CN103014126A - 一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基及其制备方法，用于检验和药敏试验领域。其特征在于，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素8~12mg；天门冬素3.6g；磷酸二氢钾0.2g；蒸馏水加至1000ml。最佳优化配方制备方法为：取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；L-半胱氨酸及硫酸铜溶于百合水煮液中，混匀，定容，灭菌后分装。本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、凝固酶阴性葡萄球菌分离率高的特点。

Description

一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基及其制备方法

技术领域

本发明涉及医学检验领域，具体涉及一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基及其制备方法。

背景技术

葡萄球菌是临床较常见的感染菌，随着大量头孢菌素尤其是第三代头孢菌素等高效广谱抗菌药物的广泛使用，耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）在全球范围内不断增加，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）作为MRS和凝固酶阴性葡萄球菌（CNS）家族中的一员，其检出率和多重耐药性呈逐年增高趋势，已成为医院感染的主要病原菌之一。CNS为低毒力条件致病菌，感染后症状不典型，且呈现多重耐药现象，给临床诊断和治疗带来一定困难，高效可靠的检验方法已是必然需要。

目前CNS的测定方法为利用玻片法、试管法检测凝聚因子，但有10%～15%假阴性率，故而在复杂病例的诊断，或者进行CNS治疗药物敏感度筛查实验、药理实验、药效实验时，需要进行进一步的微生物培养。

所谓微生物培养是一种用人工方法使微生物生长繁殖的技术，而选择性选择性培养基是用来促进或抑制一定类型的生物体（如细胞或细菌等）而设计的选择性培养基，利用这种选择性培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

目前临床上普遍使用的葡萄球菌选择性培养基为甘露醇高盐琼脂（Manitol Salt Agar），用于金黄色葡萄球菌的选择性分离培养。培养基成分为：蛋白胨、鸡蛋蛋白液、D-甘露醇、氯化钠、酚红、琼脂。金黄色葡萄球菌菌落为黄色，大肠杆菌和沙门氏菌菌落为无色。但是，该种培养基并不能选择性培养凝固酶阴性葡萄球菌（CNS），其原因在于在目前的选择性培养基中金黄色葡萄球菌比凝固酶阴性葡萄球菌生长更快，很快覆盖了培养基，CNS无法生长。

一份2011年7月6日公开，公开号为102119221A名为《能够区分金黄色葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基》的发明专利（申请号为200980131422.X）公开了一种用于生长、检测、鉴定和/或计数金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的特异性培养基，所述培养基特征在于其包含至少一种磷脂酶C的荧光、显色或发光底物。该发明中实施例的基础培养基源自Baird-Parker + RPF 培养基和Ottaviani Agosti琼脂培养基 （OAA）。但该种培养基为鉴别培养基，即通过使用一种特异性底物而简单的辨认金葡菌。该发明并未提供CNS选择培养的任何信息。

发明内容

本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足，提供一种对凝固酶阴性葡萄球菌分离率高的选择性培养基。

本发明解决其技术问题的技术方案是：一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：

麦芽浸粉15g；

鸡蛋蛋白液150ml；

氯化钠5g；

枸橼酸镁0.5g；

琼脂15g；

假细锥甲素8~12mg；

天门冬素3.6g；

磷酸二氢钾0.2g；

蒸馏水加至1000ml。

优化方案中，每1000ml选择性培养基还含有硫酸铜5mg。

优化方案中，每1000ml选择性培养基还含有L-半胱氨酸0.1g。

优化方案中，每1000ml选择性培养基还含有浓度200g/L的百合水煮液200~300ml。

最优化方案中，每1000ml选择性培养基还含有硫酸铜5mg；L-半胱氨酸0.1g；浓度200g/L的百合水煮液200~300ml。

一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取百合加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得百合水煮液；

（2）取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；L-半胱氨酸及硫酸铜溶于步骤1所得百合水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

其中所述的麦芽浸粉、鸡蛋蛋白液提供碳氮源和能量；枸橼酸镁和磷酸二氢钾为缓冲剂，并可以抑制杂菌生长；天门冬素、L-半胱氨酸属氨基酸类，为营养剂；琼脂是选择性培养基的凝固剂；假细锥甲素对于金葡菌具有特异的抑菌作用，对于凝固酶阴性葡萄球菌无效；鸡蛋蛋白液含有各种多肽、脂肪、生长因子、激素等，这些物质对促进凝固酶阴性葡萄球菌的繁殖和生长都是很重要的因素，此外鸡蛋蛋白液还具有维持选择性培养基pH 值恒定的作用。铜离子属于重金属离子，在5mg/L这个浓度剂量下，沉积于金葡菌内部，导致胞壁消失或变薄，核糖体聚集成团块，最终导致细菌变形及破裂，呈现重金属源性损伤，而凝固酶阴性葡萄球菌对重金属的运输能力和渗透能力低于金葡菌，也即重金属的抗性较高，故而加入硫酸铜可以有效地抑制金葡菌生长。百合为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium brownii F.E.Brown var. viridulum Baker 或细叶百合Lilium pumilum DC. 的干燥肉质鳞叶，含有蛋白质、脂肪、淀粉、还元糖、维生素B1、B2、泛酸、维生素C、β-胡萝卜素等多种成分，可以提供能量代谢、细胞发育、新陈代谢因子，有助于促进凝固酶阴性葡萄球菌生长，尤其是重金属环境下菌落的生长。

本发明与现有技术相比较，具有检出可靠、凝固酶阴性葡萄球菌分离率高的特点。

具体实施方式

以下结合实际情况，对本发明的具体实施方式作详细说明。

实施例1，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素8mg；天门冬素 3.6 g；磷酸二氢钾0.2g；蒸馏水加至1000ml。制备方法：取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾溶于蒸馏水中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

实施例2，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素12mg；天门冬素 3.6 g；磷酸二氢钾0.2g；硫酸铜5mg；蒸馏水加至1000ml。制备方法：取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；硫酸铜溶于蒸馏水中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

实施例3，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素10mg；天门冬素 3.6 g；磷酸二氢钾0.2g；L-半胱氨酸0.1g；蒸馏水加至1000ml。制备方法：取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；L-半胱氨酸溶于蒸馏水中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

实施例4，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素9mg；天门冬素 3.6 g；磷酸二氢钾0.2g；浓度200g/L的百合水煮液200ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法：

（1）取百合加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得百合水煮液；

（2）取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；溶于步骤1所得百合水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

实施例5，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：麦芽浸粉15g；鸡蛋蛋白液150ml；氯化钠5g；枸橼酸镁0.5g；琼脂15g；假细锥甲素11mg；天门冬素 3.6 g；磷酸二氢钾0.2g；硫酸铜5mg；L-半胱氨酸0.1g；浓度200g/L的百合水煮液300ml；蒸馏水加至1000ml。制备方法为：

（1）取百合加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得百合水煮液；

（2）取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；L-半胱氨酸及硫酸铜溶于步骤1所得百合水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。

所述的百合水煮液浓度为200g/L，指的是每升百合水煮液中含有生药200g。

本发明所得凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基具有检出可靠、凝固酶阴性葡萄球菌分离率高的特点，为临床资料充分证明，有关资料如下。

1 对象与方法。

1.1 选择性培养基制备：共设3组，分别为对照组、实施例1方案组、实施例5方案组。对照组为葡萄球菌选择性琼脂110（CHAPMAN琼脂），配方为：胰酪蛋白胨、酵母浸粉、明胶、D-甘露醇、乳糖、氯化钠、磷酸氢二钾、琼脂。实施例1方案组、实施例5方案组的配方和制备方法见实施例。

1.2方法：将90份经由PCR确定凝固酶阴性葡萄球菌阳性的标本中混入金色葡萄球菌，接种于培养基上，在 37℃下孵育 24 小时。

1.3统计学分析：用SPSS 13.0进行统计分析，P< 0.05表示有显著性意义。

2 结果：在90份接种标本中，细菌培养分离并鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌的，实施例1方案组为82例，实施例5方案组为86例。对照组CHAPMAN琼脂培养基菌落经鉴定最后被证实均为金葡菌，经统计学处理，本发明各实施例组与对照组比较具有明显差异（P<0.001）。结果表明，本发明实施例凝固酶阴性葡萄球菌分离率明显高于现有的选择性培养基。

Claims (6)

1.一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在，配制1000ml选择性培养基的配方中含有：

麦芽浸粉15g；

鸡蛋蛋白液150ml；

氯化钠5g；

枸橼酸镁0.5g；

琼脂15g；

假细锥甲素8~12mg；

天门冬素3.6g；

磷酸二氢钾0.2g；

蒸馏水加至1000ml。

2.根据权利要求1所述的一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在：每1000ml选择性培养基还含有硫酸铜5mg。

3.根据权利要求1所述的一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在：每1000ml选择性培养基还含有L-半胱氨酸0.1g。

4.根据权利要求1所述的一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在：每1000ml选择性培养基还含有浓度200g/L的百合水煮液200~300ml。

5.根据权利要求1所述的一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基，其特征在：每1000ml选择性培养基还含有硫酸铜5mg；L-半胱氨酸0.1g；浓度200g/L的百合水煮液200~300ml。

6.一种凝固酶阴性葡萄球菌选择性培养基的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取百合加水煮沸1小时，过滤，取滤液，调整体积到浓度为200g/L，得百合水煮液；

（2）取麦芽浸粉；鸡蛋蛋白液；氯化钠；枸橼酸镁；琼脂；假细锥甲素；天门冬素；磷酸二氢钾；L-半胱氨酸及硫酸铜溶于步骤1所得百合水煮液中，混匀过滤后，蒸馏水定容，低温灭菌2次，每次45 min，灭菌后分装。