CN104307044B - 一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料及其制备方法，本发明取脊椎动物椎间盘，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，然后在浓度为10%的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，在摇床150rpm震荡4小时；再在浓度为4%的含Triton？X-100的PBS缓冲液，加入混合抗菌液，在摇床150rpm震荡48小时；接着用浓度为5%的含SDS的PBS缓冲液，加入的混合抗菌液，在摇床150rpm震荡48小时；最后用浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入混合抗菌液，在摇床150rpm震荡12小时，再用PBS冲洗1小时，本发明取材广，安全性高，能实现正常椎间盘重构。

Description

一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料的制备方法
技术领域
本发明主要涉及用于组织或器官修复及其再生的生物领域，具体是一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料极其制备方法
背景技术
椎间盘退变常常引起背部疼痛及椎间盘突出。据统计，在美国约有84％的人有过腰背部疼痛病史，与之相关花费每年更是高达1000亿美元。并且椎间盘退变则被认为是一个不可逆的并且随年龄加重的病变过程。而目前传统的保守治疗和手术切除-融合均不能达到理想的根治效果。
再生医学和组织工程技术的出现使根治椎间盘退变成为可能。近年来，许多研究者尝试运用组织工程(金属-塑料复合椎间盘)、分子生物学(注射生长因子或细胞因子抑制剂)和干细胞治疗等技术治疗椎间盘退变。但是由于天然椎间盘(髓核和纤维环)具有复杂的三维结构和许多目前尚未明确的具体组成成分使得效果总是不尽如人意。例如，人工合成材料由于生物力学、生物相容性、材料性质和远期磨碎等问题使其运用受到很大限制；而生长因子和细胞因子抑制剂的有效作用时间短暂也使治疗效果不佳；同样干细胞技术目前还无法解决椎间盘结构破坏所导致的一系列疾病进程。因此找到真正符合正常椎间盘生物学和力学性质的材料或是治疗技术，从而替换并逆转退变椎间盘是一个亟待解决医学难题。
细胞外基质(ECM)含有正常组织或器官细胞所需的各种生化因子，并且具有天然宏观及超微三维的立体结构。ECM可调节生物物理刺激、生物化学及分子信号等一系列组织或器官发育及修复所需的各种因素，从而实现组织或器官的恢复和再生。因此ECM作为一个新型的天然生物材料正被广泛的运用于心脏瓣膜、气管、肌肉、肌腱、软骨等一系列组织或器官的修复及再生。而目前尚无关于天然来源的完整椎间盘(髓核和纤维环)脱细胞材料制备的报道。
发明内容
本发明目的在于填补现有技术中，组织工作人椎间盘在材料组成、结构、生物力学方面的不足以及仅有单一髓核或纤维支架的缺陷，提供一种可适宜椎间盘细胞生长、重构及治疗不可逆性椎间盘退变的全椎间盘脱细胞材料的制备方法
一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料及其制备方法，具体包括以下步骤：
(1)取脊椎动物椎间盘，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分钟，去除血液、残余肌肉组织和韧带等；
(2)在浓度为10％的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，恒温45℃摇床150rpm震荡4小时；并用PBS冲洗1小时；
(3)在浓度为4％的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，缓冲液和混合抗菌液比例5：1，恒温45℃摇床150rpm震荡48小时；并用PBS冲洗1小时；所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1；
(4)浓度为5％的含SDS的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，恒温45℃摇床150rpm震荡48小时；再用PBS冲洗1小时；所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1；
(5)浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，37℃摇床150rpm震荡12小时，再用PBS冲洗1小时，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1。
本发明的主要优点如下：
(1)本发明所采用的全椎间盘是天然来源的生物材料，具有很好的生物相容性和取材广泛性；
(2)采用脱细胞技术获得的全椎间盘不含细胞等抗原物质，可使受体的免疫排斥反应降到最低限度，同时可不含细菌病毒等有害成分生物安全性高；
(3)脱细胞技术在去除异种细胞的同时，可保留原先ECM的完整性，具有良好的细胞外微环境、生化因子和生物力学性质等，可以最大限度的模拟正常椎间盘成分和结构；
(4)本发明材料不仅可以用于种植各种干细胞(胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞(MSCs)、脂肪间充质干细胞等)和椎间盘细胞以实现正常椎间盘重构，为病人订制具有个体化、可供移植的全椎间盘，还可以将其研磨制成粉末，将正常椎间盘所含有的生化因子溶解用于治疗退变的椎间盘。
附图说明
图1是本发明的全椎间盘(纤维环和髓核)大体外观图；
图2是纤维环支架的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图3是髓核支架的HE染色无细胞及无细胞核成分残留图；
图4是纤维环支架的阿尔新蓝染色保留大量糖胺聚糖成分图；
图5是髓核支架的阿尔新蓝染色保留大量糖胺聚糖成分图；
图6是全椎间盘DNA定量检测几乎不含有DNA成分图；
图7是纤维环扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图；
图8是髓核扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图；
图9是CCK-8检测不同支架浸提液浓度下MSCs的增值情况图；
图10是Live/Dead细胞染色MSCs在全椎间盘脱细胞支架上的生长情况图。
具体实施方案
下面结合附图及实施例对本发明进行详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
1、制备全椎间盘脱细胞基质
(1)取材：取4个月(雌雄均可)健康家兔胸5到腰3的椎间盘，摘除骨性碎片，无菌PBS充分漂洗去除血液和其他杂质，椎间盘长轴约1cm，短轴0.8cm，厚度约5mm。
脱细胞步骤如下：
步骤一:在100ml浓度为10％的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液，低温(4℃)摇床150rpm震荡4小时；并用PBS冲洗1小时；
步骤二:在500ml浓度为4％的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入100ml青霉素和链霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床150rpm震荡48小时；并用PBS冲洗1小时；
步骤三:在500ml浓度为5％的含SDS的PBS缓冲液，加入100ml青霉素和链霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，低温(4℃)摇床150rpm震荡48小时；并用PBS冲洗1小时；
步骤四：用100ml浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入20ml青霉素和链霉素(10KIU/ml，10g/ml)混合抗菌液，37℃摇床150rpm震荡12小时后，并用PBS冲洗1小时得到全椎间盘脱细胞支架，如图1所示；
全椎间盘脱细胞支架的组织学评价
图2和图3是本发明全椎间盘脱细胞支架(纤维环和髓核)HE染色放大100倍无细胞及无细胞核成分残留图；图4和图5是本发明全椎间盘脱细胞支架(纤维环和髓核)阿尔新蓝染色放大100倍保留大量糖胺聚糖成分图。
(4)全椎间盘脱细胞支架的抗原成分定量检测
图6是本发明全椎间盘脱细胞支架(纤维环和髓核)DNA定量检测几乎不含有DNA成分图。
(5)全椎间盘脱细胞支架的超微立体结构观察
图7和图8是本发明全椎间盘脱细胞支架(纤维环和髓核)扫描电镜检测胶原纤维排布和空间立体结构完整保留图。
(6)全椎间盘脱细胞支架的生物相容性评价
图9是本发明全椎间盘脱细胞支架CCK-8检测不同支架浸提液浓度下MSCs的增值情况图。图10是本发明全椎间盘脱细胞支架Live/Dead细胞染色MSCs在全椎间盘脱细胞支架上100倍的生长情况图。

Claims (1)

1.一种天然组织来源的全椎间盘脱细胞材料的制备方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤：
(1)取脊椎动物椎间盘，摘除骨性碎片，无菌PBS漂洗3次，每次漂洗20分钟，去除血液、残余肌肉组织和韧带；
(2)在浓度为10％的含10KIU/ml蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，恒温45℃摇床150rpm震荡4小时；并用PBS冲洗1小时；
(3)在浓度为4％的含TritonX-100的PBS缓冲液，加入10KIU/ml青霉素和10g/ml链霉素的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，恒温45℃摇床150rpm震荡48小时；并用PBS冲洗1小时；所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1；
(4)浓度为5％的含SDS的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，恒温45℃摇床150rpm震荡48小时；再用PBS冲洗1小时；所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1；
(5)浓度为0.5mg/ml的含DNA酶的PBS缓冲液，加入10KIU/ml，10g/ml的混合抗菌液，缓冲液和混合抗菌液体积比为5：1，37℃摇床150rpm震荡12小时，再用PBS冲洗1小时，所述的混合抗菌液由青霉素和链霉素组成，青霉素和链霉素的体积比为1：1。
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