CN103012599A - 一种调节硝酸纤维素硝化取代度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种调节硝酸纤维素硝化取代度的方法，属于生化分析产品开发技术领域。本发明调节硝酸纤维素硝化取代度的方法，主要包括制备高取代度的硝酸纤维素和乙醇钠回调硝化度至目标硝化度两大步骤。先让纤维素的实际硝化度超过目标硝化度，再采用乙醇钠准确回调。由于加入的乙醇钠的量可以精确控制，因此纤维素的硝化度也可以精确控制。用精确调节硝化度的硝酸纤维素做成膜剂制成的硝酸纤维素基片，红色和绿色荧光通道的背景比较均匀，在保证红色荧光通道背景噪音较低的同时，大大降低了绿色荧光通道的背景噪音，成功克服了绿色荧光背景高和荧光背景不均匀的技术缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析产品开发技术领域，特别涉及一种调节硝酸纤维素硝化取代度的方法。
背景技术
硝酸纤维素基片是目前应用最广的一种固相支持物，即硝酸纤维素在固体平面上形成约10微米厚的薄膜，依靠其良好的疏水作用可以与大多数带负电荷的DNA、RNA和蛋白质等产生高亲和力的吸附。吸附后可以通过80℃烘烤或经紫外线照射交联而固定，不同生物分子以微阵列的排列方式，附着在生物芯片基片的表面，在芯片上与被测样品中的相应分子反应完成分析实验过程，给出检测结果。因为这一性能，硝酸纤维素基片已在生物化学和分子生物学领域广泛应用。目前，美国通用电气公司生产的Whatman Fast
Slides硝酸纤维素基片与蛋白的亲和性高，在用Alexa Fluor荧光标记的抗体与蛋白杂交时，红色荧光区背景较低，是目前世界上公认的能够生产高质量硝酸纤维素基片的第一品牌。此外，常用的蛋白质芯片基片还有美国Grace-Bio-Lab生产的ONCYTE ® AVID ™ nitrocellulose film slides。在国内，硝酸纤维素基片尚属空白。虽然Whatman Fast
Slides硝酸纤维素基片是世界第一品牌蛋白芯片基片，但是，它还有两个不足之处。第一，在用Alexa Fluor 532和Alexa Fluor 647荧光标记的抗体与相片上的蛋白杂交时，它的绿色荧光区背景极高；第二，红色和绿色荧光区是生物芯片技术中最常用的两个通道，Whatman Fast Slides的红色和绿色荧光区的背景都不均匀。然而成膜材料的优劣决定膜的质量，也决定了基片的质量。因此要想获得荧光背景低、成膜后背景均匀的硝酸纤维素基片便要先得到优质的成膜材料。
硝酸纤维素是硝酸纤维素基片的成膜材料，硝酸纤维素是纤维素经过硝化、安定制得。纤维素是D-葡萄糖经ß-1,4糖苷键连接起来的多聚物，每个葡萄糖六元环有三个羟基。这三个羟基都可以被硝化，平均每个葡萄糖环上的羟基被硝化的个数代表了硝化度，可以用含氮量来表示。研究发现特定硝化度的硝酸纤维素制成的硝酸纤维素基片性能优越。但是，准确的硝化度却因为试剂纯度稳定性、反应条件、反应环境等因素难以控制。这样，准确调节控制硝酸纤维素硝化度是要解决的一个重要问题。
发明内容
为了准确调节控制硝酸纤维素硝化度以获得性能稳定优越的硝酸纤维素基片，以克服绿色荧光背景高和荧光背景不均匀的技术缺陷，本发明提供了一种准确调节硝酸纤维素硝化取代度的方法。
本发明所采用的技术方案是：一种调节硝酸纤维素硝化取代度的方法，包括以下步骤：
（1）
制备高取代度的硝酸纤维素：
A. 准确量取30～45 mL的发烟硝酸和50～80 mL的浓硫酸，将二者混合置于磁力搅拌器上搅拌；
B. 精确称取4 g纤维素加入发烟硝酸和浓硫酸的混合液中，反应1～4个小时；
C. 将反应液注入至2 L的超纯水中，边搅拌边加入碳酸钠，直至没有二氧化碳气泡产生；
D. 沉淀过夜，弃去上清液，沉淀物用2 %的碳酸钠溶液煮沸20 min，用盐酸将pH调至中性，并在50 mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E. 将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F. 用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
（2） 乙醇钠回调硝化度至目标硝化度：
A. 用无水乙醇与金属钠反应生成乙醇钠-乙醇混合液；
B. 精确称取0.2～1 g由步骤（1）制备得到的高取代度的硝酸纤维素，悬浮于20～50mL的乙醇中；
C. 根据步骤（1）计算得到的硝化度，计算出加入乙醇钠-乙醇混合液的量，并将乙醇钠-乙醇混合液精确地加入持续搅拌的硝酸纤维素-乙醇悬浮液中；
D. 用盐酸将反应液pH调节至中性，并在50 mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E. 将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F. 用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
G. 如果硝化度偏离目标硝化度，可调节加入的乙醇钠-乙醇混合液的量，得到精确硝化度的硝酸纤维素。
本发明利用乙醇钠能和硝酸纤维素反应，将硝基从硝酸纤维素的羟基上释放出来，从而回调硝化度的特点，先让纤维素的实际硝化度超过目标硝化度，含氮量通常维持在10.1%～11.3%，再采用乙醇钠准确回调，反应过程为：硝酸纤维素（更高硝化度）+乙醇钠→硝酸纤维素（更低硝化度）+乙酸钠+叠氮化合物。由于加入的乙醇钠的量可以精确控制，因此纤维素的硝化度也可以精确控制。用精确调节硝化度的硝酸纤维素做成膜剂制成的硝酸纤维素基片，红色和绿色荧光通道的背景比较均匀，在保证红色荧光通道背景噪音较低的同时，大大降低了绿色荧光通道的背景噪音，成功克服了绿色荧光背景高和荧光背景不均匀的技术缺陷。
附图说明：
图1为现有Whatman基片荧光扫描直观视觉图；
图2为本发明基片荧光扫描直观视觉图；
图3为现有Whatman基片波长635蛋白标志物微阵列荧光扫描图；
图4为现有Whatman基片波长532蛋白标志物微阵列荧光扫描图；
图5为本发明Whatman基片波长635蛋白标志物微阵列荧光扫描图；
图6为本发明Whatman基片波长532蛋白标志物微阵列荧光扫描图；
具体实施方式：
下列实例进一步说明本发明，但不应当作为本发明的限制。
实施例1：
制备经准确调节硝化度的硝酸纤维素：
（1） 制备高取代度的硝酸纤维素：
A．准确量取30～45 mL的发烟硝酸和50～80
mL的浓硫酸，将二者混合置于磁力搅拌器上搅拌；
B.精确称取4 g纤维素加入发烟硝酸和浓硫酸的混合液中，反应1～4个小时，使硝化反应尽可能更完全，取代度尽可能高；
C.将反应液注入至2 L的超纯水中，边搅拌边加入碳酸钠，直至没有二氧化碳气泡产生；
D.沉淀过夜，弃去上清液，沉淀物用2 %的碳酸钠溶液煮沸20 min，用盐酸将pH调至中性，并在50
mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E.将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F.用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
操作过程中尽量全部回收硝酸纤维素，降低误差。
（2） 乙醇钠回调硝化度至目标硝化度：
A.用无水乙醇与金属钠反应生成乙醇钠-乙醇混合液；
B.精确称取0.2～1 g由步骤（1）制备得到的高取代度的硝酸纤维素，悬浮于20～50mL的乙醇中；
C.根据步骤（1）计算得到的硝化度，计算出加入乙醇钠-乙醇混合液的量，并将乙醇钠-乙醇混合液精确地加入持续搅拌的硝酸纤维素-乙醇悬浮液中；
D.用盐酸将反应液pH调节至中性，并在50 mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E.将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F.用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
G.如果硝化度偏离目标硝化度，可调节加入的乙醇钠-乙醇混合液的量，得到精确硝化度的硝酸纤维素。
实施例2：
红色和绿色荧光通道的背景强度和均匀度的比较：
（1）用经准确调节硝化度制得的硝酸纤维素制作硝酸纤维素基片：称取0.2～1 g的硝酸纤维素溶于4～25 mL丙酮中，再加入1～3
mL异丙醇，1～5 mL甲醇，0.1～0.5 mL水配成成膜液，将成膜液用涂膜器均匀地涂在载玻片上，便制成了本发明硝酸纤维素基片。
（2）取本发明制作的基片和Whatman基片各一张，用Axon GenePix 4200AL 荧光扫描仪扫描，将本发明制作的基片与Whatman基片比较，以检验背景均匀度及背景强度的差别。扫描时，信号放大用同样的设置。在显示基片的背景强度和均匀度的视觉效果时，因为两种基片的背景信号强度相差较大，为了尽可能能看到直观的信号，用了两个视觉设置。
（3）结果与分析：直观视觉结果如图1，图1中各标识如表1所示。直观视觉的结果可以判断出本发明制作的硝酸纤维素基片的红色荧光背景均匀度明显优于Whatman基片。
表1：图1中各标识说明
| 标识 | 基片品牌 | 荧光通道波长 | 视觉设置 |
| WR1 | Whatman基片 | 635（红色） | 设置1 |
| WG1 | Whatman基片 | 532（绿色） | 设置1 |
| WR2 | Whatman基片 | 635（红色） | 设置2 |
| WG2 | Whatman基片 | 532（绿色） | 设置2 |
| YR1 | 本发明基片 | 635（红色） | 设置1 |
| YG1 | 本发明基片 | 532（绿色） | 设置1 |
| YR2 | 本发明基片 | 635（红色） | 设置2 |
| YG2 | 本发明基片 | 532（绿色） | 设置2 |
基片荧光扫描数据的定量计算结果如表2所示，从数据可知本发明制作的基片的红色荧光背景信号强度稍好于Whatman基片，绿色荧光背景信号强度则明显低于Whatman基片。
表2：基片荧光扫描数据
| 基片品牌 | 平均荧光信号强度 | 变异系数 |
| Whatman基片635（红色） | 205 | 0.23 |
| Whatman基片532（绿色） | 11358 | 0.09 |
| 本发明基片635（红色） | 82 | 0.07 |
| 本发明基片532（绿色） | 369 | 0.08 |
实施例3：
红色和绿色荧光通道的背景噪音的比较：
（1）用经准确调节硝化度制得的硝酸纤维素制作硝酸纤维素基片：称取0.2～1 g的硝酸纤维素溶于4～25 mL丙酮中，再加入1～3
mL异丙醇，1～5 mL甲醇，0.1～0.5 mL水配成成膜液，将成膜液用涂膜器均匀地涂在载玻片上，便制成了本发明硝酸纤维素基片。
（2）根据Chatterjee等人2006年在Diagnostic markers of ovarian cancer
by high-throughput antigen cloning and detection on arrays文献中公开的方法制备了抗原蛋白克隆库，用这个克隆库制备了2个384孔盘，共768个抗原蛋白标志物样品。用ArrayJet Marathon（Arrayjet Ltd., Edinbough, Scottland）点样仪4X8的JetSpyder32点样针阵列将蛋白标志物同时点到用本发明生产的硝酸纤维素基片和Whatman Fast
Slides基片上，得到抗原蛋白生物芯片。将抗原蛋白芯片按Chatterjee的方法与一个人的血清样品和T7单克隆抗体杂交，分别用红色和绿色荧光标记的二抗进行杂交，再用Axon4200AL荧光扫描仪在激发波长635nm和532nm下扫描，获取数据信号。
（3）结果与分析：蛋白标志物微阵列荧光扫描图片结果见图2，数据比较结果见表3。由红色荧光通道扫描视觉图和扫描数据显示，本发明制作的基片与Whatmen基片没有太大的差别，Whatmen基片的背景噪音稍好。然而绿色荧光通道得到扫描视觉图和扫描数据的结果表明，本发明制作的基片的背景噪音明显优于Whatmen基片。蛋白标志物微阵列杂交后的红色荧光通道和绿色荧光通道的结果可以佐证基片在这一应用上的效果。
表3：蛋白标志物微阵列荧光扫描数据
根据本发明的技术方案及其较佳实施例的描述，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以做出各种可能的等同改变或替换，而所有这些改变或替换都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种调节硝酸纤维素硝化取代度的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备高取代度的硝酸纤维素：
A.准确量取30～45 mL的发烟硝酸和50～80 mL的浓硫酸，将二者混合置于磁力搅拌器上搅拌；
B.精确称取4 g纤维素加入发烟硝酸和浓硫酸的混合液中，反应1～4个小时；
C.将反应液注入至2 L的超纯水中，边搅拌边加入碳酸钠，直至没有二氧化碳气泡产生；
D.沉淀过夜，弃去上清液，沉淀物用2 %的碳酸钠溶液煮沸20 min，用盐酸将pH调至中性，并在50 mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E.将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F.用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
（2）乙醇钠回调硝化度至目标硝化度：
A.用无水乙醇与金属钠反应生成乙醇钠-乙醇混合液；
B.精确称取0.2～1 g由步骤（1）制备得到的高取代度的硝酸纤维素，悬浮于20～50mL的乙醇中；
C.根据步骤（1）计算得到的硝化度，计算出加入乙醇钠-乙醇混合液的量，并将乙醇钠-乙醇混合液精确地加入持续搅拌的硝酸纤维素-乙醇悬浮液中；
D.用盐酸将反应液pH调节至中性，并在50 mL的离心管中离心清洗5次，离心沉淀并弃去上清液；
E.将沉淀物置于干燥器中真空抽气干燥1 d，电子天平精确称重；
F.用以下公式计算硝化度：硝化度=硝化前后质量差×14÷45÷硝化后重量；
G.如果硝化度偏离目标硝化度，可调节加入的乙醇钠-乙醇混合液的量，得到精确硝化度的硝酸纤维素。
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