CN103014148B - 一种rna的等温检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种RNA的定性和定量等温检测方法，本方法的检测方法是采用脱氧核酶(DNAzyme)定点剪切RNA后经链置换等温扩增技术(SDA)进行扩增，通过检查SDA产物中释放出的报告基团G-四聚体来进行定性或定量检测。该方法能够迅速、简便、并且高灵敏特异地检测微量的RNA，包括mRNA和miRNA，同时降低被污染的危险性。

Description

一种RNA的等温检测方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及RNA扩增分析检测，更具体地说，本发明涉及一种利用链置换等温扩增RNA，释放报告体系的检测方法。

背景技术

核酸分子体外扩增是生物技术研究的重要手段，不仅可以扩增和分离目的基因，在临床诊断、基因突变检测、法医鉴定等方面也有重要用途。聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是使用最为广泛的核酸扩增技术，它需要反复的热变性以解开DNA双链，在应用上依赖于高质量的热循环仪实现变性、退火、延伸三个步骤，造成温度控制麻烦。随着科学发展和研究目的的不同，自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术，包括链置换扩增(SDA)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(NASBA)、环介导的等温扩增(LAMP)等。而链置换扩增反应具有高敏感度、高特异性以及操作简便等特性，已逐渐被应用。

1992年，美国Becton Dickinson研究中心的Walker等发表了关于链置换扩增技术(Stra nd Displacement Am plification SDA)的研究报道，标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生。SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将双链DNA打开缺口，DNA聚合酶继之延仲缺口的3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。该方法操作简单，有高敏感度、高特异性以及成本低的特点。

酶是具有催化功能的生物大分子，具有高度的底物专一性和很高的催化效率。过去人们一直认为酶只能由蛋白质组成，但1981年T.R.Cech等发现原生动物四膜虫的rRNA具有自我剪切功能，揭示了核酸也具有催化生物反应的能力，提出了核酶的概念。1994年，Breaker利用体外筛选技术发现，有的单链DNA分子同样具有酶活性，这些具有催化功能的DNA分子称为脱氧核酶(Deoxyribozyme，DNAzyme)。

1997年，SANTORO等利用体外筛选技术(SELEX)从10¹⁴个随机DNA文库中筛选出两条高效、通用的脱氧核酶：10-23型DNAzyme。该酶的功能类似于一种序列特异性限制性核酸内切酶，其活性中心区为“10-23结构(10-23motif)″，由15个脱氧核糖核苷酸构成。活性中心的两端分别为一长7-9nt的臂，用于底物RNA的结合，通过Waston-Crick碱基配对与底物序列特异性结合配对，其序列可以根据底物RNA的不同而改变，切割位点位于RNA分子上未配对的嘌呤和配对的嘧啶之间的磷酸二酯键。10-23结构脱氧核酶的切割活性其中嘌呤可以不形成碱基配对，而嘧啶则需要与脱氧核酶形成碱基配对。与核酶相比，10-23DNAzyme在温度及离子强度等相同的情况下，其稳定性约为RNA的10⁹倍，不仅对靶RNA具有特异剪切活性，而且具有相对分子质量小、化学性质相对稳定、不易受核酸酶降解、易于合成和纯化等优点。

随后发现了各种各样的DNAzyme，它们具有着不同催化活性，如自我磷酸化活性、RNA水解活性、过氧化物酶活性等。G-四链体(G-qudruplex)的概念最早是在1962年由Gellert等学者提出来的。1991年Zalller课题组报道了在K⁺存在的条件下，折叠成G-四链体结构的端粒DNA不能成为端粒酶的作用底物，并能够抑制端粒酶对端粒的延伸。Dipankar Sen随后又发现能够折叠成G-四聚体的富含鸟嘌呤的单链DNAzyme。这种DNAzyme与卟啉铁(hemin)或者卟啉铁类似物结合后，具有类似于过氧化物酶的活性，能催化H₂O₂将显色底物(ABTS^2-)等氧化成有色物质，因此可以直接通过颜色变化来检测核酸。

实时荧光定量PCR是在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针，常用的荧光染料例如SYBR Green I能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。而链置换等温扩增技术最终产生大量的单链DNA，三苯甲烷染料的化学结构很容易振动而不稳定，单独存在时发出的荧光很弱。当三苯甲烷与四聚体结合时，由于四聚体能稳定三苯甲烷的结构，因此荧光信号得到大大增强，所以三苯甲烷具有开发为G-四聚体荧光探针的潜力。

如何进一步拓展已有等温扩增技术和DNAzyme在生命科学与医学中的应用范围，如何进一步改进或研制新的简单快速，既可定性又可实时定量，并同时适用于mRNA和miroRNA的检测方法，仍然是检测RNA的重大课题。

发明内容

本发明提供一种RNA的检测与RNA等温扩增的新方法，该方法不需要温度的变化，能够迅速、简便、并且高灵敏专一地能够对RNA进行定性和定量的检测方法，尤其适用于mRNA和miRNA。

实现以上目的的技术方案如下：

一种RNA的等温检测方法，包括以下步骤：

a)基于剪切RNA的DNAzyme，实现对RNA的定点剪切；

b)被剪切的RNA在多聚核苷酸激酶，DNA聚合酶和限制性内切酶作用下发生三个链置换等温扩增循环；

其中，经第一个链置换等温扩增循环释放出一系列的DNA寡核苷酸小片段trigger；然后与待测样品中含有的能产生G-四聚体的互补的寡核苷酸探针结合发生第二个链置换等温扩增循环释放出G-四聚体；此G-四聚体与具有剪切RNA功能的DNAzyme结合发生第三个链置换等温扩增循环又释放出小片段trigger，由此再引发第二个链置换等温扩增，释放出G-四聚体，此G-四聚体又引发第三个链置换等温扩增，然后第二和第三两个循环往复进行，从而最终置换下大量的G-四聚体；

c)根据释放出的G-四聚体的性质，可作为定性报告基团或定量报告基团，对RNA进行定性或实时定量检测。

具体地，本发明方法包括三个步骤。首先，采用剪切RNA的DNAzyme对目的RNA进行剪切。然后，被剪切的RNA在多聚核苷酸激酶，DNA聚合酶和限制性内切酶作用下引发三个链置换等温扩增循环：以被剪切的RNA为引物，以剪切RNA的DNAzyme为模板，发生第一个链置换等温扩增(SDA)，最终产生一系列的DNA寡核苷酸小片段trigger，同时，待测样品中还含有一能产生G-四聚体的互补的寡核苷酸探针，该探针能与DNA寡核苷酸小片段结合，由此触发第二个SDA扩增，释放出大量的G-四聚体，该G-四聚体包含有一小段非富含G的一段核苷酸序列，此小段核苷酸序列可与剪切RNA的DNAzyme的部分催化中心的序列互补，从而触发第三个SDA扩增反应，又可释放出小片段trigger，由此再引发第二个链置换等温扩增，释放出G-四聚体，此G-四聚体又引发第三个链置换等温扩增，然后第二和第三两个循环往复进行，从而最终置换下大量的G-四聚体。由此将RNA为引物的扩增转变为以DNA寡核苷酸小片段为引物的的扩增，避免了RNA容易降解的缺点，同时实现高效的扩增效率。经三个SDA循环扩增后，产生大量的G-四聚体。最后，根据不的G-四聚体具有不同的性质，本发明设计了两种不同的探针序列，最终分别产生两种不同的G-四聚体，分别是具有过氧化物酶活性的DNAzyme和可与三苯甲烷结合产生荧光的D NAzyme，来进行定性或实时定量检测。

经三个SDA循环扩增后，产生大量的G-四聚体。本发明通过设计不同的探针序列，可产生不同的G-四聚体，分别是具有过氧化物酶活性的DNAzyme和可与三苯甲烷结合产生荧光的DNAzyme。

本发明所述的方法中，所述的剪切RNA的DNAzyme与RNA被剪切后的末端碱基完全互补配对，包括催化活性的环部分和与RNA互补配对的结合臂两部分。

本发明方法中涉及的探针由3’到5’包括与小片段trigger互补的序列、限制性内切酶识别序列、与G-四聚体互补的序列和与剪切RNA的DNAzyme的部分催化中心相同的序列。

本发明方法中涉及的G-四聚体是指富含鸟嘌呤核苷酸(dG)的DNA片段G碱基通过Hoogsteen配对的氢键相互作用形成的四链螺旋DNA结构。

本发明方法中涉及的作为定性报告基团的G-四聚体是具有过氧化物酶活性的DNAzyme，其获得的结果是肉眼可见的一种报告基团；作为定量报告基团的G-四聚体是可与一种染料结合产生荧光的DNAzyme，是一种可以获得定量结果的报告基团。

优选地，上述染料是一种三苯甲烷类有机物质，例如优选是孔雀石绿。

本发明的SDA反应体系中，剪切RNA的DNAzyme和探针浓度在0.1μM-0.5μM、序列设计有一定的需求。剪切RNA的DNAzyme包括催化活性的环部分和与RNA互补配对的结合臂两部分，根据待检测的RNA设计结合臂，通过Waston-Crick碱基配对与底物序列特异性结合配对，将剪切RNA的DNAzyme的催化性碱基环固定到RNA底物分子上，催化RNA特定部位的切割反应，其序列可以根据底物RNA的不同而改变。剪切RNA的DNAzyme要满足条件是必须与RNA被剪切后的末端碱基互补配对。

本发明所涉及的DNAzyme是具有催化功能的DNA序列。目前所发现的DNAzyme分为5类：切割RNA的DNAzyme，切割DNA的DNAzyme，具有激酶活性的DNAzyme，具有连接酶活性的DNAzyme，与配体结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme。

本发明方法中所述的多聚核苷酸激酶是具有水解2’，3’-环状磷酸基团的核苷酸激酶，DNA聚合酶是常温的具有链置换能力且无外切核酸酶活性的聚合酶，限制性内切酶是能够识别双链特异位点，并剪切单链特异位点的内切酶。优选地，多聚核苷酸激酶是T4多聚核苷酸激酶(PNK)；DNA聚合酶是Klenow exo-DNA聚合酶或Bsm DNA聚合酶；限制性内切酶是Nb.Bpu10I。

本发明所述的具有过氧化物酶活性的DNAzyme可与氯铁血红素(Hemin)结合、能够催化H₂O₂氧化ABTS^2-，使反应液由无色变为绿色。此时可直接用肉眼观察颜色变化，从而达到定性检测RNA的目的。

在本发明用与Hemin结合具有过氧化物酶活性的DNAzyme检测时，SDA结束后要调节pH至7.6，94℃加热1min，此步骤有利于避免探针封闭G-四聚体，加热变形使探针释放被封闭的G-四聚体。此步骤增加灵敏度。然后加入Hemin和ABTS^2-，室温放置5min，再加H₂O₂观察颜色变化。此步骤使G-四聚体充分与Hemin结合，使阴性对照的信号更低，从而使检测结果更加灵敏。

为提高灵敏度，本发明定性实验的显色反应中优选的pH是7.6。

本发明所述的定量检测是指在反应体系中加入一定浓度的三苯甲烷染料，利用另一探针经SDA扩增产生的DNAzyme可结合三苯甲烷染料产生荧光的性质，使随着扩增反应的进行，信号逐步累积实现实时监测整个扩增进程，最后通过标准曲线对未知的RNA进行定量分析。本发明通过检测单链DNA实现定量检测RNA的目的，避免了由于引物二聚体的存在所造成的假阳性信号。将三苯甲烷染料和G-四聚体开发作为报告基团应用到实时荧光检测中，具有较强的创新性，并且降低了实时检测的成本，操作方便，灵敏高。

为进一步增强灵敏度，本发明优选的三苯甲烷染料是孔雀石绿(Malachite green，MG)。

本发明的方法适用于检测的RNA是含有AU或GU的RNA，并且AU和GU在RNA中的出现频率是大约每8个碱基就会出现一次，因此检测RNA的范围比较广。RNA可以是合成的，体外转录的或者从样品中提取的。样品可以是任何来源，包括病毒的，细胞提取的，环境样品，来自工业过程的样品、微生物样品、组织或体液样品等。

此外，由于剪切RNA的DNAzyme的特性，检测不同的RNA要设计相应的DNAzyme，本发明具有很高的专一性。

本发明的一大特征是反应液在优选出的37℃或39℃恒温条件下即可进行。由于采用链置换等温扩增RNA能够在恒温下进行，所以不必周期性地上下改变温度，从而可以采用简便的装置实现RNA的定性和定量的检测。

另外，本发明定量检测可以在一个反应容器内采用一步法实施完成，使得操作进一步简便化，迅速化，同时降低了被污染的危险性。

附图说明

图1是链置换扩增被剪切的RNA原理图；

如图所示，首先是剪切RNA的DNAzyme在特定位点剪切RNA，而后是进行链置换等温扩增RNA产生一系列的DNA寡核苷酸小片段trigger，引发一系列的SDA扩增，最终产生大量的报告基团。通过报告基团的性质达到检测RNA的目的。

图2是RNA被剪切后的聚合反应图；

其中A表示10-23DNAzyme(Gerald，1997)剪切RNA产生2’，3’环状磷酸基团，但由于末端碱基的不配(A-A)对无延伸反应的出现；B表示改良的DNAzyme(即剪切末端配对A-T)出现延伸反应。

图3是本方法的RNA检测原理图。

图4中A表示孔雀石绿结合G-四聚体作为报告体系的示意图；B表示实时定量检测梯度稀释的Flag-RNA结果示意图；C表示实时定量检测结果的标准曲线图。

图5是专一定量检测Let-7a结果图。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但并非是对本发明的技术方案的限制，本领域技术人员应该理解，依然可以对发明进行修改或等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的保护范围之中。

实施例1：以RNA为引物的链置换扩增实验

(1)采用剪切RNA的DNAzyme剪切RNA后的延伸反应

在本实验中首先使用一种DNAzyme，在反应液10μL体系中，包含50nm Flag-RNA，2μM DNAzyme，10mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，10mM MgCl₂，和0.1mg/ml BSA，0.5unit/μl PNK和0.4unit/μl Bsm DNA聚合酶，37℃下反应1h后，用变性的聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)分析，无延伸条带出现。在此采用改良的DNAzyme，即RNA被剪切后的末端碱基与改良的DNAzyme(fCat)互补配对。经以上相同反应条件，出现延伸条带。其中PNK的作用是水解RNA的剪切末端的2’，3’环状磷酸基团，使得RNA被剪切后可作为引物进行延伸反应。如附图2所示。

在反应液中加入一定浓度的Flag-RNA，0.5μM fCat，0.25unit/μl PNK，10mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，10mMMgCl₂，和0.1mg/ml BSA，补加ddH₂O补加至10μL。

1个阴性对照管，只不加入Flag-RNA，其余相同。均置于37°C下反应2小时30分钟。

Flag-RNA(SEQ ID NO1)：

5’-GGAGGACGAAAUGGACUACAAGGACGAUGACGAUAAGCAGCUGCGUAACUCUAAAAA-3’

10-23(SEQ ID NO2)：

5’-CTT ATC GTC A GGC TAG CTA CAA CGA C GTC CTT GTAGTC CAT-3’

fCat(SEQ ID NO3)：

5’-CAACAGCGACCCTCAGCCTTATCGTCAGGCTAGCTACAACGTCGTCCTTGTAGTCCAT-3’

(2)以(1)制备的被剪切的RNA为引物，进行链置换扩增反应

由于不同的G-四聚体具有不同的性质，所以在定量和定性检测时，本发明采用产生不同的G-四聚体序列的探针。定性检测的探针Ta由3’到5’包括与以RNA为引物扩增剪切下的第一段寡核苷酸序列(trigger)互补的序列，限制性内切酶识别序列，与具有过氧化物酶活性的PW-17互补配对的序列和与fCat的部分催化中心相同的序列。如附图3所示。

Ta(SEQ ID NO4)：

5’-CTTATCGTCAAGCTAACTATTTCCCAACCCGCCCTACCCTCAGCCAACAGCGACCCTCA-3’

在(1)反应液中加入0.25μM探针Ta(定性探针)，dNTPs(250μm)，Nb.Bpu10I(0.125UmL/μl)，Klenow exo-polymerase(0.125U m L/1)，补加dd H₂O补加至20μL，置于37℃下反应1h。

(3)扩增产物的定性检测

一个定性检测的阴性对照管1个，只含有ddH₂O。

反应管在94℃变性1min，阴性对照管和反应管均加入1.7μlTris-HCl(pH7.3)，hemin(1.8μM)，ABTS^2-和(2.1mM)，室温放置5min，H₂O₂(2.1mM)。用数码相机记录显色结果。其中94℃加热1min，有利于避免探针封闭G-四聚体，以增加灵敏度。然后加入Hemin和ABTS^2-，室温放置5min，使G-四聚体充分与Hemin结合，再加H₂O₂观察颜色变化。有利于使2个阴性对照管的信号更低，从而使检测结果更加灵敏。

其中出现的显色试剂的中英文全称如下表1所示。

表1显色试剂中英文全称

(4)定性检测结果

在梯度稀释的Flag-RNA浓度下，由高到低的浓度呈现逐渐减弱的颜色变化趋势。当浓度是1fmol，仍然与空白对照管有肉眼可见的区别。说明本发明方法具有较高的灵敏度。

实施例2：孔雀石绿结合Hum21(能与染料结合产生荧光的具有G-四聚体结构的DNAzyme)开发为定量报告体系实验

本发明的定量探针Tb由3’到5’包括与trgger互补的序列，限制性内切酶识别序列，与可与孔雀石绿结合产生荧光的hum21互补配对的序列和与fCat的部分催化中心相同的序列。当引物与Tb结合，发生连置换扩增，从而产生大量的Hum21，利用此G-四聚体与孔雀石绿结合产生荧光的性质，随着信号的积累达到实时的检测。因此，说明孔雀石绿结合Hum21可开发作为定量报告体系。

反应液20μL，包括10mM Tris-HCl，pH8.5，100mM KCl，10mM MgCl₂，0.01mg/ml BSA，dNTPs(250μM)，限制性内切酶Nb.Bpu10I(0.17unit/μl)，Bsm DAN聚合酶(0.17unit/μl)，孔雀石绿(15μMol)，0.25μMol Tb，0.125μMol trigger，补加ddH₂O至20μL体系。

1个阴性对照管：不加trigger的孔雀石绿的阴性对照管

分别做两重复，置于实时荧光定量PCR仪中(4通道，激发在620-650nm，发射在675-690nm)，反应程序为：39℃，70个循环，每隔1min读一次数。结果见附图4。

实施例3利用DNAzyme和定量探针定量检测RNA的实验

对于定量检测RNA，本发明采用一步法在一个反应容器内实施，使得操作进一步简便化，迅速化，同时降低了被污染的危险性。在一步法反应中，首先改良的DNAzyme(fCat)对RNA进行剪切，用PNK的作用是水解RNA的剪切末端的2’，3’环状磷酸基团，进而发生连置换扩增RNA。由定量报告体系达到检测RNA的目的。

反应液20μL，10mM Tris-HCl，pH7.0，100mM KCl，10mMMgCl₂,0.1mg/ml BSA，dNTPs(250μM)，Nb.Bpu10I(0.17unit/μl)，Bsm polymerase(0.17unit/μl)，PNK(0.08unit/μl)，孔雀石绿(15μmol)，0.25μM fCat，0.25μM Tb，一定浓度的Flag-RNA。

1个阴性对照管：只是不加入Flag-RNA，其余相同。

分别做两重复，置于实时荧光定量PCR仪中(Chanel4，Excitation600-640nm，Emission666-740nm.；PikoREAL，Thermo，USA)中。反应程序为：39℃，120个循环，每隔1min读一次数。结果见，检测结果显示此方法对梯度稀释的Flag-RNA有很好的区分度，并且成良好的线性关系，R²＝0.969。

实施例4定性和定量检测Let-7家族的RNA

化学合成Let-7家族的RNA(序列如表2所示)，以Let-7为例，设计能剪切Let-7的改良的DNAzyme(Let-7a-Cat)，定性检测方法同实施例1，定量检测方法同实施例3。检测结果显示此方法对Let-7a类似物能很好的检测，即使类似物与Let-7a存在很细微的差别，甚至一到两个碱基的不同用此方法均能区别开。结果如附图5所示。

表2Let-7家族的RNA

实施例5考察专一性实验

取单链DNA，双链DNA和HepG2细胞中的全RNA，检测方法同实施例1。

2个阳性对照管：含Flag-RNA的，含Flag-RNA和HepG2细胞中的全RNA。

结果显示单链DNA，双链DNA和HepG2细胞中的全RNA均显示无色，只有在Flag-RNA存在的情况下，才有颜色反应的产生。说明该方法具有很高的专一性。

Claims (9)

1.一种RNA的等温检测方法，包括以下几个步骤：

a)基于剪切RNA的DNAzyme，实现对RNA的定点剪切；

b)被剪切的RNA在多聚核苷酸激酶，DNA聚合酶和限制性内切酶作用下发生三个链置换等温扩增循环；

其中，经第一个链置换等温扩增循环释放出一系列的DNA寡核苷酸小片段trigger；然后与待测样品中含有的能产生G-四聚体的互补的寡核苷酸探针结合发生第二个链置换等温扩增循环释放出G-四聚体；此G-四聚体与具有剪切RNA功能的DNAzyme结合发生第三个链置换等温扩增循环又释放出小片段trigger，由此再引发第二个链置换等温扩增，释放出G-四聚体，此G-四聚体又引发第三个链置换等温扩增，然后第二和第三两个循环往复进行，从而最终置换下大量的G-四聚体；

c)根据释放出的G-四聚体的性质，可作为定性报告基团或定量报告基团，对RNA进行定性或实时定量检测;

其中,所述的所述的RNA包括mRNA和miRNA，并且是含有AU或GU的RNA，并且AU和GU在RNA中的出现频率是大约每8个碱基就会出现一次。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的剪切RNA的DNAzyme与RNA被剪切后的末端碱基完全互补配对，包括催化活性的环部分和与RNA互补配对的结合臂两部分。

3.根据权利要求1的方法，其中所述的多聚核苷酸激酶是具有水解2’,3’-环状磷酸基团的核苷酸激酶，DNA聚合酶是常温的具有链置换能力且无外切核酸酶活性的聚合酶，限制性内切酶是能够识别双链特异位点，并剪切单链特异位点的内切酶。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的多聚核苷酸激酶可以是T4多聚核苷酸激酶(PNK)，DNA聚合酶可以是Bsm DNA聚合酶，限制性内切酶可以是Nb.Bpu10I。

5.根据权利要求1的方法，其中所述的探针由3’到5’包括与小片段trigger互补的序列、限制性内切酶识别序列、与G-四聚体互补的序列和与剪切RNA的DNAzyme的部分催化中心相同的序列。

6.根据权利要求1的方法，其中所述的G-四聚体是指富含鸟嘌呤核苷酸(dG)的DNA片段G碱基通过Hoogsteen配对的氢键相互作用形成的四链螺旋DNA结构。

7.根据权利要求1的方法，其中所述的作为定性报告基团的G-四聚体是具有过氧化物酶活性的DNAzyme，其获得的结果是肉眼可见的一种报告基团。

8.根据权利要求1的方法，其中所述的定量报告基团的G-四聚体是可与一种染料结合产生荧光的DNAzyme，是一种可以获得定量结果的报告基团。

9.根据权利要求8的方法，其中所述的染料是一种三苯甲烷类有机物质—孔雀石绿。

Images