CN107991274B - 一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用 - Google Patents

一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用。该比色传感器包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶，铅离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；所述信号放大元件包括等温扩增体系，等温扩增体系包括扩增模板；所述信号转换元件包括硫代黄色素。本发明比色传感器基于铅离子脱氧核酶、等温指数放大反应和G‑四链体液相传感技术，分子识别元件识别铅离子，并将产生扩增产物，扩增产物在硫代黄色素作用下，形成G‑四链体结构，通过检测荧光强度，计算得出铅离子浓度，简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐、成本低。

Description

一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用
技术领域
本发明属于金属离子检测技术领域，具体涉及一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用。
背景技术
铅是一种色泽光亮、质地柔软的重金属，在空气中极易氧化失去光泽，表面生成一层暗灰色的氧化物薄膜。由于具有良好的延展性、抗腐蚀性以及容易加工等特性，铅在工业生产中具有多种用途，常用于蓄电池、汽油防爆剂、建筑材料、焊接、陶瓷和玻璃制造等行业。
局部地区铅污染的主要原因是矿山开采和金属冶炼；空气中铅污染的主要来源是煤炭燃烧产生的烟尘废气；此外，据统计全世界每年约有40万吨烷基铅从汽车尾气中排出，城市生活产生的垃圾和固体废弃物中也含有大量的铅污染物。环境中铅多以Pb2+及其化合物的形式存在，近年来，铅污染已对生态环境、食品安全、人类健康以及工农业生产的可持续发展造成了严重影响。
铅对人体造成的毒害作用是多***、全身性和不可逆性的。人体一旦摄入过量的铅引发铅中毒，即使通过治疗将体内的铅含量降低到正常水平，铅中毒导致的不良症状也无法消除并将伴随终生，具有不可逆转性。铅中毒的症状主要表现为：损害神经***，导致运动和感觉失常；紊乱消化***，出现腹痛、便秘、恶心和食欲不振等症状；破坏骨髓造血***，造成低色素贫血或溶血性贫血；累及心血管***，引起高血压和心律失常等症状；影响肾脏和生殖***，降低男女的生殖功能；摧毁免疫***，减弱机体的免疫能力。
由于铅污染具有强毒性、持久性、易迁移性和高度生物富集性等特点，因此近年来铅污染逐渐引起了世界各国的广泛关注。为防止重金属铅污染加剧，目前我国已对多种环境介质和污染物排放源中的铅含量做出了明确规定。国家标准《大气污染物综合排放标准》限定工业废气中铅的最高排放浓度为0.9mg/L；《污水综合排放标准》限定工业污水中铅的最高排放浓度分别为1.0mg/L；《危险废物鉴别标准浸出毒性鉴别》限定固体废弃物中铅的最高浸出浓度分别为3mg/L。考虑到铅污染物的微量剧毒性，国家标准《生活饮用水卫生标准》还对居民生活饮用水中的铅含量做了较为严格的限定，规定饮用水中铅、汞的最高检出含量分别为0.01mg/L；此外，国家标准《食品中污染物限量》还对众多种类食品中铅的最高检出含量做了较为具体的规定。以上限量标准基本与美国、欧盟以及世界卫生组织的标准相接轨，部分甚至严于西方国家的标准。
目前，检测铅的分析方法主要有：(1)依靠仪器分析的紫外可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子发射光谱法和原子荧光光谱法等，这些方法灵敏度高、选择性好、检测结果准确可靠，但仪器价格昂贵、检测过程繁琐、需要专业的技术人员操作等，因此分析成本偏高，难以普及应用；(2)依靠肉眼进行判断的比色法，如二硫腙比色法、银盐比色法、纳米金比色法等，这些方法操作简单，不需使用大型的仪器设备，但是检测结果的灵敏度有限，选择性较差；(3)适应现场实时检测的快速分析法，如快速检测试纸条、酶联免疫法、生物化学传感器等，这些方法操作简单、成本低廉，而且能实现铅的现场快速检测，但检测方法的检出限较高，只能实现半定量或定性检测。因此，发展操作简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好的新型检测方法实现铅的快速、准确检测，加强环境中铅污染的实时监测，建立铅污染的综合预防机制至关重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提出一种基于铅的功能核酸的比色传感器及其应用。具体技术方案如下：
一种基于铅的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，
所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶；所述铅离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，所述等温扩增体系包括扩增模板；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATG TCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC；
所述信号转换元件包括硫代黄色素。
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物及超纯水；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl，10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
所述传感器在铅离子检测中的应用。
本发明还提供一种检测铅离子的方法，包括如下步骤：
制备铅离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度值，通过上述标准曲线计算铅离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在铅离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铅离子溶液，制备铅离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATG TCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)测定步骤(4)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随铅离子浓度变化的标准曲线。
步骤(1)的步骤为：将铅离子脱氧核酶的底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测铅离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到铅离子脱氧核酶切割产物。
步骤(3)的步骤为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
步骤(4)中反应温度为25℃，反应时间为20min。
本发明还提供一种检测铅离子的试剂盒，包括铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述铅离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铅离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显示体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATG TCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC。
所述缓冲液为终浓度25mM HEPES buffer，pH 7.6；所述终止液为0.2M EDTA，2MNaCl，0.5M Tris；所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
一种铅离子脱氧核酶，所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATG TCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT。
本发明的有益效果为：
1、本发明提供了一种基于铅的功能核酸的比色传感器和铅离子检测方法，铅离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组成，形成特定的二级结构；痕量铅离子能够特异性识别铅离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链，产生切割产物；有且只有切割产物存在时，促发等温指数放大反应(EXPAR)，产生信号的放大和转化，并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列，该序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，转化成可视化的信号，可以进行定性的判断。
2、经过信号的放大和转化，通过手持式光谱检测仪就可以进行定量检测铅离子，具备简便快速、灵敏度高、特异性高、耐高盐以及成本低等优点，并可用于环境中铅离子的现场检测。
3、本发明传感器能够抵抗高盐的干扰，实现高盐环境中锌离子的检测，并可保持较高的特异性和灵敏度。
附图说明
图1为铅离子脱氧核酶的制备及切割产物的验证。Lane1-Marker；Lane 2-阴性对照：脱氧核酶底物链；Lane 3-阴性对照ⅱ：脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链，无铅离子；Lane4,5,6-阳性样品：在脱氧核酶底物链与脱氧核酶酶链的体系中分别添加15uM、30uM、45uM的乙酸铅。
图2为扩增产物的变化图。Lane1-Marker；Lane 2-扩增模板；Lane 3-阳性样品；Lane4-阳性对照：扩增产物。
图3为铅离子浓度的标准曲线。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明。实施例中所述实验材料如无特殊说明均可通过商业途径获得，实验方法如无特殊说明均为常规方法。
本发明基于铅离子脱氧核酶、等温指数放大反应(EXPAR)和G-四链体液相传感技术，构建一种可视化传感器。铅离子脱氧核酶由底物链与酶链两条寡核苷酸链组，形成特定的二级结构；痕量铅离子能够特异性识别铅离子脱氧核酶，结合脱氧核酶的酶链，并激活脱氧核酶，切割脱氧核酶的底物链；有且只有切割产物存在时，促发EXPAR放大信号、并生成大量富含鸟嘌呤的寡核苷酸序列；该序列在硫代黄色素诱导下形成G-四链体结构，在425nm的激发光激发下发出荧光，最大发射波长在485nm，通过手持式光谱检测仪进行检测与定量。
实施例1：基于铅的功能核酸的比色传感器的构建
1、实验材料
4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，氯化钾，氯化钠，氯化镁，乙二胺四乙酸二钠，硫代黄色素，乙酸铅，尿素，Nt.BstNBI切刻内切酶，Bst DNA聚合酶等。
2、序列设计
设计并合成脱氧核酶底物链、脱氧核酶酶链和扩增模板。扩增模板中GACTC为Nt.BstNBI切刻内切酶识别序列，序列前四个碱基对处(C和A之间)即是合成链切割位点；铅离子切割位点在脱氧核酶底物链的rA之后。
Figure BDA0001448693670000081
3、构建方法
基于铅的功能核酸的比色传感器的构建方法，包括如下步骤：
(1)将4μL脱氧核酶底物链(10μM母液)与4μL脱氧核酶酶链(10μM母液)用缓冲液(终浓度为50mM HEPES，50mM NaCl，5mM MgCl2，pH7.26)稀释至35μL，95℃加热15min，然后缓慢将至25℃，大约耗时45min。加入5μL待测铅离子溶液，形成40μL体系，25℃孵育6min，加入5μL终止液(浓度为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris)，得到铅离子脱氧核酶切割产物。用20％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，结果如图1，证明铅离子脱氧核酶的制备与切割成功。
所述铅离子脱氧核酶切割产物的序列(5’-3’)为：GGAAGAGATG TCTGT。
(2)配制扩增反应体系
反应体系为30μL，由A部分和B部分组成。
A体系组成(24.2μL)
Figure BDA0001448693670000091
B体系组成(5.8μL)
Figure BDA0001448693670000092
本发明的“×”如无特殊限定，则为体积倍量。
本发明的“终浓度”无特殊限定，则为物质混合后的在总的反应体系的浓度。如1μM扩增模板母液6μL，终浓度为0.2μM，指的扩增模板在等温扩增体系中的浓度。
(3)A体系在55℃孵育5min后，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min；95℃保持10min，以终止反应，得到扩增产物。放入-20℃备用。利用20％的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证扩增产物，结果如图2。
所述扩增产物的序列(5’-3’)为：GGGTGGGTGGGTGGGT。
(4)将10μL扩增产物、50μL显色缓冲液和2μL硫代黄色素原液与38μL超纯水混匀，25℃反应20min，使扩增产物结合硫代黄色素形成G-四链体结构；
显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2。
硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合。
(5)用酶标仪设定激发波长425nm，激发步骤(4)的反应混合液，测定波长485nm下的荧光强度。
实施例2：铅离子的检测
待测铅离子溶液为醋酸铅溶液(NaNO3为溶解环境)，具体步骤如下：
(1)制备荧光强度随铅离子浓度变化的标准曲线
采用实施例1中3的构建方法，待测铅离子溶液选为醋酸铅溶液(1MNaNO3为溶解环境)，铅浓度取10pM，25pM，50pM，75pM，100pM，设定激发波长425nm，制备波长485nm下荧光强度(FL)随铅离子浓度变化的标准曲线(图3)，标准曲线为y＝28.762x+304.39，R2＝0.9998。
(2)采用实施例1中3的构建方法，酶标仪测定待测铅离子溶液的荧光强度值，代入标准曲线y＝28.762x+304.39，得到铅离子浓度。结果如表1.
表1
Figure BDA0001448693670000101
实施例3：一种检测铅离子的试剂盒
一种检测铅离子的试剂盒，包括铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
铅离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铅离子标准溶液和终止液；
等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
显示体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液。
脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATG TCTGT；
脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC。
缓冲液为终浓度25mM HEPES buffer，pH 7.6；
终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；
显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；
硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
所述Bst DNA聚合酶反应缓冲液：20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,50mM KCl,2mMMgSO4,0.1％吐温20，0.1％牛血清白蛋白，pH 8.8；
所述Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲液：100mM NaCl,50mM Tris-HCl，10mMMgCl2,300μg/ml海藻糖，pH 7.9。
Figure IDA0001549060350000011
Figure IDA0001549060350000021
Figure IDA0001549060350000031

Claims (9)

1.一种基于铅的功能核酸的比色传感器，包括分子识别元件、信号放大元件和信号转换元件，其特征在于，
所述分子识别元件包括铅离子脱氧核酶；所述铅离子脱氧核酶由底物链和酶链组成；
所述信号放大元件包括等温扩增体系，
所述信号转换元件包括硫代黄色素；
所述等温扩增体系包括A体系和B体系；
所述A体系包括：扩增模板、dNTPs、脱氧核酶切割产物及超纯水；
所述B体系包括：Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATGTCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC。
2.权利要求1所述传感器在铅离子检测中的应用。
3.一种检测铅离子的方法，其特征在于，包括如下步骤：
制备铅离子浓度和G-四链体功能核酸荧光强度关系的标准曲线；
按上述制备标准曲线的过程进行待测样品的检测，得到待测样品的G-四链体功能核酸荧光强度值，通过上述标准曲线计算铅离子的浓度；
其中，制备标准曲线的步骤包括：
(1)在铅离子脱氧核酶的底物链和酶链中加入不同浓度铅离子溶液，制备铅离子脱氧核酶切割产物；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATGTCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
(2)将扩增模板，dNTPs，切割产物和超纯水混合均匀，制备A体系；将Bst DNA聚合酶及其缓冲溶液，Nt.BstNBI切刻内切酶及其缓冲溶液混合均匀，制备B体系；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC；
(3)A体系先进行孵育，然后与B体系迅速进行混合，孵育扩增，终止反应后得到扩增产物；
(4)将扩增产物、硫代黄色素原液、显色缓冲液与超纯水混匀并反应，形成G-四链体结构；
(5)测定步骤(4)的反应混合液的荧光强度，得到荧光强度随铅离子浓度变化的标准曲线。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的步骤为：将铅离子脱氧核酶的底物链和酶链用缓冲液稀释，95℃加热15min，然后缓慢降至25℃；加入待测铅离子溶液，25℃孵育6min，加入终止液，得到铅离子脱氧核酶切割产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(3)的步骤为：A体系于55℃孵育5min，然后与B体系迅速进行混合，55℃孵育扩增20min，95℃保持10min以终止反应。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(4)中反应温度为25℃，反应时间为20min。
7.一种检测铅离子的试剂盒，其特征在于，包括铅离子脱氧核酶体系、等温扩增体系和显示体系；
所述铅离子脱氧核酶体系包括底物链、酶链、缓冲液、铅离子标准溶液和终止液；
所述等温扩增体系包括扩增模板、dNTPs、超纯水、Bst DNA聚合酶、聚合酶反应缓冲溶液、Nt.BstNBI切刻内切酶和Nt.BstNBI切刻内切酶反应缓冲溶液；
所述显示体系包括：硫代黄色素原液和显色缓冲液；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATGTCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT；
所述扩增模板的序列(5’-3’)为：ACCCACCCACCCACCCGAGTCAGTTACAGACATCTCTTCC。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液为终浓度25mM HEPESbuffer，pH 7.6；所述终止液为0.2M EDTA，2M NaCl，0.5M Tris；所述显色缓冲液的配方为：50mM Tris-HCl，50mMKCl，pH7.2；所述硫代黄色素原液由0.1mol硫代黄色素干粉与1mL显色缓冲液混合得到。
9.一种铅离子脱氧核酶，其特征在于，所述铅离子脱氧核酶由底物链与酶链组成；
所述脱氧核酶底物链的序列(5’-3’)为：ACTCACTAT rA GGAAGAGATGTCTGT；
所述脱氧核酶酶链的序列(5’-3’)为：ACAGACATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGT。
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