proteiini on sopivaa valmistaa 5 ligatoimalla KT:ta koodaava DNA-sekvenssi E -ABL:ää koodaavaan DNA-sekvenssiin, jossa E - ÄBL on Bacilluksen ja erityisesti B. cereuksen metallo-beta-laktamaasi, joka on typistetty aminopäästä ennen toista betajuostetta välittömästi glutamiinihappotähteen E edeltä. Nukleotidikonstrukti käsittää erityisesti sekvenssin nro 2 perättäiset nukleotidit 94 - 756.

10 Niiden aminopään alueiden pituudet, joilla ei ole jäykkää rakennet ta, vaihtelevat metallo-beta-laktamaasiryhmien välillä ja kussakin alaryhmässä. Bacillus-lajien metallo-beta-laktamaaseilla on myös vaihteluita aminopään sekvenssissä ennen toista betajuostetta, mutta useimmilla entsyymeillä on kon-servoitunut glutamiinihappo (E) kohdassa +12 (katso taulukko 1). Tämän joh-15 dosta deleetiota kytkettynä KT:n insertioon E:n viereen voidaan käyttää tunnettuihin Bacilluksen metallo-beta-laktamaaseihin, jolloin luonnossa esiintyvän kypsän beta-laktamaasiproteiinin N-terminaalisesta päästä deletoidaan ensimmäiset yksitoista aminopään aminohappoa.

Taulukko 1. Aminopäiden sekvenssien vertailu fiac/Z/i/s-lajien sp:n metal· 20 lo-beta-laktamaasien ja P2A:n välillä * *···· I- .......I....... ' I — " *, * Proteiini Bacillus-kanta .__Aminopään alue *_

: f P2A B. cereus 98ME1552 EQKLEQIVIKMjTGTISISOLNK

···{' Q2AJV1 B. weihenstephanensis KBAB4 EQKLEQKVIKNlrGTISlSQLNK

i.i : P10425 Bacillus sp. (kanta 170) sqkveqiviknBtgtisisqlnk

5.:.*·* Q734F3 B. cereus ATCC 10987 EQKLEQKVIKnBaGTISISQLNK

P04190 e. cereus 569/H sqkvektviknItgtisisolnk

Q81AW2 B. cereus ATCC 14579 / DSM 31 SQKVEKTViKNiTGTISISOLNK

Q93T40 e. anthracis Sterne ERKVEHKVlKl#rGTl SI SQLNK

.···. Q6SPY5 Penisilliiniresistentti B. anthracis erkvehkviknItgtiSIsolnk • · “ *

'** Q4MX25 B. cereus G9241 SQKVEQKVMKnBaGTISISOLNK

:.i.: P14488 B. cereus 5/B/6 ERTVEHKVIKNlTGTISISOLNK

C.: Q6HFY5 a thurinpiensis 97-27_ ERTVEHKVIKnBtGTISISQLNK

* Aminohapposubstituutiot on esitetty lihavoituina ja konservoitunut glutamiinihappo (E) on var· ···· ,··♦, jostettu. Metallo-beta-laktamaasien ensimmäinen betajuoste on esitetty yksinkertaisesti allevii- • · vattuna ja toinen betajuoste on esitetty kaksinkertaisesti alleviivattuna.

119190 9 Tämän keksinnön yhden erityisen suoritusmuodon mukaisesti E -ABL on vähintään 70-, 80-, 90-, 95-, 98- tai 99-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 3 perättäisten aminohappotähteiden 6-221 aminohapposekvenssin kanssa. Sekvenssien identtisyys voidaan määrittää käyttäen BLASTia 5 (Basic Local Alignment Search Tools) julkaisussa Altschul et ai., 1997 kuvatulla tavalla. Tarkemmin sanottuna E-ABL on sellaisen metallo-beta-laktamaa-sin typistetty muoto, jolla on sekvenssinä nro 1 esitetty sekvenssi, tai tämän beta-laktamaasina aktiivinen variantti tai fragmentti. E - ABL:llä on edullisesti aminopää, joka vastaa sekvenssin nro 1 aminohappotähteitä 12-15, 12-19 10 tai 12 - 23, sillä lisäyksellä, että kohdassa +13 oleva aminohappo voi olla joko T (treoniini) tai A (alaniini).

Aminohapposekvenssillä, joka on nimenomaisen aminohapposekvenssin “variantti”, tarkoitetaan aminohapposekvenssiä, joka ei ole identtinen nimenomaisen aminohapposekvenssin suhteen, mutta sisältää vähintään joi-15 takin aminohappomuutoksia, toisin sanoen deleetioita, substituutioita, inversioita, insertioita ja muita näitä vastaavia muutoksia, jotka eivät vaikuta olennaisesti proteiinin biologiseen aktiivisuuteen nimenomaisen aminohapposekvenssin vastaavaan aktiivisuuteen verrattuna. Biologinen aktiivisuus tarkoittaa tässä yhteydessä beta-laktamaasiaktiivisuutta. Variantti voi olla polypeptidi, joka 20 esiintyy luonnossa esimerkiksi alleelisena varianttina samassa kannassa, lajis-" sa tai suvussa, tai se on voitu muodostaa mutageneesin avulla.

,* “Fragmentin” ymmärretään olevan nimenomaisen aminohapposek- • « « : ·* venssin osa, joka on riittävän pitkä omatakseen haluttua biologista aktiivisuut- ...Γ ta, toisin sanoen beta-laktamaasiaktiivisuutta. Toisin sanoen fragmentti voi olla • * : 25 esimerkiksi nimenomaisesti kuvattujen beta-laktamaasien osasekvenssi.

J#J*s Nukleotidikonstrukti, joka koodaa NH2 - K - T - E - ABL - COOHita, voidaan liittää ekspressiovektoriin ja transformoida isäntäsoluun.

Tämän jälkeen isäntäsolua viljellään olosuhteissa, jotka tekevät mahdolliseksi proteiinin ilmentymisen ja translaation jälkeisen modifikaation NH2 - E - ABL - ,···. 30 COOH:ksi, joka voidaan siten saada olennaisesti puhtaassa muodossa, mikä • · *·* tarkoittaa sitä, että metallo-beta-laktamaasista esiintyy vähintään 90 % ja edul- M.: lisesti vähintään 95 %, erityisesti vähintään 99 % yhdessä ainoassa muodossa * · NH2 - E - ABL - COOH:na. Ilmentyneen proteiinin translaation jälkeistä modi-fikaatiota, toisin sanoen dipeptidin KT irtilohkaisua, katalysoivat isännän prote-I*··. 35 aasit. Isäntä voi olla eukaryoottinen tai prokaryoottinen, kuten bakteeri-, hiiva- tai sienisolu. Bakteeri-isäntä voi olla esimerkiksi Escherichia coli. Isäntä kuuluu 119190 10 edullisesti Bacillus-lajeihin, ja se on erityisesti B. licheniformis tai B. subtilis. Yhden edullisen suoritusmuodon mukaisesti NH2 - K - T - E - ABL - COOH ilmentyy proteiinina, joka käsittää signaalipeptidin, jonka avulla proteiini erittyy elatusaineeseen, ja ensin tapahtuu signaalipeptidin ja tämän jälkeen dipeptidin 5 irtilohkaisu. Proteiinissa voi esiintyä valmistusmenetelmän tai varastoinnin aikana vähäisiä muita muutoksia, kuten deamidoitumista, hapettumista, disulfi-disidoksen hajoamista tai muodostumista, isomeroitumista, sukkinimidoitumis-ta, disulfidisilloitukseen lukeutumatonta silloittumista, Maillardin reaktioita, deg-lykosylaatiota, ja nämä ovat hyväksyttäviä sikäli kuin ne eivät vaikuta merkittä-10 västi beta-laktamaasiaktiivisuuteen.

Modifioitu beta-laktamaasi NH2 - E - ABL - COOH voi olla peräisin mistä tahansa bakteerista, joka kykenee tuottamaan metallo-beta-lakta-maasia. Tällaisia bakteereita ovat esimerkiksi Enterobacteriae-suvun bakteerit (Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freudii, Shigella 15 flexneri), Pseudomonas aeruginosa, Stenobacterium maltophila, Acinetobac-fer-suku, Bacteroides fragilis, Bacillus cereus, Flavobacteruim odoratum ja Bacteroides fragilis. Muita mahdollisia lähteitä ovat Aeromonas-, Legionella- ja Stenotrophomonas-lajit. Entsyymi on typistetty kypsän entsyymiproteiinin ami-nopäästä ennen toista betajuostetta sellaisesta kohdasta, josta N-pään amino-20 hapoksi tulee E. Jos bakteriaalisessa beta-laktamaasissa ei ole sopivaa täh-dettä E, niin ainoastaan ABL-osa voidaan saada bakteerista, kun taas tripeptidi KTE kytketään ABL:n eteen proteiinin NH2-K-T-E-ABL-COOH muo- • · · • ·* dostamiseksi.

·«·!* Modifioitu beta-laktamaasi on edullisesti peräisin Bacilluksesta, ja : 25 erityisesti B. cereuksesta. Se on erityisesti B. cereuksen beta-laktamaasi, josta :,j,i on deletoitu modifioimattoman kypsän beta-laktamaasiproteiinin ensimmäiset :[[[: yksitoista N-pään aminohappoa.

Tämän keksinnön mukainen modifioitu beta-laktamaasi voidaan yhdistää mihin tahansa farmaseuttisesti hyväksyttävään lisäaineeseen tai kan- ,···, 30 taja-aineeseen farmaseuttisen koostumuksen muodostamiseksi. Tämän jäl- keen henkilölle, jota hoidetaan yhdellä tai useammalla beta-laktaamiantibioo- *·ί.: tiliä, annetaan suun kautta sellainen määrä modifioitua beta-laktamaasia, jonka ··· vaikutuksesta beta-laktaamlantibioottien haitallinen vaikutus suolessa eliminoi-tuu. Beta-laktamaasivalmistetta voidaan antaa ennen antibioottihoitoa, tämän .··*, 35 kanssa samanaikaisesti tai tämän jälkeen.

• · ·*· 119190 11

Keksintöä kuvataan seuraavin sitä rajoittamattomin esimerkein. On kuitenkin selvää, että yllä olevassa selityksessä ja esimerkeissä esitetyt suoritusmuodot ovat ainoastaan kuvaavia tarkoituksia varten, ja että useat erilaiset muutokset ja modifikaatiot ovat tämän keksinnön suojapiirissä mahdollisia.

5 Esimerkki 1. Materiaalit ja menetelmät Bakteerikannat ja kasvatusolosuhteet

Bakteerikannat ja niiden asiaankuuluvat genotyypit ja fenotyypit on esitetty taulukossa 2.

§ · ·· · 000 • i • · 000 «M· • · • · · • · · • e1 1 e · 1 • · · «·· *·# e 1 • ·

Ml • · 0 0 1 • · 1 • · • 0· • 0 0 0 • 00 0 0 0 0 0 • · · • «0 • 00 • 0 • f • 00 • 0 000 0 • •00 00 • · 0 0 · 0 119190 12

Taulukko 2. Bakteerikannat ja niiden asiaankuuluvat genotyypit ja fenotyypit___

Kanta Asiaankuuluva Asiaankuuluva __genotyyppi__fenotyyppi_

Bacillus subtilis RS303 trpC2, sigG::cat Tryptofaaniauksotrofi, ___asporogeeninen_

Bacillus subtilis IH 6140 $acA321 Pienentynyt eksoprote- ___aasipitoisuus_

Bacillus subtilis RS314 trpC2, sigG::cat, Tryptofaaniauksotrofi, pRSH314-ilmentämis- asporogeeninen, konstrukti, joka koodaa erittää metallo-beta- typistettyä metallo-beta- laktamaasia __laktamaasia__

Bacillus subtilis RS315 trpC2, sigG::cat, Tryptofaaniauksotrofi, pRSH315-ilmentämis- asporogeeninen, konstrukti, joka koodaa erittää metallo-beta- täydellistä metallo-beta- laktamaasia __laktamaasigeeniä__

Bacillus subtilis RS317 trpC2, sigG::cat, Tryptofaaniauksotrofi, pRSH317-ilmentämis- asporogeeninen, ····) konstrukti, joka koodaa erittää metallo-beta- typistettyä metallo-beta- laktamaasia ' ,·. laktamaasia • ^^— ' !“! Bacillus subtilis RS318 trpC2, sigGr.cat, Tryptofaaniauksotrofi, ***,: pRSH318-ilmentämis- asporogeeninen, • i « konstrukti, joka koodaa erittää metallo-beta- • i *···’ typistettyä metallo-beta- laktamaasia __laktamaasia__ • t \V Bacillus ceraus Multiresistentti useille :***: 98ME1552 erilaisille beta-laktaameille

SS· I--- I I

s

• SS «SS

V.'.' Bakteereita viljeltiin yleensä Lurian kompleksisessa elatusaineessa *"** 5 (5 grammaa hiivauutetta, 10 grammaa tryptonia ja 10 grammaa natriumkloridia litraa kohti), jota oli täydennetty sopivilla selektioaineina käytettävillä antibioo-teillä, ravistelupullotoimintatilassa + 37 °C:ssa. Fermentaatioissa käytettiin sopivalla antibiootilla täydennettyä synteettistä elatusainetta. Kompetenttien Ba- 119190 13 cillus subtilis -solujen muodostamiseen käytettiin modifioitua synteettistä ela-tusainetta. Näiden eiatusaineiden yksityiskohtainen koostumus on kuvattu julkaisussa WO 03/040 352.

DNA-menetelmät 5 Tavanomaisia DNA-menetelmiä, joita olivat esimerkiksi restriktiot, agaroosigeelielektroforeesi ja iigaatiot, käytettiin teoksen Sambrook ja Russell (2001) mukaisesti. Kromosomaalinen DNA eristettiin käyttäen Marmurin menetelmää (Marmur, 1961). Plasmidi-DNA eristettiin käyttämällä Qiagen plasmid Midi Kit -reagenssipakkausta valmistajan ohjeita noudattaen (Qiagen Plasmid 10 Purification Handbook -käsikirja, 1999), mutta suoritusvaiheisiin lisättiin pepti-doglykaanikerroksen hajottamiseksi lysotsyymikäsittely (1 mg/ml). P1-puskuria täydennettiin lysotsyymillä ja soluja inkuboitiin 37 °C:ssa 30 minuuttia.

PCR suoritettiin yleisesti julkaisussa WO 03/040 352 kuvattujen suoritustapojen mukaisesti.

15 Metallo-beta-laktamaasin useiden erilaisten muotojen aminopään alueen karakterisointi N-pään aminohapposekvenssin määritysten ja massaspektrometrian suorittamiseksi puhdistettua metallo-beta-laktamaasia sisältäviä näytteitä käsiteltiin käänteisfaasikromatografisesti ja entsyymit fraktioitiin 60 minuutin ai-'"** 20 kana 0,1 % TFA:sta ja 0,075% TFA-asetonitriili -seoksesta valmistetulla alu- M * • V een 0 %-100 % kattavalla lineaarisella gradientilla.

ι#Ψ Metallo-beta-laktamaasimuotojen NH2-pään sekvenssit määritettiin : automatisoidulla Edman-hajotuksella käyttämällä Applied Biosystems -yhtiön e·· · . 494A-mallista Protein Sequenator-sekvensointilaitetta.

• at ,···. 25 Metallo-beta-laktamaasimuotojen massa-analyysit tehtiin käyttä mällä kvadrupoli-lentoaika (Q-TOF) -hybridilaitetta. Metallo-beta-laktamaasin .. varianttien on otaksuttu saavan aikaan toisiinsa verrattavissa olevia ionisaatio- t i · potentiaaleja, joita on käytetty niiden suhteellisten osuuksien määrityksissä • · *··♦* näytteissä.

: 30 Beta-laktamaasigeenien nukleotidisekvenssit määritettiin ketjun di- ·***· deoksiterminaatiomenetelmällä automatisoitua DNA:n sekvensointilaitetta käyt- ··· *, täen.

··· ···· ··· • · • « «·* 119190 14

Esimerkki 2. Bacillus cereus 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasigeenin täydellinen nukleotidisekvenssi

Metallo-beta-laktamaasia koodaavan täydellisen geenin määritys suoritettiin peräkkäisessä järjestyksessä PCR- ja Vectorette-menetelmiä käyt-5 täen. Osa rakennegeenistä monistettiin PCR:llä käyttäen templaattina kliinisen B. cereus 98ME1552 -isolaatin eristettyä kromosomaalista DNA:ta ja käyttäen alukkeita, jotka oli suunniteltu hybridisoitumaan Bacillus cereus 569/H:n metallo-beta-laktamaasigeenin koodaavaan SQKVEKTVI-alueeseen (eteenpäin suuntautuva aluke) ja koodaavaan HTLDLL-alueeseen (käänteinen aluke). Kumpi-10 kin aluke sisältää myös Hind III -restriktiokohdat. Monistettu DNA-fragmentti (noin 700 ep) pilkottiin Hind Ulilla ja ligatoitiin eritysvektorin pKTH141 Hind III -kohtaan. Kompetentteja Bacillus subtilis IH6140 -soluja transformoitiin ligaa-tioseoksella. Klooni, jossa oli metallo-beta-laktamaasia ilmentävä plasmidi, varmistettiin oikeaksi sekvensoimalla DNA. Plasmidille annettiin nimitys 15 pRSH314.

Kompetentteja B. subtilis RS303 -soluja transformoitiin pRSH314:lla, mistä saatiin tulokseksi B. subtilis -kanta RS314.

Metallo-beta-laktamaasigeenin täydellinen DNA-sekvenssi määritettiin Vectorette-menetelmää käyttäen saaduista PCR-fragmenteista seuraa-20 vasti: Bacillus cereus 98ME1552:n kromosomaalinen DNA pilkottiin Hind III -restriktioentsyymillä ja ligatoitiin Hind Ulilla käsiteltyyn Vectorette Ikeen. Saatu Vectorette-kirjasto seulottiin PCR-reaktiolla käyttämällä aloitusalukkeina : MEBLSQ-F:ää (5’-AGGAAATGTTGCGGATGC) tai MEBLSQ-R:ää (5- :*·| CCTTCGTTAATTTGTTATCCC), jotka oli suunniteltu sellaisen DNA-sekvens- • · · :*γ 25 sin perusteella, joka oli saatu 700 epistä pRSH314:tä.

*···· Vectorette-kirjaston PCR-seulonta MEBLSQ-F-alukkeella tuotti noin 1000 epin suuruisen fragmentin (MEBL1-fragmentin) ja MEBLSQ-R-aluk- keella noin 1100 epin suuruisen fragmentin (MEBL2-fragmentin). Elektroforee- :V: sin jälkeen sekä MEBL1- että MEBL2-fragmentit puhdistettiin agaroosigeelistä.

·***: 30 Kummankin fragmentin nukleotidisekvenssit määritettiin DNAin sekvensoin- ·«· *. nilla, mistä saatiin tulokseksi B. cereus 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasi- • · · *“** geenin täydellinen nukleotidi. B. cereus 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasi- • · ’"·* geenin täydellinen nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi on esitetty ku- viossa 1. Aminohapposekvenssi esitetään myös sekvenssinä nro 1. Avoin lu- :***· 35 kukehys koodaa 257 aminohapon suuruista polypeptidiä, jonka aminopään ·*· sekvenssillä (30 aminohappotähdettä) on bakteerien signaalipeptidin sekvens- 119190 15 sille tyypillisiä piirteitä, joka sekvenssi kohdistaa proteiinin erittymään syto-plasmisen membraanin läpi yleisen eritysreitin välityksellä. Ennustettu signaa-lipeptidaasin pilkkoutumiskohta on kohdassa -30 esiintyvän alaniinin jälkeen (katso kuvio 1). 227 aminohappotähteen suuruisen kypsän proteiinin lasken-5 nallinen molekyyli ja pl-arvo ovat vastaavasti 24 877,3 Da ja 6,0. 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasin sekvenssiä käytettiin hakumallina BLAST-haussa proteiinin tunnistamiseksi. BLAST-haku suoritettiin käyttäen laitoksen Swiss Institute of Bioinformatics (http://www.expasy.org/tools/blast/) SIB BLAST Network Service -palvelua. Haku tehtiin UniProtKB Knowledge based database 10 -tietokantaa vastaan NCBI BLASTP 2.2.13 -ohjelmalla (Altschul et ai,, 1997) käyttäen BLOSUM62-algoritmia ja aukkosakkoina 11 aukon olemassaololle ja 1 pidentämiselle. 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasilla suoritettu BLAST-haku tuotti suurimmat samankaltaisuuspistemäärät muiden beta-laktamaasien B-ryhmän B1-alaryhmän suhteen. Kuten oli odotettua, oli 98ME1552:n beta-15 laktamaasilla korkeanasteinen identtisyys (yli 90 %) muiden B. cereuksen beta-laktamaasien kanssa. Erilaisten B. cereuksen metallo-beta-laktamaasien rakenteellisen rinnastuksen mukaisesti B. cereus 98ME1552:n laktamaasin ami-nohapposubstituutioiden ennustetaan paikantuvan alueille, jotka eivät ole välttämättömiä entsyymin toiminnalle.

20 Esimerkki 3. B. cereus 98ME1552:n metallo-beta-laktamaasigeenin kloo- ‘:: naus ja ilmentäminen Bacillus subtiliksessa ·*·*· ·* ·* Vectorette-kirjastosta saatujen DNA sekvenssien perusteella suun- e

niteltiin uudet alukkeet, BLC1-F

Ι.Γ: (5’-CGCGAAGCTT CCGAACAAAAGCTAGAGCAAATAGTAAT C),

:φΓ: 25 ja BLC1-R

(5’-GCCGAAGCTTTTATTTTAATAAATCCAATGTATGTAAAAGTAATCCC) e·· täydellistä metallo-beta-laktamaasia koodaavan DNA-insertin muodostamisek- ,y. si PCR:llä. Alukkeet sisälsivät myös päissään Hind III -kohdat ja templaattina käytettiin B. cereus 98ME1552:n puhdistettua kmmosomaalista DNA:ta. Mo- T 30 nistunut noin 0,7 ke:n suuruinen PCR-fragmentti pilkottiin Hind llhlla ja ligatoi- « tiin pKTH141-eritysvektorin Hind III -kohtaan. Kompetentteja Bacillus subtilis s”*: RS303 -soluja transformoitiin tällä ligaatioseoksella. Yhdelle positiiviselle kloo- nille annettiin nimitys RS315 ja sen sisältämälle ilmentämiskonstruktille annet-*111' tiin nimitys pRSH315.

’*·*' 35 pRSH315-ilmentämiskonstrukti eristettiin ja insertioalue sekvensoi- tiin. Kloonatun metallo-beta-laktamaasigeenin nukleotidi- ja päätelty amino- 119190 16 happosekvenssi olivat identtiset Vectorette-kirjastosta määritettyjen sekvenssien suhteen. Määritetyssä DNA-sekvenssissä todettiin esiintyvän lukukehykseen muodostunut fuusio Bacillus amyloliquefaciensin alfa-amylaasin 31 aminohapon pituista signaalisekvenssiä koodaavan nukleotidisekvenssin, Hind lii 5 -kloonauskohdan ja B. cereus 98ME1552:n täydellisen metallo-beta-laktamaa-sigeenin kesken (katso kuvio 2). Signaalipeptidaasin ennustetaan katkaisevan kohdassa -1 esiintyvän alaniinin (A) ja kohdassa +1 esiintyvän glutamiinin (Q) välisen peptidisidoksen. Kypsässä metallo-beta-laktamaasissa on NH2-QAS-tripeptidin muodostama NH2-pään jatke, joka on peräisin ilmentämiskonstrukti-10 on sisältämästä Hind III -kloonauskohdasta. Johdetun aminohapposekvenssin perusteella kypsä modifioitu metallo-beta-laktamaasi käsittää siten 230 aminohappotähdettä.

Esimerkki 4. Bacillus subtilis -tuotantojärjestelmästä saatujen metallo-beta-laktamaasivarianttien aminopään aminohapposekvenssin määrittä-15 minen

Tarkempaa luonnehtimista varten yhdistelmä-metallo-beta-lakta-maasia tuotettiin viljelyissä, jotka suoritettiin joko ravistelupullossa tai fermen-toimalla käyttäen synteettistä elatusainetta. Metallo-beta-laktamaasi erittyi tehokkaasti viljelmäsupematanttiin. Entsyymi puhdistettiin väkevöidystä viljel-20 mäsupematantista ioninvaihtokromatografialla. Entsyymiaktiivisuutta havaittiin * kahdessa erillisessä fraktiossa. Puhdistetuille entsyymifraktioille tehtiin NH2- : pään sekvensointi ja massaspektrometria-analyysi. Analyyseistä kävi ilmi, että kummatkin fraktiot käsittivät entsyymin muotoja, joilla oli heterogeeninen ami-j'·1 2: nopää. Useat erilaiset entsyymin muodot ja niiden suhteelliset osuudet on esi- : 25 tetty taulukossa 3. Suhteessa johdettuun aminohapposekvenssiin kaikki ent- ·3· syymin muodot sisältävät NH2-päänsä alueilla erimittaisia deleetioita. NH2- ··· QASEQKLE-oktapeptidi näyttää deletoituneen yleensä kaikissa entsyymin .v, muodoissa. Lisäksi entsyymin pienimmästä muodosta fraktiossa 2 puuttuu li- • · · saksi tuleva IVIKN-pentapeptidi. Havaittu mikroheterogeenisyys NH2-pään alu-*;·’ 30 eella voidaan selittää isäntäsolun erilaisten proteaasien vaikutuksen aikaan- saamiksi translaation jälkeisiksi modifikaatioiksi.

• · · • · • · • · · · · ···« 2 • · · • · • · 3 • · · 119190 17

Taulukko 3. Metallo-beta-laktamaasin typistyneiden muotojen johdetut ja määritetyt aminopään sekvenssit ja määritetty molekyylimassa

Ent- Johdettu NH2-pään amino- Määritetty NH2- Entsyymi- Määri-syymi- happosekvenssi pään sekvenssi muotojen tetty fraktio suhteellinen massa nro osuus (kDa) fraktioissa ____(%]__ __nh2-qaseqkleqiviknetgti____ 1 ___NHy-IVIKNETGTI__100__24122 2 ___NHg-NETGTI__60__23 668 2 ΝΗϋ-ETGTI 40 23 554

Esimerkki 5. Bacillus cereus 98ME1552:n deletoidun metallo-beta-lakta-maasimuodon ja sen aminopään varianttien konstruointi Bacillus subtilis 5 -tuotantojärjestelmässä NH2-pään heterogeenisyyden vähentämisen yrittämiseksi metallo-beta-laktamaasigeenin vaihteievaa aluetta NH2-EQKLEQIVIKN koodaava DNA-sekvenssi deletoitiin PCR:llä. PCR:ssä käytettiin templaattina B. cereus 98ME1552:n täydellistä metallo-beta-laktamaasigeeniä sellaisen eteenpäin 10 suuntautuvan alukkeen kanssa, joka hybridisoituu ETGTISISQ:ta koodaavaan » · ...t sekvenssiin, ja sellaisen käänteisen alukkeen kanssa, joka hybridisoituu : ;* GLLLHTLDLLK:ta koodaavaan sekvenssiin, jota seuraa translaation lopetus- • · · ;**j kodoni TAA. Kumpikin aluke sisälsi Hind III -kohdat.

i Saatu noin 0,7 ke:n suuruinen PCR-fragmentti kloonattiin 15 pKTH141-eritysvektorin Hind III -kohtaan ja kompetentti B. subtilis RS303 ··* -kanta transformoitiin ligaatioseoksella. NH2-pään deleetio varmistettiin oikeaksi positiivisesta kloonista eristetyn ilmentämiskonstruktin liitetyn metallo-beta- :V: laktamaasigeenin DNA:n sekvensoinnilla. Transformoidulle kannalle annettiin • * nimitys Bacillus subtilis RS317 ja ilmentämiskonstruktille nimitys pRSH317.

\ 20 Typistettyä metallo-beta-laktamaasia tuotettiin Bacillus subtilis -tuo- • · « tantoisännässä ja entsyymi puhdistettiin viljelmäsupematantista käyttämällä ioninvaihtokromatografiaa, josta aktiivinen entsyymi eluoitui yhtenä fraktiona.

··· Entsyymifraktiolle suoritettiin NH2-pään aminohapposekvensointi ja molekyyli- ···· .···. massan analyysi. Havaitut tulokset (taulukossa 4) osoittivat, että typistetty me- 25 tallo-beta-laktamaasi esiintyi myös proteiinina, jolla oli heterogeeninen amino- 119190 18 pää. Entsyymin päävariantilla on aminopään sekvenssi, joka on identtinen sellaisen johdetun aminohapposekvenssin suhteen, joka sisältää QAS-aloitus-tripeptidiä koodaavan Hind III -kohdan. Vähäisessä määrin esiintyvällä variantilla havaittiin olevan QA-dipeptidin deleetio. Aminopään salpauksen johdosta 5 yhdeltä variantilta ei saatu aminohapposekvenssiä. Aminopään salpaus johtuu todennäköisesti glutamiinitähteen syklisoitumisesta, jolloin tästä muodostuu tuotantomenetelmää käytettäessä pyroglutamyylitähde. Johtopäätöksenä on todettava, että aminopään deletointi ei pohjimmiltaan vähentänyt aminopään mikroheterogeenisyyttä.

10 Taulukko 4. Typistettyjen metallo-beta-laktamaasimuotojen määritetyt aminopään sekvenssit ja molekyylimassat

Ent- Johdettu NH2- Määritetty NHy Entsyymi- Massa- syymi- pään amino- pään sekvenssi muotojen analyysi fraktio happosek- suhteellinen (kDa) nro venssi osuus fraktioissa ____m__ __NH?-QASETGTISI____ 1. a. glutamiinin syklinen muoto -> ei DNA-sekvenssiä a. 23 823 • · e · e e · : ;* b. NH2-QASETGTISI b. 90 b. 23 840 e * · e • ••e • e : __ c. NH2-SETGTISI c. 10 c. 23 641 e • · * • · · • aa _ .··*. Esimerkki 6. Koodaavan sekvenssin KT-insertion sisältävän Bacillus ce- • · reus 98ME1552:n typistetyn metallo-beta-laktamaasin konstruointi

Translaation jälkeisen modifioitumisen välttämiseksi suunniteltiin • a e 15 metallo-beta-laktamaasin molekulaarinen typistys, joka käsittää NH2-*:*' EQKLEQIVIKN-aluetta koodaavan DNA-sekvenssin deleetion yhdistettynä KT- e :.j.: dipeptidiä koodaavan sekvenssin insertioon, joka sijaitsee myötävirtaan välit- tömästi 3’-Hind III -kloonauskohdan jälkeen.

Muodostettiin modifioitu metallo-beta-laktamaasigeeni menetellen e "!! 20 samoin kuin esimerkissä 5 lukuun ottamatta sitä, että käytettiin KT:tä koodaa- **·*' van DNA-sekvenssin sisältävää eteenpäin suuntautuvaa aluketta. PCR-frag- mentti katkaistiin Hind lll:lla ja ligatoitiin pKTHl41-eritysvektorin Hind III -koh- 19 119190 taan ja kompetentteja B. subtilis RS303 -soluja transformoitiin ligaatioseok-sella. Ilmentämiskonstruktin sisältämän modifioidun metallo-beta-laktamaasi-geenin nukleotidisekvenssi varmistettiin oikeaksi DNA:n sekvensoinnilla. Yhdelle positiiviselle kloonille annettiin nimitys Bacillus subtilis RS318 ja ilmentä-5 miskonstruktille annettiin nimitys pRSH318. pRSH318:sta peräisin olevan B. cereus 98ME1552:n beta-laktamaasin nukleotidi- ja johdettu aminohapposekvenssi esitetään kuviossa 3, ja nämä esitetään vastaavasti sekvensseinä nro 2 ja 3.

Typistettyä metallo-beta-laktamaasia tuotettiin, puhdistettiin ja ana-10 lysoitiin aiemmin kuvatulla tavalla. Aktiivinen typistetty metalloentsyymi eluoitui kolonnista yhtenä ainoana piikkinä. Yksittäinen fraktio sisälsi metallo-beta-lak-tamaasin, jolla oli aminopään homologinen glutamiinihappotähde (NH2-E; katso taulukko 5). Tämän mukaisesti KT-dipeptidi-insertiolle tapahtuu translaation jälkeinen modifikaatio, josta on tuloksena yhtenäinen aminopään aminohap-15 posekvenssi. Typistetylle metallo-beta-laktamaasille annettiin nimitys P2A-proteiini.

Taulukko 5. Typistetyn metallo-beta-laktamaasimuodon johdettu ja määritetty aminopään sekvenssi ja määritetty molekyylimassa

Entsyymi- Johdettu NH2-pään Määritetty NH2- Entsyymimuotojen Massa-, fraktio aminohappo- pään sekvenssi suhteellinen osuus analyysi e · „ , _nro__sekvenssi___fraktioissa (%)__(kDa)

·* ·* NH2-QASKTETGTISI

• ' ---—— ···!* 1. a. NH2-ETGTISI a. 100 a. 23 554 • · 1 - 1 e e • e · • e· e : Esimerkki 7. P2A metallo-beta-laktamaasin entsyymikineettiset muuttujat ees :***: 20 P2A-entsyymin katalyyttisten ominaisuuksien monitahoisuutta tut- kittiin käyttämällä erilaisia beta-laktaamityyppejä, joita olivat penisilliiniperhe seriini-beta-laktamaasin inhibiittorien kanssa ja ilman näitä, toisen ja kolman- • · e nen sukupolven kefalosporiinit ja karbapeneemit (meropeneemi). Entsyymiki-neettisten muuttujien kcat ja Km arvot määritettiin alkunopeuksista käyttäen Ha- * 25 nesin kuvaajaa. Reaktiot suoritettiin 30 °C:ssa 10 mM fosfaattipuskurissa, jon- ka pH oli 7,0. Reaktiokyvetti (yksi millilitra) sisälsi kaikissa reaktioissa noin !·„ 5 pmol entsyymiä lukuun ottamatta sitä, että meropeneemimäärityksessä käy- « tettiin 1,7 pmol entsyymiä. Erilaisten beta-laktaamisubstraattien hydrolysoitu-'**·' minen rekisteröitiin spektrofotometrisesti kullekin substraatille spesifisellä aal- 30 lonpituudella.

119190 20

Erilaisten kineettisten muuttujien (kcat, Km ja kcat/Km) arvot, jotka edustavat kolmesta toisistaan riippumattomasta määrityksestä saatuja keskiarvoja, on raportoitu taulukossa 6.

Taulukko 6. P2A-metallo-beta-laktamaasin kineettisten muuttujien arvot _Antibiootti__P2A-proteiini_

Km (pM) kcat(1/s) kcat/Km __(M'1 X s'1)

Ampisilliini__942_1114_1,18 x 10'6

Ampisilliini-sulbaktaami (Unasyn) 1104_1251_1,15 x 10~6

Amoksisilliini__716_980_1,37 x 1Q'6

Amoksisilliini-klavulaanihappo 717 990 1,38 x10'6 (Augmentin)__

Piperasilliini__372_1049_2,82 x 10~6

Piperasilliini-tatsobaktaami 412 1098 2,67x10® (Tazocin)__

Kefuroksiimi__27_221 7,99 x 10-6

Kefotaksiimi__66_479_7,28 x 10-6

Keftriaksoni__68_95_1,40 x 10 6

Meropeneemi _ 410_480_1,17 x IQ"6 [ (* 5 Esimerkki 8. P2A-proteiinin stabiilisuus ihmisen sykkyräsuolen suolensi- : V säilössä • · ···· Kestävyys suoliston proteaaseja vastaan on yksi tärkeimmistä teki- : jöistä, jotka vaikuttavat P2A-proteiinin käytettävyyteen lääkeaineena kohden- netussa beta-laktamaasihoidossa ohutsuolessa. Metallo-beta-laktamaasin herk-10 kyyttä ohutsuolen proteaasien vaikutukselle tutkittiin lisäämällä eri määriä aktiivista entsyymiä koeputkiin, jotka sisälsivät Ihmisen sykkyräsuolen suolensisäl-töä. Metallo-beta-laktamaasin hydrolysoitumista seurattiin määrittämällä sykky- • · ,·*·. räsuolinäytteiden beta-laktamaasiaktiivisuus eri ajankohdilla. Aktiivisuusmääri- tyksissä käytettiin substraattina meropeneemiä.

*·ί·: 15 Saadut tulokset neljästä toisistaan riippumattomasta kokeesta ja • · · keskiarvot on ilmoitettu taulukossa 7. P2A-entsyymi näyttää olevan stabiili pro- teiini, joka poistui ihmisen sykkyräsuolen suolensisällöstä 55 minuutin (kes- .···. kiarvo) puoliintumisajalla. Puoliintumisaikojen havaittiin vaihtelevan suuresti eri • · kokeiden välillä. P2A:n puoliintumisajan ihmisen ohutsuolen suolensisällössä 119190 21 on kuitenkin määritetty olevan riittävä P2A-entsyymihoidon soveltamiseksi suotuisin tuloksin jäljellä olevan beta-laktaamin suolikanavassa indusoiman haitallisen reaktion eliminoimiseksi.

Taulukko 7. P2A-metallo-beta-laktamaasin puoliintumisaika (in vitro -olo-5 suhteissa) ihmisen sykkyräsuolen suolensisällössä_____

Koe nro Puoliintumisaika Keskiarvo (± SD) __(minuutteja)___ _1__60__55 ±25_ _2__80__55 ±25_ _3__20__55 ±25 4 60 _55 ±25_ t • · · · • * · • · • · f ··« 1··« • · * · · • · t ··· • · · * I » ···

• M

• · • · ·** • · • * • · » • · ··» • · • · ·«· • · · • · · ··· *·♦ • • *

»M

··· «··· M» • · • ·

• H

22 119190

Kirjallisuusviitteet

Altschul S.F., Madden T.L., Schäffer AA, Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera-5 tion of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389 - 3402 Ambler, R.P. 1980. The structure of beta-lactamases. Philos. Trans. R. Soc. London B 289: 321 - 331.

Bush, K. 1998. Metallo-p-lactamases: a class apart. Clin. Infect. Dis. 32: 271 - 276.

10 Carfi A, Duee E, Galleni M, Frere JM ja Dideberg O. 1998. 1.85 A

resolution structure of the zinc (II) beta-lactamase from Bacillus cereus.Acta

Crystallogr D Biol Crystallogr. 54: 313 - 323.

Carfi A, Duee E, Paul-Soto R, Galleni M, Frere JM ja Dideberg O.

1998. X-ray structure of the Znll beta-lactamase from Bacteroides fragilis in an 15 orthorhombic crystal form. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 54: 45 - 57.

Carfi, A., Pares, S., Duee, E., Galleni, M., Duez, C., Frere, J.M. ja

Dideberg 0. 1995. The 3-D structure of a zinc metallo-beta-lactamase from

Bacillus cereus reveals a new type of protein fold. EMBO J. 14: 4914 - 4921.

Concha, N.O., Janson, C.A., Rowling, P., Pearson, S., Cheever, 20 C.A, Clarke, B.P., Lewis, CM Galleni, M., Frere, J.M., Payne, D.J., Bateson, J.H. ja Abdel-Meguid, S.S. 2000. Crystal structure of the IMP-1 metallo beta- : V lactamase from Pseudomonas aeruginosa and Its complex with a mercapto- « carboxylate inhibitor: binding determinants of a potent, broad-spectrum inhibi-: tor. Biochemistry. 39: 4288 - 4298.

l 25 Galleni, M., Lamotte-Brasseur, J., Rossolini, G.M., Spencer, J.,

Ml .**·. Dideberg, O. ja Frere, J.M. 2001. Metallo-beta-lactamases Standard number-

Ml ing scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 45: ..... 660-663 « · ·

Garau, G., Garcia-Saez, I., Bebrone, C., Anne, C., Mercuri, P., 30 Galleni, M., Frere, J.M. ja Dideberg, O. 2004. Update of the standard number- ing scheme for class B beta-lactamases. Antimicrob. Agents Chemother. 48: 2347-2349.

• * *

Garau, G., Bebrone, C., Anne, C., Galleni, M., Frere, J.M., Dide-berg, O. 2005. A metallo-beta-lactamase enzyme in action: crystal structures • · **··* 35 of the monozinc carbapenemase CphA and its complex with biapenem. J Mol

Biol. 345: 785 - 795.

119190 23

Harmoinen, J., Mentula, S., Heikkilä, M., van der Rest M., Rajala-Schultz, P.J., Donskey, C.J., Frias, R., Koski, P., Wickstrand, N., Jousimies-Somer, H., Westermarck, E., Lindevall, K. 2004. Oral Targeted Recombinant Beta-Lactamase Prevents Ampicillin-lnduced Selective Pressure on the Gut 5 Microbiota: A Novel Approach to Reduce Antimicrobial Resistance Antimicrob. Agents and Chemotherapy. 48: 75 - 79.

Marmur, J. 1961. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3: 208 - 218.

Mentula, S., Harmoinen, J., Koski, P., Westermarck, E., Huovinen, 10 P. ja Könönen, E. 2004. Inhibition of ampicillin-induced emergence of resistance in intestinal conforms by targeted recombinant beta-lactamase. Int. J. Antimicrob. Agents. 24: 555 - 561.

Sambrook, J. ja Russell, D.W. 2001. Molecular cloning, a Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbour, New 15 York.

Stiefel, U., Pultz, N.J., Harmoinen, J., Koski, P., Lindevall, K., Hel-fand, M.S., Donskey, C.J. 2003. Oral β-lactamase administration preserves colonization resistance of piperacillin-treated mice. J Infect Dis. 10: 1605-1609.

20 Stiefel, U., Harmoinen, J., Koski, P., Kääriäinen, S., Wickstrand, N., Lindevall, K., Pultz, N.J., Bonomo, R.A., Helfand, M.S. ja Donskey, C.J.

• · ;v 2005. Orally administered recombinant metallo-beta-lactamase preserves *’ colonization resistance of piperacillin-tazobactam-treated mice. Antimicrob.

“·· Agents Chemother. 49: 5190 - 5191.

ί·: : 25 Walsh, T.R., Toleman, M.A., Poirel, L. ja Nordmann, P. 2005. Met- allo-beta-lactamases: the quiet before the storm? Clin Microbiol Rev. 18: 306 - ··· : i 325.

t ♦ • · t • I « • · *·· t * • · • « · « • ♦ · • » I · · ··· • · • · ·»· 1 2 2 ·«· « · • · ···

Claims

119190

1. Modifioitu metallo-beta-laktamaasiproteiini, tunnettu siitä, että sillä on yleinen kaava: 5 NH2 - K - T - E - ΔΒΙ_ - COOH jossa K on lysiini, 10. on treoniini, E on glutamiinihappo, ja ABL on aminopäästä typistetty metallo-beta-laktamaasi-proteiini, joka on typistetty siten, että E - ABL:n aminopää vastaa sekvenssin nro 1 aminohappoja 12-15, sillä lisäyksellä, että sekvenssin nro 1 kohdassa +13 oleva 15 aminohappo voi olla joko T (treoniini) tai A (alaniini).

2. Eristetty nukleotidimolekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää nukleotidisekvenssin, joka pystyy Ilmentämään patenttivaatimuksen 1 mukaista metallo-beta-laktamaasiproteiinia.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen nukleotidimolekyyli, tunnet- , 20 t u siitä, että se käsittää sekvenssin nro 2 perättäiset nukleotidit 94 - 756.

(* 4. Ekpressiovektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaa- ί V timuksen 2 mukaisen nukleotidimolekyylin.

5. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se pystyy ilmentämään patent- ·.·*: tivaatimuksen 4 mukaisen vektorin koodaamaa metallo-beta-laktamaasiprote- : :*: 25 iinia. ··· ·1·

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, • · · että se on Bacillus spp., erityisesti B. Hcheniformis tai B. subtilis.

7. Modifioitu metallo-beta-laktamaasiproteiini, tunnettu siitä, että • · · sillä on yleinen kaava: **:*’ 30 NH2 - E - ABL - COOH • M • · • * * jossa t I"!, E on glutamiinihappo, ja ·"* 35 ABL on aminopäästä typistetty metallo-beta-laktamaasi-proteiini, jo ka on typistetty siten, että E - ABL:n aminopää vastaa sekvenssin nro 1 amino- 119190 happoja 12 - 15, sillä lisäyksellä, että sekvenssin nro 1 kohdassa +13 oleva aminohappo voi olla joko T (freoniini) tai A (alaniini).

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen metallo-beta-laktamaasiproteiini, tunnettu siitä, että se kuuluu metallo-beta-laktamaasien alaryhmään 61.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen metallo-beta-laktamaasiproteiini, tunnettu siitä, että typistetty beta-laktamaasi on peräisin Bacillus spp:stä ja erityisesti B. cereus-bakteerista.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen metallo-beta-laktamaasiprote-iini, tunnettu siitä, että E - ABL on saatu poistamalla kypsän metallo-beta- 10 laktamaasin aminopään ensimmäiset yksitoista aminohappoa.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen metallo-beta-laktamaasiprote-iini, tunnettu siitä, että sekvenssi E - ABL on vähintään 80-prosenttisesti identtinen tai vähintään 90-prosenttisesti identtinen sekvenssin nro 3 perättäisten aminohappojen 6 - 221 kanssa.

12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen metallo-beta-laktamaasiprote- iini, tunnettu siitä, että E - ABL on sekvenssin nro 1 omaavan metallo-beta-laktamaasin tai sen beta-laktamaasiaktiivisuutta omaavan variantin tai fragmentin typistetty muoto.

13. Menetelmä modifioidun metallo-beta-laktamaasiproteiinin val- 20 mistamiseksi, tunnettu siitä, että viljellään patenttivaatimuksen 5 mukaista isäntäsolua olosuhteissa, jotka sallivat sellaisen beta-laktamaasin ilmentämi- .. sen, jolla on yleinen kaava • · · t · • · ···:’ nh2-k-t-e-abl-cooh • · : 25 :.:V jossa t*”: K on lysiini, T on treoniini, E on glutamiinihappo, ja ,···. 30 ABL on aminopäästä typistetty metallo-beta-laktamaasi-proteiini, jo- ka on typistetty siten, että E - ABL:n aminopää vastaa sekvenssin nro 1 ami-nohappoja 12-15, sillä lisäyksellä, että sekvenssin nro 1 kohdassa +13 oleva *·· aminohappo voi olla joko T (treoniini) tai A (alaniini), ja suoritetaan translaation jälkeinen modifikaatio, jonka tuloksena on 35 modifioitu metallo-beta-laktamaasi, jolla on yleinen kaava: • · ··· 2β 119190 NHz-E-ABL-COOH jossa E ja ABL ovat edellä määritellyt, ja valinnaisesti eristetään ja puhdistetaan translaation jälkeen modifioi-5 tu proteiini.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metallo-beta-laktamaasiproteiini ilmennetään muodossa, joka sisältää signaalisekvenssin, jolloin proteiini erittyy isäntäsolusta.

15. Patenttivaatimuksen 13 tai 14 mukainen menetelmä, tunnet-10 t u siitä, että proteiini tuotetaan Bacillus spp:ssä ja erityisesti B. licheniförmis- tai B-subtilis-bakteerissa.

16. Farmaseuttinen koostumus, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 7 mukaista modifoitua metallo-beta-laktamaasiproteiinia.

17. Patenttivaatimuksen 7 mukainen modifioitu metallo-beta-lakta-15 maasiproteiini käytettäväksi lääkeaineena.

18. Patenttivaatimuksen 7 mukaisen modifoidun metallo-beta-lakta-maasiproteiinin käyttö valmistettaessa lääkeainetta beta-laktaamiantibioottien suolistossa aiheuttamien haittavaikutusten poistamiseksi.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että 20 beta-laktaamiantibiootti valitaan ryhmästä joka koostuu kefalosporiineista, kar- bapeneemeistä ja penisilliineistä. • · «· · • · · • · • · s·· ···♦ * · • · · • · · • at · • · · a · « a·· ··· • « • * ··· • · a a · ♦ m · * · *·· • · • · ··· • · * · « ··· • t t · * ♦ ··· ··· • aa· ··· • · • * ··♦ 27 119190