CN102974327A

CN102974327A - 氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱

Info

Publication number: CN102974327A
Application number: CN2012105423395A
Authority: CN
Inventors: 杨眉; 李贤良; 侯长军; 郗存显; 李俊杰; 王国明; 张雷; 霍丹群
Original assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau; Chongqing University
Current assignee: Inspection & Quarantine Technology Center Of Chongqing Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureau; Chongqing University
Priority date: 2012-12-14
Filing date: 2012-12-14
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-12-14
Also published as: CN102974327B

Abstract

本发明公开了一种氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，在柱形壳体内装填有分子印迹聚合物微球，分子印迹聚合物微球制备方法为：以3-氨基丙基三乙氧基硅烷或苯基三乙氧基硅烷为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，氨基糖苷类抗生素为模板分子，采用溶胶凝胶法进行水解缩合，在活化硅胶的表面形成Si-O-Si键的刚性网络结构，形成聚合物微球；通过模板分子的洗脱，即得到分子印迹聚合物微球。本萃取柱用于动物性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留检测前样品预处理时对目标物的分离与富集，对目标物能选择性吸附，具有分离、净化、富集操作步骤简单、快速，有机溶剂消耗少，重复使用次数高等优点。

Description

氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱

技术领域

本发明涉及兽药残留检测技术的改进，具体涉及一种动物性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留检测前样品预处理用的分子印迹固相萃取柱，属于兽药残留检测技术领域。

背景技术

食品安全问题是关乎人类身体健康和社会和谐的重大问题，由于近些年来食品安全事件的频发，引起了世界各国对食品安全的高度关注。发达国家从上个世纪70年代起就开始关注兽药残留问题。目前，欧美等国家己经建立了完善的兽药残留监控体系，并且不断研究开发高效快速的检测方法，严格有关兽药残留法律法规，在此基础上设置药残技术性贸易壁垒，以此来阻碍其他国家的动物性食品的进入。2002年，我国农业部重新修订发布兽药在动物性食品中的最高残留限量，使规定限量的兽药达到134种，主要是抗生素类药物。但是此项工作在我国仍然尚属起步阶段，相应的配套法规还不够健全，检测方法及标准尚待完善，检测监控体系、执法体系和资金来源以及舆论宣传等都还存在一些问题，所以当前我国对动物性食品开展兽药残留的常规检测水平比发达国家还有不少差距。鉴于兽药残留己经成为当前严重影响我国外贸出口和威胁人类健康的重要因素之一，因此提高全社会对兽药残留危害性的认识具有十分重要的意义，加强兽药残留的监测和控制迫在眉睫。

氨基糖苷类抗生素是由单组份或多组份组成的糖基取代的氨基环醇类化合物，呈碱性，极性和水溶性较高。临床上常用于预防和治疗革兰氏阴性菌和结核杆菌等引起的感染。由于其抗菌谱广，而且价格低廉，因此在养殖业中常被大量应用，易在动物体内产生残留，进而危害人体健康。目前，动物源性食品中氨基糖苷类药物残留的方法主要有微生物检测法，免疫学检测法和理化检测法等等。微生物检测法虽然价格便宜，操作简单，适用于样品的大批量筛选，但准确度和灵敏度较低，检测限达不到要求，且测定结果误差较大。免疫分析法易产生假阳性结果，阳性结果需要进行确证。

鉴于微生物检测法和免疫学检测法的应用还存在诸多的局限与阻碍，目前在动物源性食品兽药残留的检测中，以色谱技术为代表的理化检测法已经被证明是最为有效的确证性检测手段之一。理化检测法主要包括高效毛细管电泳法（high performance capillaryelectrophoresis, HPCE）、薄层色谱法（thin-layer chromatography, TLC）、气相色谱法（gas chromatography, GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography, HPLC）、液相色谱/质谱联用法（liquid chromatography/mass spectrometry, LC/MS）、气相色谱/质谱联用法（gas chromatograph/mass spectrometry, GC/MS）等。这些方法结果准确，而且可以同时进行多种药物的分析，在近几十年来得到了很大的发展。Cheryl等用毛细管电泳分析氨基糖苷类抗生素时，利用硼酸盐的络合作用通过紫外检测器得到链霉素和双氢链霉素检测线性范围0.05–1.0mg/ml，同时对0.10–1.0mg/ml浓度范围的十二种氨基糖苷类抗生素能够得到较好的分离效果。Hoebus等用六甲基二硅烷柱前衍生测定大观霉素，用填充柱气相色谱法，氢火焰离子化检测器检测，在75%-125%的浓度范围内，呈良好的线性关系。Andrzej等使用9-芴基甲基氯甲酸酯作为柱前衍生试剂，测定了肌肉、肝脏、肾脏中庆大霉素和新霉素检测限分别是0.1mg/Kg和0.2mg/Kg，庆大霉素的回收率为76%-86%，新霉素的回收率为77%–83%。Daniel等利用HPLC–MS/MS检测血液中新霉素，经乙腈处理后，得到新霉素的检测线性范围0.2–50ug/ml，检测限0.2ug/ml。Michel等利用LC–MS/MS从灵敏度和色谱效率因素进行优化，得蜂蜜和牛奶中链霉素的检测限分别是2ug/ml和10ug/ml。

但这些理化检测方法也存在着一定不足之处，例如在利用色谱检测畜牧业中使用较多的氨基糖苷类抗生素时检测方法相当复杂，灵敏度较低和通用性较差。究其原因，主要表现在以下方面：（1）氨基糖苷类抗生素具有较高的水溶性和质子化倾向，易与组织成分结合或被玻璃器皿吸附，使得样品处理的回收率低；（2）氨基糖苷类抗生素异构体多，色谱分离过程复杂，分离条件不易控制；（3）分子结构缺乏紫外吸收的生色团，因此几乎都必须进行衍生化才能用紫外检测器（UVD）或荧光检测器（FLD）检测，而且由于活性基团多，衍生化条件通用性差，这便使样品前处理过程和分析过程更加复杂繁琐。随着高效、超高效兽药的不断开发利用，动物性食品中的药物残留检测将处于超微量水平，而且检测种类以及检测样本量也在不断增加，因此，迫切需要发展和应用快速、简便、特异性好、灵敏度高的检测技术。分子印迹固相萃取技术由于其自身具有对痕量组分强特异性的分离和富集能力，所以在基于色谱的兽药残留检测方面有着巨大的发展应用潜力。

固相萃取（solid phase extraction, SPE）是兽药残留分析常用的样品处理与富集方法，是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，使之与样品的基质和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱或加热解吸附，达到分离和富集目标化合物的目的。在实际样品的分析测定中，被测组分往往以极低的浓度存在于复杂的机体当中，因此为了能用标准的分析技术检测被测组分，往往需要对样品进行预处理，以达到对被测组分富集及对样品基体纯化的目的。固相萃取因其具有易于实现自动化、灵活多变以及对环境友好等优点，目前已被视为分析测定前对样品进行预处理的标准方法。为了使被测组分获得高的富集倍数并尽量纯化基本成分，要求用于SPE的吸附剂材料对被测物质要有更高的亲和力和选择性。然而传统的SPE的目标物与吸附剂之间的作用力是非特异性的，通常需对萃取和洗脱条件进行仔细选择，而且对不同基质的分离与分析物需要选择不同的柱填料，往往难于满足复杂样品的要求；而具有高度选择性的生物活性材料如免疫亲和剂又有制备麻烦、费时、成本高、稳定性差及不宜在有机溶剂中使用等缺点。分子印迹聚合物独特的选择性和亲和力适应了这一要求，由于模板选择的多样性，使得分子印迹聚合物能广泛应用于各种物质的分离与分析过程，它对于目标物质的高度选择性也是普通SPE所不能比拟的。目前关于分子印迹固相萃取技术用于食品中兽药残留检测的文献报道已有很多。Crescenzi等采用分子印迹技术，以溴布特罗为模板分子将两个固相萃取柱串联直接对牛肝中的盐酸克仑特罗进行分离富集，从而避免了复杂的样品前处理过程接着采用液相色谱-串联质谱方法进行确证分析，方法的回收率大于90%，检测限低于0.1g/kg。Kootstra等用MISPE技术萃取了几种β-肾上腺素类受体激动药，并借助HPLC-MS技术对其进行了检测，结果表明9种化合物（溴布特罗、雪马特罗、西马特罗、克伦丙罗、克伦特罗、苯氧丙酚胺、马布特罗、马喷特罗、莱克多巴胺）均达到1μg/kg的定量检测要求。Koster等采用硅胶纤维覆盖着可以再生的克伦特罗分子印迹材料，提取苯胺型β-肾上腺激素，使克仑特罗、溴布特罗、马布特罗、马愤特罗的回收率达到61%～79%。国内有关分子印迹固相萃取的研究相对滞后，仅有少许以兽药分子为模板制备印迹聚合物用于固相萃取的报道。马金余等报道了己烯雌酚分子印迹聚合物的合成、固相萃取柱的制备并将其应用于样品前处理的过程，并对加标鸡肉样品进行含量测定，回收率可达95%以上；黄招发等报道了头孢硫脒分子印迹聚合物的合成条件，探讨了采用分子印迹技术制备固相萃取柱对血浆中头孢硫脒进行分离富集，并初步研究了其吸附机理。综上所述，当前分子印迹固相萃取柱在兽药残留领域研究、应用范围有限，有待于进一步拓宽。

发明内容

针对现有技术液相色谱法检测动物源性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留中样品前处理和分析过程存在复杂繁琐，衍生化条件通用性差，灵敏度有待提高，而普通的固相萃取材料对目标物的特异性吸附能力不高，同时对于痕量物质残留的富集倍数不高，达不到测定的要求等问题与不足，本发明的目的在于提供一种分子印迹固相萃取柱，本萃取柱用于动物性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留检测前样品预处理时对目标物的分离与富集，具有对目标物能选择性吸附，具有分离、净化、富集操作步骤简单、快速，有机溶剂消耗少，重复使用次数高等优点。

本发明实现上述目的的技术解决方案如下：

动物性食品中氨基糖苷类抗生素残留检测前样品预处理用分子印迹固相萃取柱，在柱形壳体内装填有分子印迹聚合物微球，柱形壳体的两端分别设有聚四氟乙烯筛板；所述分子印迹聚合物微球通过如下步骤制得：

1）首先对硅胶进行活化；硅胶活化工艺为，将硅胶浸泡入一定浓度的硝酸溶液中，恒定温度下搅拌活化恒定时间，然后将处理后的硅胶过滤并用去离子水反复洗涤至中性，真空干燥至恒重即可；

2）以3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTEOS）和苯基三乙氧基硅烷（PTMOS）之一或者两者任意比例的混合物为功能单体，正硅酸乙酯（TEOS）为交联剂，氨基糖苷类抗生素为模板分子，采用溶胶凝胶法进行水解缩合，在活化硅胶的表面形成Si-O-Si键的刚性网络结构，形成聚合物微球；

3）通过模板分子的洗脱，将结合在聚合物微球中的模板分子洗脱下来，从而在硅胶表面留下对模板分子特异性识别的孔道结构，即得到所述的分子印迹聚合物微球。

本发明将表面分子印迹法和溶胶凝胶法有机结合起来，制备出对氨基糖苷类抗生素有较强特异性识别和富集能力的分子印迹聚合物微球，继而组装为分子印迹固相萃取柱应用于实际样品测定。相比现有技术，其有益效果为：

本发明验证了所制备的分子印迹聚合物微球在加标的蜂蜜、牛奶、猪肉、猪肝脏和猪肾脏样品中对氨基糖苷类抗生素残留的分离提取效率。对于所有五种加标样品，分子印迹聚合物微球都表现出了比非分子印迹聚合物微球更强的吸附效能。其中最高的回收率在牛奶样品中得到，获得了超过94%的回收率。测试所选用的所有样品都是在水溶液中直接加标，未添加额外的有机溶解和其他处理步骤，这大大降低了有机溶剂大量使用造成的污染，同时减少了操作难度和成本。

本发明考察了所制备的链霉素分子印迹聚合微球的稳定性和再生性。已经吸附了链霉素残留的链霉素分子印迹聚合微球经提取洗脱后，可再次用于对链霉素抗生素残留的吸收和富集。结果表明，尽管经过十多次的重复使用，再生的链霉素分子印迹聚合微球并未表现出来明显的吸附能力的降低。由于所使用的再生方法操作简单，再生链霉素分子印迹聚合微球吸附效能稳定，本发明制备的链霉素分子印迹聚合微球可作为大范围的推广使用。

本发明提出的分子印迹固相萃取柱用于动物性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留检测前样品预处理时对目标物的分离与富集，能对目标物进行选择性吸附，具有分离、净化、富集操作步骤简单、快速，有机溶剂消耗少，重复使用次数高等优点，同时对于痕量物质残留的富集倍数高，容易满足兽药残留检测要求，可用于实际样品中氨基糖苷类抗生素残留的分离，可作为高选择性、高效率的氨基糖苷类抗生素预富集吸附材料。

附图说明

图1-链霉素的化学结构示意图。

图2-链霉素分子印迹聚合物微球电子扫描电镜图（a. 链霉素分子印迹聚合物；b. a的局部放大图）。

图3-链霉素分子印迹聚合物微球（a）和未洗脱的分子印迹微球（b）的红外光谱图。

图4-链霉素分子印迹聚合物微球和非印迹微球的吸附曲线对比图。

图5-链霉素初始浓度对微球吸附量的影响。

图6-印迹聚合物对链霉素及干扰物质的选择性对比。

图7-链霉素分子印迹聚合物微球在不同加标样品中对链霉素的加标回收率。

图8-分子印迹微球重复使用的稳定性测试。

具体实施方式

普通的固相萃取与高效液相色谱联用技术在实际应用中已经得到了广泛地推广应用，本发明针对普通的固相萃取材料对目标物的特异性吸附能力不高，容易将共存的干扰物一起萃取出来，造成干扰，同时对于痕量物质残留的富集倍数不高，达不到测定的要求等问题，而发明一种新的固相萃取柱，本固相萃取柱中的萃取材料为分子印迹聚合物微球，分子印迹聚合物微球采用表面分子印迹技术和溶胶－凝胶技术相结合的方法而得到，对亲水性氨基糖苷类药物（代表链霉素）具有高选择吸附性能。将本发明获得的固相萃取柱与高效液相色谱联用，即可在原有成熟理论和经验的基础上，实现对氨基糖苷类药物残留的高效检测。

本发明分子印迹固相萃取柱的具体结构和实现方法为，在柱形壳体内装填有分子印迹聚合物微球，柱形壳体的两端分别设有聚四氟乙烯筛板；所述分子印迹聚合物微球通过如下步骤制得：

1）首先对硅胶进行活化；硅胶活化工艺为，将硅胶浸入浓度为的6M的浓硝酸溶液中50℃条件下回流4个小时，溶液用电磁加热套电磁恒温搅拌，搅拌速度420rpm。然后，将所得产物离心分离并用去离子水反复洗涤至中性，最后置于70℃的烘箱中，真空干燥12小时，得到活化处理后的二氧化硅微球。

2）以3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTEOS）和苯基三乙氧基硅烷（PTMOS）之一或者两者任意比例的混合物为功能单体，正硅酸乙酯（TEOS）为交联剂，氨基糖苷类抗生素为模板分子，采用溶胶凝胶法进行水解缩合，在活化硅胶的表面形成Si-O-Si键的刚性网络结构，形成聚合物微球。1g第1）步活化得到的二氧化硅微球对应2M功能单体，功能单体、交联剂和模板分子的摩尔比优选2:8:1。

具体步骤为：将1M模板分子溶入60ml四氢呋喃和10ml双蒸水的混合溶液中搅拌30分钟，然后加入2M功能单体（功能单体可以是单一的3-氨基丙基三乙氧基硅烷或者苯基三乙氧基硅烷，或者两者摩尔比1:1的混合物）；电磁搅拌30分钟后再加入8M正硅酸乙酯，再搅拌30分钟加入1g第1）步活化得到的二氧化硅微球。30分钟后加入10ml无水乙醇和对应催化剂（氨水或者盐酸）。混合物在20℃下电磁搅拌反应30小时。将所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水交替清洗除去未反应完全的试剂，然后70℃真空干燥30小时，即得到聚合物微球。

3）为了除去模板分子，用1:4的冰醋酸/甲醇混合溶剂对所得印迹微球索氏提取30小时。通过模板分子的洗脱，将结合在聚合物微球中的模板分子洗脱下来，从而在硅胶表面留下对模板分子特异性识别的孔道结构，即得到所述的分子印迹聚合物微球。

为了便于实验对比，本发明同时获得了非印迹聚合物微球，非印迹聚合物微球在缺少模板分子的情况下以上述第2）步的同样方法制备。

由于氨基糖苷类抗生素的典型代表是链霉素，因此作为一个实施例，本发明以链霉素为模板分子制备得到了链霉素分子印迹聚合物微球（链霉素的化学结构示意图见图1），以下对链霉素分子印迹聚合物微球进行性能分析，因为链霉素分子印迹聚合物微球的性能即决定了所得的分子印迹固相萃取柱的萃取性能。

一、链霉素分子印迹聚合物微球的形貌和化学成分表征

聚合后的分子印迹微球过滤或离心分离后用乙腈溶液稀释，超声充分分散。取少量分散溶液用乙腈稀释至透明，用热蒸发方法在聚合物表面镀一层15nm厚的金膜，然后进行电子扫描电镜（SEM）测试，其电子扫描电镜见图2。化学成分通过X射线能谱仪（XPS）及傅立叶变换红外光谱仪（FT-IR）测试，其结果见图3。

二、链霉素分子印迹聚合物微球的吸附实验

配制不同浓度的链霉素溶液，测定其紫外吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。分别称取固定质量的聚合物微球，加入到上述不同浓度的链霉素溶液之中，放入恒温水浴振荡器中振荡一定时间。然后取上清液用紫外分光光度计和液质联用仪器测定吸光度，根据标准曲线求出其吸附后溶液平衡浓度。根据链霉素浓度前后变化，计算模板聚合物的平衡吸附量，并用非印迹聚合物微球作对比试验。图4为分子印迹聚合物微球和非印迹聚合物微球对链霉素的吸附曲线图，初始链霉素浓度为1.5 mg/mL。由图4可以看出，分子印迹聚合物微球明显表现出了比非印记聚合物微球更高的对链霉素的吸附性能力，进一步印证了微球表面分子印迹聚合物的形成。

同样调整链霉素溶液的初始加入浓度，以考察初始浓度对聚合物吸附容量的影响，结果如图5所示。从图5可以看出，当链霉素溶液初始浓度从0.5 mg/mL 到 2.5 mg/mL逐渐增加时，链霉素分子印迹聚合物及对应非模板分子印迹聚合物都表现出了逐渐增加的吸附量，直至达到饱和。其中，链霉素分子印迹聚合物对链霉素的最终吸附量为26.3 mg/g，远远高于对应非模板分子印迹聚合物饱和吸附量（约为14.7 mg/g）。

三、链霉素分子印迹聚合物微球的特异选择性实验

以新霉素和双氢链霉素两种氨基糖苷类抗生素以及四环素为干扰物分别考察了分子印迹聚合物和非印迹聚合物的选择吸附性能。图6归纳了两种聚合物对对应分析物的饱和吸附量。结果显示，分子印迹聚合物对分析物的吸附能力跟这些物质与链霉素分子的结构相似性成正相关，和链霉素分子的结构越接近的分析物，选择吸附性能越强。这进一步证明了分子印记聚合物中形成了与模板分子有亲和性的特异位点。

四、链霉素分子印迹固相萃取条件的优化

准确称取一定质量的分子印迹聚合物微球和非印迹微球，湿法装柱，填料的顶端和底端分别装有聚四氟乙烯筛板，溶剂预处理后待用。设定一系列方案对固相萃取条件进行优化（包括上样条件，淋洗条件及洗脱条件等），收集每一步的流出液，通入氮气流浓缩，溶于样品稀释液中，在HPLC上进行测定。

五、实际样品中的链霉素残留的在线净化和富集

将经过前处理后的实际样品溶液（空白样品和加标样品）倒入活化后的固相萃取柱，然后利用抽真空，加压或离心的方法使样品进入吸附剂；注入淋洗剂洗掉弱保留干扰化合物并弃去流出液；最后注入洗脱液，收集流出液于磨口减压浓缩瓶中，通入氮气流浓缩，溶于样品稀释液中，在HPLC上进行测定。

选取链霉素分子印迹聚合物微球作为测试样本，检测其在加标的蜂蜜、牛奶、猪肉、猪肝脏和猪肾脏样品中对链霉素残留的分离提取效率。图7归纳了其对五种加标样品中链霉素残留回收率，各样品浓度按照对应物质中国家质检总局规定的最大残留限进行加标。从图中可以看出，对于所有五种加标样品，链霉素分子印迹聚合物微球都表现出了比非分子印迹聚合物微球更强的吸附效能。其中最高的回收率在牛奶样品中得到，尽管加标样品中的链霉素残留浓度极高，仍然获得了超过94%的回收率。值得注意的是，测试所选用的所有样品都是在水溶液中直接加标，未添加额外的有机溶解和其他处理步骤，这大大降低了有机溶剂大量使用造成的污染，同时减少了操作难度和成本。

六、链霉素分子印迹聚合物重复使用稳定性测试

本发明考察了所制备的链霉素分子印迹聚合微球的稳定性和再生性。已经吸附了链霉素残留的链霉素分子印迹聚合微球经体积比9:1的甲醇/醋酸混合洗脱液索氏提取30小时后，可再次用于对链霉素抗生素残留的吸收和富集。经12次使用后的链霉素分子印迹聚合物微球对链霉素残留的吸附性能测定的结果如图8所示。从图中可以看出，尽管经过十多次的重复使用，再生的链霉素分子印迹聚合微球并未表现出来明显的吸附能力的降低。由于所使用的再生方法操作简单，再生链霉素分子印迹聚合微球吸附效能稳定，本发明制备的链霉素分子印迹固相萃取柱可作为大范围的推广使用。

本发明针对当前液相色谱检测动物源性食品中氨基糖苷类抗生素兽药残留中样品前处理和分析过程复杂繁琐，衍生化条件通用性差，灵敏度有待提高，而普通的固相萃取材料对目标物的特异性吸附能力不高，同时对于痕量物质残留的富集倍数不高，达不到测定的要求等问题与不足，提出采用分子印迹固相萃取技术，通过合理设计，细致优化，借助表面印迹法和溶胶凝胶法制备得到氨基糖苷类抗生素（代表链霉素）的分子印迹聚合物微球，并对其特异性和亲和力进行评价，同时对分子印迹聚合物微球的作用机理进行研究，最后将此聚合物微球组装成分子印迹固相萃取柱，通过流动注射在线富集与高效液相色谱联用技术更快速，更灵敏，更准确的检测出实际样品中的主要违禁药物残留。本发明建立起一种基于分子印迹材料的违禁药物分子残留前处理技术，为加强氨基糖苷类抗生素的有效检测和监管提供了新型的吸附材料和方法，对推动食品安全、兽药残留检测技术的建立和保护人类健康具有重要意义。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，其特征在于：在柱形壳体内装填有分子印迹聚合物微球，柱形壳体的两端分别设有聚四氟乙烯筛板；所述分子印迹聚合物微球通过如下步骤制得：

1）首先对硅胶进行活化；

2）以3-氨基丙基三乙氧基硅烷和苯基三乙氧基硅烷之一或者两者任意比例的混合物为功能单体，正硅酸乙酯为交联剂，氨基糖苷类抗生素为模板分子，采用溶胶凝胶法进行水解缩合，在活化硅胶的表面形成Si-O-Si键的刚性网络结构，形成聚合物微球；

2.根据权利要求1所述的氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述溶胶凝胶法进行水解缩合具体步骤为：将1M模板分子溶入60ml四氢呋喃和10ml双蒸水的混合溶液中搅拌30分钟，然后加入2M功能单体；电磁搅拌30分钟后再加入8M正硅酸乙酯，再搅拌30分钟加入1g第1）步的活化硅胶；30分钟后加入10ml无水乙醇和对应催化剂；混合物在20℃下电磁搅拌反应30小时；将所得产物离心分离，并用无水乙醇和去离子水交替清洗除去未反应完全的试剂，然后70℃真空干燥30小时，即得到聚合物微球。

3.根据权利要求1所述的氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述硅胶活化工艺为，将硅胶浸泡入一定浓度的硝酸溶液中，恒定温度下搅拌活化恒定时间，然后将处理后的硅胶过滤并用去离子水反复洗涤至中性，真空干燥至恒重即可。

4.根据权利要求1所述的氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，其特征在于：所述硅胶活化工艺为，将硅胶浸入浓度为的6M的浓硝酸溶液中50℃条件下回流4个小时，溶液用电磁加热套电磁恒温搅拌，搅拌速度420rpm；然后将所得产物离心分离并用去离子水反复洗涤至中性，最后置于70℃的烘箱中，真空干燥12小时即可。

5.根据权利要求1所述的氨基糖苷类药物分子印迹固相萃取柱，其特征在于：第3）步模板分子的洗脱方法为，用1:4的冰醋酸/甲醇混合溶剂对所得聚合物微球索氏提取30小时。