CN105784870A - 一种在线固相萃取瘦肉精的方法 - Google Patents

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陈学松
罗达龙
文俊萍
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Abstract

本发明公开了一种在线固相萃取瘦肉精的方法，旨在提供一种检测方便，检测速率高，可重复性好的在线固相萃取瘦肉精的方法；该方法依次包括下述步骤：称取粉碎样品2.00g加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取；称取粉碎样品2.00g，加入1μg/ml标准对照液1.00ml，加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取；属于化学检测技术领域。

Description

一种在线固相萃取瘦肉精的方法
技术领域
本发明公开了一种萃取瘦肉精的方法，具体地说，是一种在线固相萃取瘦肉精的方法，属于化学检测技术领域。
背景技术
瘦肉精是一类动物用药，而不是一种特定的物质，是指能够促进瘦肉生长的饲料添加剂。任何能够促进瘦肉生长、抑制肥肉生长的物质都可以叫做“瘦肉精，有数种药物被称为瘦肉精，例如莱克多巴胺(Ractopamine)及克伦特罗(Clenbuterol)等。将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。但因为考虑对人体会产生副作用，各国开放使用的标准不一。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种检测方便，检测速率高，可重复性好的在线固相萃取瘦肉精的方法。
为解决上述问题，本发明提供的技术方案是这样的：
一种在线固相萃取瘦肉精的方法，依次包括下述步骤：
1)样品提取
称取粉碎样品2.00g加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取；
2)回收样的制备
称取粉碎样品2.00g，加入1μg/ml标准对照液1.00ml，加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取。
进一步的，上述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，所述的提取液是0.1％甲酸水和乙腈按照体积比10:90混合而得。
进一步的，上述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，所述的SPE柱为TurboFlowCycloneP0.5mmid×50mm。
进一步的，上述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，所述的阀切换时间为1min。
进一步的，上述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，所述的SPE冲洗时采用冲洗液为水与乙腈按照体积90:10混合。
跟进一步的，上述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，所述的所述的SPE冲洗时冲洗速率为1ml/min。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案,本发明提供的技术方案克服了quechers法存在明显基质效应；SPE-PCX因为专属性更好，基质效应较低，在线SPE法：通过考察用纯水配制线性与基质提取液配制的线性以及同同等浓度的回收样数据比较，其相差较小，可排除基质效应；另外，在线SPE法人工参与少，结果重现性好，只需称样、加提取液、震荡、离心、过滤即可，样品量不大时优势较大；quechers法次之，人工参与最多，强度大，但成本较低；SPE-PCX最慢，人工参与较多，成本最高，但批量很大时，时间效率最高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
本发明所涉及到的百分浓度，没有特别说明的，液体均为体积浓度，溶质为固体的指质量浓度。
样品提取：称取粉碎样品2.00g加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤。上机。
回收样的制备：称取粉碎样品2.00g，加入标准对照液(1μg/ml)1.00ml，加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤。上机。
对照溶液：50ng/ml。
一、柱子峰型以及对目标物保留比较
考察目的：选择spe柱对对照溶液冲洗后，富集容量。以响应值与峰型评价。
在各优化条件下，分别使用三根柱子对对照溶液中瘦肉精三个目标物进行测定，考察其对目标物的保留效果，结果如下：
分别为：
CAPCELLPAKMFC82.00mmid×50mm5μm以下简称资生堂C8(主要是通过排阻原理去除大分子杂质以及C8的反相作用富集小分子待测成分)
TurbolflowCycloneP0.5mmid×50mm以下简称CycloneP(涡流色谱原理，快速清除大分子，利用反相作用富集小分子待测成分，相对于Cyclone对于极性较大的目标物吸附力更强。)
TurbolflowCyclone0.5mmid×50mm以下简称Cyclone
三根不同柱子对目标物的响应值：
相比较下，峰型：资生堂C8>Cyclone>CycloneP；响应值：CycloneP>资生堂C8>Cyclone，并且Cyclone柱对沙丁胺醇近乎毫无保留，综合以上，CycloneP柱子较好；
二、提取液不同甲酸浓度的考察
考察目的：我们选用不同的溶剂对目标物的提取率进行考察，以样品加标回收率评价。
基于之前所做的实验数据显示，样品用水、中性缓冲盐、有机溶剂提取不完全。原因可能是瘦肉精都是生物碱，为了提高提取率，因此，分别用0.1％甲酸水、0.5％甲酸水、1.0％甲酸水与乙腈的比例均为9:1提取回收样品，以及单纯提取基质液配制对照液，比较其数据，发现在提取过程，提取液经4000r/min离心5min后，回收率是0.1％甲酸水＞0.5％甲酸水＞1.0％甲酸水，而通过比较纯对照液与取基质液配制的对照液比较，样品的相应仍然受到干扰，因此选择用0.1％甲酸水溶液与乙腈(90:10)作为样品提取液。
三、提取液有机相比例考察：
考察目的：选用适当的有机相比例对目标物的最大提取率。以样品加标回收率评价。
确定提取液甲酸水的浓度后，为筛选出相对好的提取液并且提高样品回收率，我们通过改变0.1％甲酸水与乙腈的比例，来观察其回收率，结果如下：
柱子：CycloneP
提取液0.1％甲酸水：乙腈
由数据可看出，提取液0.1％甲酸水：乙腈＝10:90时回收率较高
四、涡流流速的比较
考察目的：选取在冲洗阶段，选择适宜的涡流流速，将基质排阻最大化。以对照溶液的响应值评价。
基于CycloneP最佳涡流速度为0.5—4ml/min。因此分别实验了0.5、1、2、3ml/min.响应值1ml/min＞2ml/min＞3ml/min＞0.5ml/min。
因此，为保证尽可能去杂、且不影响目标物的截留，选用1ml/min。
五、六通阀阀时间切换的考察
考察目的：选用适宜阀切换时间，为确保前期杂质的冲洗更彻底以及目标化合物富集在SPE柱更完全。以加标溶液的响应值评价。
我们分别考察了六通阀阀时间切换的最优时间，结果如下：
沙丁胺醇 克伦特罗 莱克多巴胺
0.3min 7500 12000 30000
0.5min 12500 38000 57000
1min 53000 47000 98000
结果显示，在1min切换阀能让目标物富集在柱子上更多，更能在将大分子杂质冲洗更完全的情况下，让目标物损失更少。
六、SPE柱冲洗流动相比例考察
考察目的：为了提高目标物的更高响应，检测限可以做到更低，优化SPE柱的条件，通过改变SPE柱冲洗流动相比例来观察其变化，其结果如下：
考察条件：
水 97 90 80 70 60
乙腈 3 10 20 30 40
由于乙腈大于10时，沙丁胺醇基本无保留，只有两个成分峰，所以最终选择比例为水：乙腈(97:3)和(90:10)来比较，其响应值分别为
水：乙腈(97:3) 水：乙腈(90:10)
沙丁胺醇 23708 49597
克伦特罗 33256 50936
莱克多巴胺 40290 99378
以上表格显示表明，SPE柱冲洗流动相比例水：乙腈(90:10)的峰高值比水：乙腈(97:3)高出一倍多，因此，最终确定选择其流动相为水：乙腈(90:10)。
七、重复性考察
筛选好以上各方面的条件，保存其方法，由于之前一直是只用一份样品做回收样考察其条件，为消除不同样品对回收率的影响，我们分别取了7份不同样品(均加入标准液一样，最终浓度一致，50ng/ml)做样品加标，统计其数据，考察其样品重复性，(冲洗SPE柱流速为1ml/min)结果如下：
以上数据显示，在不同样品中，其三个目标物的相应差距较小，相对标准偏差均小于5％，证明其重复性较好
八.SPE冲洗后的物质考察
对溶剂空白、样品空白，进行在线SPE后的scan，另色谱柱的冲洗设为3min，可保证将色谱柱内杂质冲洗干净，保护色谱柱与质谱。本次实验检出限可远低于0.01ng/ml，即0.1μg/kg(方法检出限)。
由上述结果可知，虽然在样品空白相对应出峰出存在m/z400～500干扰，但总体不影响三个目标物的响应，无基质效应。且方法检出限在未加电子倍增器电压和进样量为5μl下，目标物信噪比还有11.1。
九、标准曲线线性对比
考察目的：2位实验人员，分别用纯化水和基质空白配制线性作对比。
分别是：混合标准对照液(100ng/ml)
线性曲线(1)分别吸取上述混合标准对照液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0ml至10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度；
线性曲线(2)，称取SP20150050样品两份4.00g，加入提取液0.1％甲酸-乙腈(1:9)定容至40ml，震荡提取5min，取上清液混合备用，分别吸取上述混合标准对照液0.1、0.5、1.0、2.0、5.0ml至10ml容量瓶中，用上述备用清液定容至刻度；得线性曲线(2)其结果如下：
实验人员1：
R均大于0.998
实验人员2：
R均大于0.998
基质+s/s：
取(两份基质对照液响应平均)/(两份对照液响应平均)X100％
1ng/ml 5ng/ml 10ng/ml 20ng/ml 50ng/ml
沙丁胺醇 86.4 95.0 96.6 97.9 98.1
莱克多巴胺 103.7 98.8 93.5 98.2 99.5
克伦特罗 92.7 94.9 91.8 90.4 95.6
从以上数据看出，线性曲线(1)的纯对照液与线性曲线(2)数据基本一致，同时比较浓度均为50ng/ml的两个对照与上述比较，回收率接近100％，因此可排除基质效应问题。
十、综合考察条件
提取液：0.1％甲酸水：乙腈＝10:90
SPE柱：TurboFlowCycloneP0.5mmid×50mm
阀切换时间：1min
SPE冲洗：水：乙腈＝90:10，1ml/min
回收率：95～100％，RAD＜5％
检出限：满足且低于方法检出限0.1μg/kg。

Claims (6)

1.一种在线固相萃取瘦肉精的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)样品提取
称取粉碎样品2.00g加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取；
2)回收样的制备
称取粉碎样品2.00g，加入1μg/ml标准对照液1.00ml，加提取液至20ml，震荡5min，4000r/min离心5min，0.22μm滤膜过滤，注入全自动在线固相萃取。
2.根据权利要求1所述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，其特征在于，所述的提取液是0.1％甲酸水和乙腈按照体积比10:90混合而得。
3.根据权利要求1所述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，其特征在于，所述的SPE柱为TurboFlowCycloneP0.5mmid×50mm。
4.根据权利要求1所述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，其特征在于，所述的阀切换时间为1min。
5.根据权利要求1所述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，其特征在于，所述的SPE冲洗时采用冲洗液为水与乙腈按照体积90:10混合。
6.根据权利要求5所述的一种在线固相萃取检测瘦肉精的方法，其特征在于，所述的所述的SPE冲洗时冲洗速率为1ml/min。
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