CN103007352A - 脱细胞纤维环基质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞纤维环基质的制备方法,属于动物细胞或组织领域。本发明是取健康成年猪的脊柱纤维环,经无菌生理盐水充分漂洗;放入浓度为10mM,含0.05~0.5%EDTA、5~50KIU/ml抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡;再放入含1~5%TritonX-100的上述Tris缓冲液,室温振荡;放入含0.05~0.5mg/ml脱氧核糖核酸酶、5~50ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液中,振荡;最后,无菌生理盐水振荡清洗,放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。本发明的制备过程简单,细胞去除彻底,结构保留完整,基质含量及力学性能与天然纤维环相近,是一种良好的组织工程纤维环支架材料。
Description
技术领域
本发明涉及动物细胞或组织领域,具体是一种脱细胞纤维环基质的制备方法。
背景技术
椎间盘退变是一类常见病,严重影响人们的生活,也是骨科治疗难题之一。组织工程技术的出现为椎间盘疾病的治疗提供了新的思路和方法,有望为椎间盘修复或置换提供永久替代产品,其中,纤维环的再生修复是椎间盘组织工程首先要解决的问题,只有纤维环得到修复才能让髓核组织保持在椎间隙,进而对退变髓核实施下一步治疗。
近年来,用于构建组织工程纤维环的支架材料研究较多。如取向性电纺丝纳米支架,虽然结构规则、孔隙均匀,但成分与天然纤维环相差很大,生物相容性差;取向性藻酸盐/壳聚糖复合支架,其力学性能与天然纤维环相差甚远;聚已酸内酯苹果酸三醇/脱钙骨基质明胶双相纤维环支架,双相支架的内外层结合不牢、容易脱落,且生物相容性差;国内潘勇等用脱矿脱细胞骨基质环作为纤维环支架,细胞相容性好,但其可塑性差,结构与天然纤维环的斜交叠层复杂结构相差甚远。综上,纤维环细胞外基质(ECM)生化成分与结构复杂,呈斜交叠层排列,而目前国内外无论人工合成还是天然仿生材料,很难真正模仿椎间盘复杂的天然结构、组成成分及生物力学特性。
近年,脱细胞基质引起了国内外学者的广泛关注,脱细胞基质去除了细胞和可溶性蛋白等引起免疫反应的物质,保留了组织的天然成分和复杂结构,具有与体内组织相近的力学性能,因此,脱细胞基质是一种理想的支架载体,已得到广泛应用,并且异体脱细胞真皮基质、猪脱细胞心瓣膜、猪脱细胞膀胱已被批准应用于临床。目前尚无用脱细胞纤维环基质作为纤维环支架的报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中,组织工程纤维环支架在材料成分、结构、力学性能的不足,而提供一种与天然纤维环十分接近的脱细胞纤维环基质的制备方法。
一种脱细胞纤维环基质的制备方法,是按以下步骤进行的:
(1)取健康成年猪的脊柱纤维环,无菌生理盐水充分漂洗;
(2)浓度为10mM含0.05~0.5% EDTA、5~50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡48 h;
(3)浓度为10mM含0.05~0.5% EDTA、5~50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中,加入1~5% 的TritonX-100后,室温振荡12~96 h;
(4)放入含0.05~0.5 mg/ml脱氧核糖核酸酶、5~50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液,37℃振荡12~36 h;
(5)无菌生理盐水振荡清洗24h,放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。
所述的健康成年猪为6~7月龄,雌雄不限。
所述的脊柱纤维环是外径为5~20 mm,厚度为2~7 mm的尾椎纤维环。
所述的振荡频率均为 80~250 r/min。
本发明的主要优点如下:
①本发明所采用的纤维环材料属于天然生物材料,具有良好的生物相容性和可降解性,且材料来源广泛,可批量生产。
②通过脱细胞系列处理去处抗原成分,避免发生免疫排斥反应、传播疾病。
③本发明的组成成分、结构、力学性能都与天然纤维环十分接近,为种子细胞提供一个与体内纤维环十分接近的生长环境。
附图说明
图1是正常纤维环HE染色图;
图2是脱细胞纤维环基质HE染色图;
图3是正常纤维环Hochest33258染色图;
图4是脱细胞纤维环基质Hochest33258染色图;
图5是正常纤维环甲苯胺蓝染色图;
图6是脱细胞纤维环基质甲苯胺蓝染色图;
图7是正常纤维环Ⅰ型胶原免疫荧光图;
图8是脱细胞纤维环基质Ⅰ型胶原免疫荧光图;
图9是正常纤维环扫描电镜图;
图10是脱细胞纤维环基质扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述。
1、脱细胞纤维环基质的制备方法
(1)取材:取6~7月龄(雌雄不限)健康成年猪的尾椎间盘,无菌生理盐水冲洗干净,去除中央髓核及外周肌肉组织,选取直径及厚度相近的尾椎纤维环,外径9~11 mm,平均10 mm;厚度4.5~5.5 mm,平均5 mm,用无菌生理盐水充分漂洗;
(2)脱细胞处理:将上述处理后的纤维环组织放入10mM含0.1% EDTA、10 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中,4℃ 150r/min振荡48 h进行低渗处理,去离子水冲洗干净;用含3% TritonX-100的Tris缓冲液(含0.1% EDTA、10 KIU/ml 抑肽酶)室温150r/min振荡72 h,每24 h换液一次,去离子水冲洗干净;用含0.2 mg/ml脱氧核糖核酸酶 (DNaseⅠ)、20 ug/ml核糖核酸酶A (RNase A)的Tris缓冲液37℃ 150r/min振荡24 h,去离子水冲洗干净;
(3)清洗:用无菌生理盐水 150r/min振荡24h进行清洗,清洗完后将脱细胞纤维环基质放在PH 7.30 无菌PBS缓冲液中保存。
经上述处理的脊柱纤维环不含纤维环外周肌肉组织及纤维环/髓核交界区。
本发明采用性质比较温和的去垢剂Triton X-100对天然纤维环进行脱细胞处理,去除了天然纤维环的细胞成分,但没有改变纤维环组织的组成、结构及力学性能。
2、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的组织学及电镜观察
HE染色放大100倍可见大量细胞均匀的分布在正常纤维环基质中,脱细胞纤维环基质中无细胞及细胞碎屑残留(见图1、2)。Hochest33258染色放大100倍可见正常纤维环中细胞呈点状荧光,脱细胞纤维环基质呈阴性(见图3、4)。甲苯胺蓝染色放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均呈蓝色(见图5、6)。Ⅰ型胶原免疫荧光放大100倍正常纤维环及脱细胞纤维环基质均为阳性,呈红色荧光(见图7、8)。扫面电镜可见正常纤维环放大200倍及脱细胞纤维环基质放大80倍均排列有序,微观结构无差别(见图9、10)。
3、正常纤维环及脱细胞纤维环基质的生化成分分析
胶原及氨基葡聚糖(GAG)是纤维环的主要组成成分,经测定脱细胞纤维环基质的胶原含量为(150.83±2.43)ug/mg,与正常纤维环的胶原含量(143.99±4.86)ug/mg相比无统计学意义;脱细胞纤维环基质的GAG含量分别为(41.07 ±2.54)ug/mg,稍低于正常纤维环的GAG含量(54.01± 2.84)%。
4、正常纤维环脱及细胞纤维环基质的生物力学测定
经测定脱细胞纤维环基质的极限载荷为(24.52±3.83)N,极限应力为(6.02±0.83)MPa,极限应变为(0.41±0.05)%,韧度为(15.58±1.62)N/mm,弹性模量为(28.89±5.50)MPa,断裂功耗为(30.85±5.15)×10-3J;与对照组的极限载荷(22.98±2.10)N,极限应力(5.86±1.13)MPa,极限应变(0.34±0.05)%,韧度(17.00±2.89)N/mm,弹性模量(30.71±5.47)MPa,断裂功耗(29.62±5.26)×10-3J相比均无统计学差异。
Claims (4)
1.一种脱细胞纤维环基质的制备方法,其是按以下步骤进行的:
(1)取健康成年猪的脊柱纤维环,无菌生理盐水充分漂洗;
(2)在浓度为10mM,含0.05~0.5% EDTA、5~50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中4℃振荡48 h;
(3)在浓度为10mM,含0.05~0.5% EDTA、5~50 KIU/ml 抑肽酶的Tris缓冲液中,加入1~5% 的TritonX-100后,室温振荡12~96 h;
(4)放入含0.05~0.5 mg/ml 脱氧核糖核酸酶、5~50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris缓冲液,37℃振荡12~36 h;
(5)无菌生理盐水振荡清洗24 h,放在无菌PBS缓冲液中4℃保存。
2.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法,其特征在于:所述的健康成年猪为6~7月龄,雌雄不限。
3.按照权利要求1所述脱细胞纤维环基质的制备方法,其特征在于:所述的脊柱纤维环是外径为5~20 mm,厚度为2~7 mm的尾椎纤维环。
4.按照权利要求1所述的脱细胞纤维环基质的制备方法,其特征在于:所述振荡频率均为80~250 r/min。
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Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104307044A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-01-28 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料及其制备方法 |
CN104307045B (zh) * | 2014-10-13 | 2016-06-08 | 林贤丰 | 一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料的制备方法 |
CN108310466A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-07-24 | 浙江大学 | 一种天然组织来源的髓核脱细胞材料的制备方法 |
CN110652611A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-07 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法 |
CN113456892A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-01 | 中南大学湘雅医院 | 一种以人脐带沃顿胶制备软骨组织工程支架的方法及软骨组织工程支架 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101185775A (zh) * | 2007-12-27 | 2008-05-28 | 南京市儿童医院 | 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 |
CN101366975A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-18 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法 |
CN101954123A (zh) * | 2010-10-21 | 2011-01-26 | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 | 一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法 |
-
2013
- 2013-01-21 CN CN201310020971.8A patent/CN103007352B/zh active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101185775A (zh) * | 2007-12-27 | 2008-05-28 | 南京市儿童医院 | 猪血管脱细胞的支架的化学与物理结合的制备方法 |
CN101366975A (zh) * | 2008-09-03 | 2009-02-18 | 陕西瑞盛生物科技有限公司 | 脱细胞小肠粘膜下层生物材料的制备方法 |
CN101954123A (zh) * | 2010-10-21 | 2011-01-26 | 中国人民解放军第三军医大学第二附属医院 | 一种人工椎间盘复合体组织及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
S-Z GUO ET AL.: "Preparation of the acellular scaffold of the spinal cord and the study of biocompatibility", 《2010 INTERNATIONAL SPINAL CORD SOCIETY》, vol. 48, 12 January 2010 (2010-01-12), pages 576 - 581 * |
闫中胜等: "新型组织工程椎间盘纤维环支架的制备与性能检测", 《中国组织工程研究与临床康复》, vol. 15, no. 3, 15 January 2011 (2011-01-15), pages 399 - 403 * |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104307044A (zh) * | 2014-10-13 | 2015-01-28 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料及其制备方法 |
CN104307045B (zh) * | 2014-10-13 | 2016-06-08 | 林贤丰 | 一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料的制备方法 |
CN104307044B (zh) * | 2014-10-13 | 2016-06-08 | 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 | 一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料的制备方法 |
CN108310466A (zh) * | 2018-04-04 | 2018-07-24 | 浙江大学 | 一种天然组织来源的髓核脱细胞材料的制备方法 |
CN108310466B (zh) * | 2018-04-04 | 2021-04-06 | 浙江大学 | 一种天然组织来源的髓核脱细胞材料的制备方法 |
CN110652611A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-07 | 华中科技大学同济医学院附属协和医院 | 京尼平交联的纤维环脱细胞基质水凝胶及其制备方法 |
CN113456892A (zh) * | 2021-07-20 | 2021-10-01 | 中南大学湘雅医院 | 一种以人脐带沃顿胶制备软骨组织工程支架的方法及软骨组织工程支架 |
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