CN103012770A - 聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于高分子合成化学技术领域，涉及如下结构式的聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用。本发明的聚乙二醇苯并噻唑衍生物是在聚乙二醇的末端含有一个或者两个2-氰基苯并噻唑基团。本发明可采用末端氰基苯并噻唑聚乙二醇修饰N端半胱氨酸蛋白质及多肽类药物，二者可在常温、生理条件下高效地发生不可逆偶联反应。本发明同时可以制备其他高分子的苯并噻唑衍生物，如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸共聚物与聚赖氨酸等。

Description

聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于高分子合成化学技术领域，具体涉及一种聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

现有技术公开了蛋白质和多肽药物与长效合成药物相比，具有作用专一、高效、副作用小、用量少等特点，在人类疾病资料中发挥着重要的作用。但是，蛋白质和多肽类药物在用药时也存在着如下问题，如：免疫原性、易受蛋白水解酶降解、体内半衰期短、毒副作用大等问题，这限制了它们在临床上的应用；而某些药物由于血浆半衰期短，为了获得较显著的临床效果，不得不加大给药剂量和给药次数，从而带来严重的毒副作用等等。目前，解决蛋白质和多肽类药物所存在的缺陷最为成功的手段就是通过共价偶联聚乙二醇屏蔽其表面，这种方法称为聚乙二醇化技术(PEGylation)。聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作为一种经FDA批准的、安全、无毒副作用的优良高分子药用辅料，已广泛用于药物的化学偶联、制剂的表面修饰。聚乙二醇化蛋白质或多肽类药物可以显著延长其体内消除半衰期、降低免疫原性。

常用的聚乙二醇活性基团主要包括：醛基、二氯甲苯、琥珀酰亚胺酯、氯三嗪、苯并***碳酸酯、苯代三氯碳酸酯、碳酸对硝基苯酯(主要用于连接蛋白的氨基)；马来酰亚胺、乙烯基砜、碘乙酰胺、正吡啶二硫键(主要用于连接偶联的巯基)(M.J.Roberts，Adv.Drug Deliv.Rev.2002，54：459-476；R.B.Greenwald.Adv.Drug Deliv.Rev.2003，55：217-250；FM.Veronese.Biomaterials，2001，22：405-417.)。但是以上聚乙二醇衍生物大多数存在着在水溶液中稳定性差的问题。(M.Baudys，F.Liu，S.W.Kim，U.S.Pat.No.6465694B1)。

目前，PEG对蛋白质和多肽类药物进行修饰主要是通过对蛋白的氨基进行化学偶联来实现的，如peginterferon alfa-2a(40KD)(

聚乙二醇化干扰素a-2a注射液)以及peginterferon alfa-2b(

聚乙二醇化a-2b粉针剂)。但是由于干扰素分子上含有多个氨基，不同的氨基修饰同分异构体化合物的生物活性相差较大。目前，主要采用PEG马来酰亚胺衍生物(Polyethylene glycolmaleimide，PEG-MAL)对含巯基蛋白或多肽类药物进行修饰，但是由于PEG-MAL在水溶液中不稳定，故而需要过量的PEG-MAL参与蛋白或多肽类药物的修饰。(K.R.Reddy，M.W.Modi，S.Pedder，et al.Adv.Drug Deliv.Rev.，2002，54：571-586；R.M.Bukowski，C.Tendler，D.Cutler et al.Cancer，2002，95：389-396.)

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术存在的缺陷或不足，提出一种聚乙二醇苯并噻唑衍生物及其制备方法，

本发明的另一目的是提供制得的聚乙二醇苯并噻唑衍生物的用途，采用该衍生物对N端多肽类药物和蛋白质进行结构修饰。

具体而言，本发明提供的聚乙二醇苯并噻唑衍生物，其特征在于，该聚乙二醇苯并噻唑衍生物是以荧光素前体(2-氰基苯并噻唑)为连接体的PEG化衍生物，该种衍生物在水溶液中稳定性良好，可以与N端半胱氨酸蛋白和多肽药物发生特异性偶联。

本发明的聚乙二醇衍生物的结构式如下：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R’₁，R’₂，R’₃，R’₄，R”为氢基或低链烷基；R，R₅，R₅’为甲氧基或其他低链醚基；R’为酰胺基或酯基或醚基。

本发明化合物中，所述的R’，R”为不易水解的化学基团。

本发明化合物中，聚乙二醇的分子量为500～60,000.

本发明化合物中，PEG的末端含有一个或者两个2-氰基苯并噻唑基团。

本发明的聚乙二醇苯并噻唑衍生物，可用于半胱氨酸、高半胱氨酸、N端半胱氨酸蛋白质或N端半胱氨酸多肽类药物的化学结构修饰。

本发明一个实施例中，采用末端氰基苯并噻唑聚乙二醇修饰N端半胱氨酸蛋白质及多肽类药物。本发明同时可以制备其他高分子的苯并噻唑衍生物，如聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸羟基乙酸共聚物与聚赖氨酸等等。

本发明的一个实施例中，提供了一种聚乙二醇2-氰基苯并噻唑化合物，其中PEG为直链、分子量5kD、氨基末端，所述聚乙二醇衍生物为MePEG_5k-CONH-CBT(2-cyano benzothiazole monomethoxypolyethylene glycolamide)，其结构式如下：

本发明的衍生物可在温和的条件下(如中性pH缓冲盐)、较快地(1～4h)与N端半胱氨酸化合物发生不可逆化学偶联。

现有技术中，通常聚乙二醇衍生物对蛋白质的化学修饰主要通过对蛋白上氨基的偶联来实现的，但是蛋白是可能存在着多个氨基(赖氨酸上的氨基或末端氨基)，所以，聚乙二醇蛋白单修饰物可能是多个同分异构体，各个同分异构体之间的生物活性差异较大，对于聚乙二醇修饰后蛋白的活性影响很大。

本发明针对现有技术存在的关于蛋白特殊位点的聚乙二醇修饰的问题，采用聚乙二醇2-氰基苯并噻唑对N-端半胱氨酸多肽类药物和蛋白质进行特异性修饰，二者可在常温、生理条件下高效地发生不可逆偶联反应，理论上只产生一种同分异构体修饰物。本发明不但完成了上述衍生物的制备及其对蛋白与多肽类药物的修饰，同时比较了修饰物的生物活性。对本领域蛋白质的化学修饰有着重要的意义。

附图说明

图1：实施例所述的与MePEG_5k-CONH-CBT的红外图谱，

与CBT-NH₂相比，MePEG_5k-CONH-CBT的红外图谱中无伯胺峰(1643cm^-1与1547cm^-1)，同时增加仲胺峰(1467cm^-1)。

图2：MePEG_5k-CONH-CBT的MALDI TOF-TOF图谱，

CBT-NH₂的分子质量为175，MePEG_5k-COOH的平均分子质量为5387，MePEG_5k-CONH-CBT的理论分子量为5544，图2显示出其测定分子量为5529，近似于其理论分子量。

图3：MePEG_5k-CBT-CT20的MALDI TOF-TOF图谱，

MePEG_5k-CBT的分子量约为5529，而多肽CT20的分子量为2359，图中显示出MePEG_5k-CBT-CT20的测定分子量为7886，与其理论分子量(7888)及其接近。

具体实施方式

下面结合实施例，进一步详述本发明。以下实施例的目的在于对本发明进一步阐述，但是无论如何这些实施例并不意味着对本发明进行限制。本发明包括但并不仅限于以下实例：

试剂与仪器

试剂：二氯甲烷(dichlormethane，DCM)、四氢呋喃(tetrahydrofuran，THF)、***(diethyl ether，DEE)，除测定用除外其他皆为分析纯；N-甲基吗啉(4-methylmorpholine，NMP)、氯甲酸异丁酯(isobutyl chloroformate，ClCOOBuⁱ)、叔丁羰基甘氨酸(N-Tert-Butyl carbonyl glycine，Boc-gly)、二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide，DCC)、4-二甲基氨基吡啶(4-dimethylaminopyridine，DMAP)、结晶紫以及磷酸盐等来源于国药化学试剂公司；2-氰基-6-氨基苯并噻唑(2-cyano-6-amidebenzothiazole，CBT-NH₂)、半胱氨酸(Cysteine，Cys)、高半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)、新生牛血清(fetal bovine serum，FBS)、噻唑蓝(MTT)来源于Sigma-Aldrich公司；牛血清白蛋白(Solarbio)；RPMI1640培养液(GbicoBRl)；多肽CT20(CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY)来源于上海强耀生物公司；N-末端半胱氨酸干扰素a-2b(N-Cys-IFN，本实验室提纯)；聚乙二醇来源于北京键凯科技公司；重组人干扰素α-2b(rhINFα-2b，安徽安科生物工程公司提供)，枝型聚乙二醇单修饰的重组人干扰素α-2b(mPEG2×10k-rhINFα-2b，安徽安科生物工程公司提供)。人***Hela细胞、人羊膜WISH细胞(中国科学院上海细胞库)；96孔细胞培养板(Corning公司)。

仪器：紫外分光光度计UV-2700(Hitachi公司)；HPLC-UV L-2000(Hitachi公司)；质谱仪(AB SCIEX TOF/TOF^TM 5800***)；核磁共振仪(Mercury Plus 400MHz，Varian公司)；AVATR^TM 360型傅立叶变换红外光谱仪(Thermo Scientific公司)；MAXQ恒温摇床(Thermo Scientific公司)；XW-80A漩涡混合器(上海医大仪器厂)；Multiskan MK3酶标仪(Thermo电器公司)；色谱柱YMC C18(5μm，150mm×4.6mm L.D.)；HPLC Guard Cartridge System(Phenomenex公司)。

实施例1.制备MePEG_5k-CONH-CBT

取单甲氧基末端羧基聚乙二醇5000 10g(MePEG_5k-COOH，2.0mmol)溶于DCM 50ml溶液中，0℃充N₂的条件下搅拌10min，加入ClCOOBuⁱ0.410g(3mmol)，NMP 0.40g(4mmol)，上述混合物搅拌反应20min；然后加入含有CBT-NH₂ 0.7g(4mmol)的THF 50ml溶液，在上述条件下反应2h后移至室温继续反应24h；真空旋转除去有机溶剂，盐水溶解残渣，滤除不溶物，DCM萃取，浓缩有机相，无水***沉淀浓缩液并多次洗涤沉淀，除去***后即得MePEG_5k-CONH-CBT 9.5g。

实施例2.制备CBT-NHCO-PEG_5k-CONH-CBT

取双羧基聚乙二醇5000 10g(HOOC-PEG_5k-COOH，2.0mmol)溶于DCM 50ml溶液中，0℃充N₂的条件下搅拌10min，加入ClCOOBuⁱ0.820g(6mmol)、NMP 0.80g(8mmol)，上述混合物搅拌反应20min；然后加入含有CBT-NH₂ 1.4g(8mmol)的THF 50ml溶液，在上述条件下反应2h后移至室温继续反应24h；真空条件下旋转蒸发除去有机溶剂，盐水溶解残渣，滤除不溶物，DCM萃取，浓缩有机相，无水***沉淀浓缩液并多次洗涤沉淀，除去***后即得CBT-NHCO-PEG_5k-CONH-CBT 9.75g。

实施例3.制备MePEG_5k-gly-CBT

取Boc-gly 0.35g(2.0mmol)溶于DCM 20ml溶液中，0℃充N₂的条件下搅拌10min，加入ClCOOBuⁱ0.410g(3mmol)、NMP 0.40g(4mmol)，上述混合物搅拌反应20min；然后加入含有CBT-NH₂ 0.7g(4mmol)的THF 20ml溶液，在上述条件下反应2h后移至室温继续反应24h；饱和KHCO₃终止反应，蒸干，盐水溶解残渣，滤除不溶物，乙酸乙酯萃取水溶液，浓缩有机相，之后采用30％TFA/DCM溶液室温搅拌24h脱去Boc，蒸干有机相，盐水溶解后DCM萃取，二氯甲烷蒸干，硅胶柱纯化得CBT-gly-NH₂ 0.75g，产率为80.8％。

取MePEG_5k-COOH 9g(1.8mmol)溶于DCM 50ml溶液中，0℃下加入DCC 0.557g(2.7mmol)、DMAP 0.018g(0.15mmol)，反应20min，之后加入含有CBT-gly-NH₂ 0.462g(2mmol)的THF溶液，室温搅拌反应24h，过滤、浓缩反应液，无水***沉淀浓缩液并多次洗涤沉淀，除去残余***后即得MePEG_5k-gly-CBT 8.95g。

实施例4.制备CBT-gly-PEG_5k-gly-CBT

取HOOC-PEG_5k-COOH 10g(2.0mmol)溶于DCM 50ml溶液中，0℃充N₂的条件下搅拌10min，加入ClCOOBuⁱ0.820g(6mmol)，NMP 0.80g(8mmol)，上述混合物搅拌反应20min；然后加入含有gly-CBT-NH₂ 1.86g(8mmol)的THF50ml溶液，在上述条件下反应2h后移至室温继续反应24h；真空旋转蒸发除去有机溶剂，盐水溶解残渣，滤除不溶物，二氯甲烷萃取，浓缩有机相，无水***沉淀浓缩液并多次洗涤沉淀，除去***后即得CBT-gly-PEG_5k-gly-CBT 10.56g。

实施例5.制备MePEG_2×5k-CONH-CBT

取甲氧基羧基Y型聚乙二醇10000 20g(MePEG_2×5k-COOH，2.0mmol)溶于DCM 50ml溶液中，0℃充N₂的条件下搅拌10min，加入ClCOOBuⁱ0.410g(3mmol)，NMP 0.40g(4mmol)，上述混合物搅拌反应20min；然后加入含有CBT-NH₂ 0.7g(4mmol)的THF 50ml溶液，在上述条件下反应2h后移至室温继续反应24h；除去有机溶剂，盐水溶解残渣，滤除不溶物，二氯甲烷萃取，浓缩有机相，无水***沉淀浓缩液并多次洗涤沉淀，低压旋转除去***后即得MePEG_2×5k-CONH-CBT 19.73g。

实施例6.制备MePEG_5k-CONH-CBT-Cys

在pH7.4PBS溶液中，MePEG_5k-CONH-CBT与Cys以1∶5的摩尔比室温下反应3h，DCM萃取，有机相除水、浓缩、***沉淀并多次洗涤，即得MePEG_5k-CONH-CBT-Cys。

实施例7.制备MePEG_5k-CONH-CBT-Hcy

在pH7.4PBS溶液中，MePEG_5k-CONH-CBT与Hcy以1∶5的摩尔比室温下反应3h，DCM萃取，有机相除水、浓缩、***沉淀并多次洗涤，即得MePEG_5k-CONH-CBT-Hcy。

实施例8.制备MePEG_5k-CONH-CBT-CT20

在pH7.4PBS溶液中，等摩尔的MePEG_5k-CONH-CBT与CT20室温下缓慢搅拌反应3h，以pH7.4 PBS溶液为流动相葡聚糖凝胶层析柱分离，得到MePEG_5k-CONH-CBT-CT20，MALDI TOF-TOF质谱仪定性。

实施例9.制备MePEG_20k-CONH-CBT-cIFN a2

采用实施例1的方法以单甲氧基羧基聚乙二醇20000(MePEG_20k-COOH)与CBT-NH₂为原料制备单甲氧基2-氰基苯并噻唑聚乙二醇20000(MePEG_20k-CONH-CBT)；采用内含子融合蛋白化学剪切的方法，制备N端半胱氨酸干扰素a-2(cIFN a-2)(J.Thom，D.Anderson，J.McGregor，et.al.Bioconjugate Chem.2011，22，1017-1020.)

在pH7.4PBS溶液中，等摩尔的MePEG_20k-CONH-CBT与cIFN a-2室温下缓慢搅拌反应3h，以pH7.4PBS溶液为流动相凝胶层析柱分离，即得MePEG_20k-CONH-CBT-cIFNα2。

实施例10.制备MePEG_2×10k-CONH-CBT-cIFNα2

采用实施例5的方法以甲氧基羧基Y型聚乙二醇40000(MePEG_2×10k-COOH)与CBT-NH₂为原料制备单甲氧基2-氰基苯并噻唑Y型聚乙二醇20000(MePEG_2×10k-CONH-CBT)。在pH7.4PBS溶液中，等摩尔的MePEG_2×10k-CONH-CBT与cIFNα-2室温下缓慢搅拌反应3h，以pH7.4PBS溶液为流动相凝胶层析柱分离，即得MePEG_2×10k-CONH-CBT-cIFNα2。

实施例11.PEG-CBT的细胞毒性考察

将体外的Hela细胞按照5.0×10³个细胞/毫升的密度接种到96孔细胞培养板中，24h后分别加入100μM的生理盐水，CBT-NH₂，MePEG_2k-CONH-CBT，MePEG_5k-CONH-CBT，MePEG_10k-CONH-CBT，MePEG_20k-CONH-CBT以及MePEG_2×10k-CONH-CBT与细胞共培养48h，采用MTT法测定细胞存活率[存活率(％)＝OD_受试组×100/OD_对照组，OD＝OD_595-690nm]。CBT-NH₂组细胞的存活率为81％，PEG-CBT各组细胞的存活率皆在90％以上。

实施例12.PEG-cIFNα2的比活性考察

依据干扰素可以保护WISH细胞免受水疱性口炎病毒(VSV)破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，于波长570nm处测定其吸收光度，可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此来测定干扰素的生物学活性。

将WISH细胞按照3.0×10⁴个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃，5％二氧化碳条件下培养4～6小时。将配制完成的rhINFα-2b、cINFα-2、mPEG_2×10k-rhINFα-2b以及MePEG_2×10k-CONH-CBT-cIFNα2移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μL。于37℃，5％二氧化碳条件下培养18～24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水疱性口炎病毒(VSV，-70℃保存)稀释至100CCID₅₀，每孔100μl。于37℃，5％二氧化碳条件下培养24小时(镜检标准品的50％病变点在1IU/ml)。然后上清液，每孔加入染色液500μL，室温放置30分钟后，用流水小心冲去染色液，每孔加入脱色液1000μ，室温放置3～5分钟。混匀后，用酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。结果显示：cIFNα2的比活度(约9.6×10⁷IU/mg)尽管比rhINFα-2b(约1.2×10⁸IU/mg)略低，但是MePEG_2×10k-CONH-CBT-cIFNa2(约4.3×10⁷IU/mg)的比活度明显高于mPEG_2×10K-rhINFα-2b(约2.1×10⁷IU/mg)。

Claims (6)

1.具有如下结构筒式的聚乙二醇苯并噻唑衍生物：

其中，R₁，R₂，R₃，R₄，R’₁，R’₂，R’₃，R’₄，R”为氢基或低链烷基；

R，R₅，R₅’为甲氧基或其他低链醚基；

R’为酰胺基或酯基或醚基。

2.如权利要求1所述的聚乙二醇苯并噻唑衍生物，其特征在于，其中聚乙二醇的分子量为500～60,000。

3.如权利要求1所述的聚乙二醇苯并噻唑衍生物，其特征在于：所述的PEG的末端为2-氰基苯并噻唑。

4.如权利要求1所述的聚乙二醇苯并噻唑衍生物，其特征在于：所述的化合物为MePEG_5k-CONH-CBT(2-cyano benzothiazole monomethoxypolyethylene glycol amide)，其PEG为直链、分子量5kD、氨基末端，其结构式为：

5.权利要求1所述的聚乙二醇苯并噻唑衍生物在用于半胱氨酸、高半胱氨酸、N端半胱氨酸蛋白质或N端半胱氨酸多肽类药物的化学结构修饰中的用途。

6.如权利要求5的用途，其特征在于：所述的聚乙二醇苯并噻唑衍生物在水溶液中稳定性良好，与N端半胱氨酸蛋白和多肽药物发生特异性偶联。

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