CN102965332B

CN102965332B - 猪睾丸克隆细胞系及其生产猪瘟活疫苗的方法

Info

Publication number: CN102965332B
Application number: CN201110391978.1A
Authority: CN
Inventors: 张许科; 孙进忠
Original assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Current assignee: Pulaike Biological Engineering Co Ltd
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2011-11-30
Publication date: 2014-06-04
Anticipated expiration: 2031-11-30
Also published as: CN102965332A

Abstract

本发明提供的一种高感染猪瘟病毒的猪睾丸克隆细胞株ST-B2，保藏号为CCTCC NO:C2011101。以及该猪睾丸克隆细胞的制备方法，包括以下步骤：1)将猪睾丸细胞进行有限稀释进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；2)选择对猪瘟病毒感染率最高的猪睾丸细胞的亚克隆株即为猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞。本发明还提供了上述猪睾丸克隆细胞制备高滴度的猪瘟病毒液和猪瘟活疫苗的方法。本发明的猪睾丸克隆细胞，对猪瘟病毒感染率高，使用该猪睾丸细胞系ST克隆细胞株ST-B2以带毒传毒的方法生产的猪瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗纯净性好；带毒传毒的方法使得每次复苏的细胞可以持续传代达至少15代，减少了复苏细胞与接毒的次数，简化了生产工艺，提高了生产效率。

Description

猪睾丸克隆细胞系及其生产猪瘟活疫苗的方法

技术领域

本发明涉及一种动物细胞生产猪瘟活疫苗的方法及产品，特别是指一种使用猪睾丸克隆细胞系生产猪瘟活疫苗的方法及产品。

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种高度接触性传染病，不同年龄、性别和品种的猪均能感染，死亡率高达80-90％。猪瘟被世界世界动物卫生组织划分为A类疾病，我国将其划分为一类疾病。中国学者培育成功的猪瘟兔化弱毒苗是目前世界上公认的安全和有效的疫苗，借助于C株疫苗密集接种和综合防制措施，有关国家已经有效地控制了猪瘟，甚至消灭了猪瘟。在我国，猪瘟流行出现典型猪瘟与非典型猪瘟共存、持续感染与隐性感染共存、免疫耐受和带毒综合征共存等，因此，猪瘟新的流行形式给我国养猪业防治本病提出了新的挑战。

疫苗接种仍是我国目前防治猪瘟的主要措施，我国目前生产猪瘟兔化弱毒苗用的细胞有牛睾丸细胞、猪肾细胞(IBRS-2或PK15细胞系)、猪睾丸细胞(ST细胞)。但在该疫苗生产实践中证实用上述细胞生产的疫苗，其病毒滴度不高，生产工艺不稳定，特别是病毒滴度随细胞传代数的增加迅速降低，导致疫苗批次之间的差异很大。

此外，由于牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒同属于黄病毒科瘟病毒属，两种病毒的同源性很高，因此污染了BVDV的牛睾丸细胞或犊牛血清都会造成疫苗污染，而我国牛群中病毒性腹泻病毒(BVDV)的感染率很高，用这样的动物细胞生产的猪瘟活疫苗免疫猪，往往造成免疫失败，引起严重的后果。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种猪睾丸克隆细胞，及其生产猪瘟活疫苗的方法及产品。

本发明提供的一种高感染猪瘟病毒的猪睾丸克隆细胞，命名为猪睾丸细胞系(swine testicular cell lines)克隆株ST-B2，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2011101，保藏日期为2011年11月07日。

本发明中猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞，是指对猪瘟病毒感染高的猪睾丸克隆细胞，特别指可以生产高滴度的猪瘟病毒的猪睾丸克隆细胞，也即指可以生产高效价的猪瘟活疫苗的猪睾丸克隆细胞。

本发明还提供了一种如上所述的猪睾丸克隆细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将猪睾丸细胞进行有限稀释进行细胞克隆和亚细胞克隆，获得亚细胞克隆株；

2)选择对猪瘟病毒感染率最高的猪睾丸细胞的亚克隆株即为猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞。

优选地，本发明如上所述的使用猪睾丸克隆细胞的制备方法中，所述的步骤1)为使用未被病毒感染的猪睾丸细胞，经胰蛋白酶消化为单细胞后进行梯度稀释，分别在37℃ 5％CO₂的条件下培养于96孔细胞培养板中培养至肉眼可见细胞克隆后，进行亚细胞培养，获得亚克隆细胞株；

优选地，本发明如上所述的使用猪睾丸克隆细胞的制备方法中，所述的步骤2)为将猪睾丸细胞亚克隆株接种于96孔细胞培养板中，接种猪瘟病毒于37℃ 5％CO₂的条件下培养2h，使用免疫过氧化酶单层细胞试验法检测感染病毒最多的细胞，选择对猪瘟病毒感染率最高的猪睾丸细胞的亚克隆株即为猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞。

本发明还提供了一种如上所述的猪睾丸克隆细胞用于高滴度的猪瘟病毒液的制备方法，将上述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5％CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例传代，同时收获传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液。

优选地，本发明如上所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法中，所述传代次数为可以大于15代。

优选地，本发明如上所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法中，所述的病毒滴度为大于10^6.0TCID₅₀/ml。

本发明还提供了一种使用如上1所述的猪睾丸克隆细胞生产猪瘟活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)生产用种子批病毒液的制备：将权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5％CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例传代2次，同时收获第二代、第三代的传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液；

2)制苗用病毒液的制备：权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞长满单层后，用含0.5％EDTA的胰酶进行消化，采用同步接种的方法接种含5％生产种子批毒的细胞维持液，置37℃含5％二氧化碳的培养箱中培养3-4天，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例用胰酶消化进行传代，同时收获病毒上清，用同样的方法传代至少15代，每代都收取病毒上清液作为制苗用毒液；

3)病毒液的制苗：将上述收获的病毒液加入冻干保护剂，冻干，即可获得猪睾丸克隆细胞生产的猪瘟活疫苗。

优选地，本发明如上所述的猪睾丸克隆细胞生产猪瘟活疫苗的方法中，所述的活疫苗的效价为每头份病毒含量≥9000个家兔感染量，每头份含细胞毒液≥0.01ml。

因此，本发明提供了使用如上所述的猪睾丸克隆细胞，生产制备获得了一种高滴度的猪瘟病毒液，以及高效价的猪瘟活疫苗。

由上可以看出，本发明通过大量细致试验获得了一株对猪瘟病毒感染率高的猪睾丸细胞，使用该猪睾丸细胞系ST克隆细胞株ST-B2，以带毒传毒的方法生产的猪瘟疫苗，病毒滴度高，不易受到BVDV的污染，疫苗纯净性好；带毒传毒的方法使得每次复苏的细胞可以持续传代达至少15代，减少了复苏细胞与接毒的次数，简化了生产工艺，并提高了生产效率。

生物材料保藏信息

猪睾丸细胞系克隆株ST-B2，保藏在中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址中国武汉武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2011101，保藏日期为2011年11月07日。

具体实施方式

本发明所用生长液配方为：91％v/vDMEM液、9％v/v犊牛血清PH调整为7.1；所述维持液的配方为：98％v/vDMEM液、2％v/v犊牛血清PH调整为7.3；猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒株，购自中国兽医药品监察所，菌株保藏编号CVCC AV1412。

本发明的实施例可以分为以下方面：

1.敏感均一生长性能良好的ST细胞的克隆

(1)母ST细胞的筛选；(2)CSFV感染ST细胞检测方法的建立与稳定；(3)单个ST细胞亚群的培养；(4)阳性ST细胞克隆的筛选；(5)阳性ST细胞的亚克隆；(6)CSFV在ST阳性克隆细胞上产生毒价的测定；(7)ST阳性克隆细胞的稳定性鉴定。

2.克隆细胞的培养及带毒细胞传毒

(1)克隆细胞用胰酶消化后，接种含毒的细胞维持液；(2)待细胞长成单层后，按1∶3传代，同时收获细胞上清，收获的第二、第三代上清作为生产种子批毒；(3)用同样的方法收获细胞上清，作为疫苗用毒液，带毒传毒可以传代至少15代以上

为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。如未特别声明，本发明的一般实验方法可使用本领域常用的试验方法进行。

本发明实施例中的细胞生长液为：91％v/vDMEM液、9％v/v犊牛血清PH调整为7.1；

本发明实施例中的细胞维持液为：98％v/vDMEM液、2％v/v犊牛血清PH调整为7.3。

实施例1：ST克隆细胞的筛选和利用该细胞生产猪瘟活疫苗的方法

一、母ST细胞的筛选

1.细胞纯净性检验：无支原体污染

2.外源病毒检测以牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrheavirus，BVDV)为例进行说明外源病毒检测方法。

利用PCR技术，对ST细胞进行牛病毒性腹泻病毒(Bovine ViralDiarrhea Virus，BVDV)检测。结果ST细胞应不携带BVDV。检测方法：用胰酶消化在T25细胞瓶生长的单层ST细胞，收获细胞，1000rpm离心10min，弃去上清液，用PBS洗一遍，离心收集细胞沉淀。参考Invitrogen的TRIzol说明书，提取细胞总RNA。提取的RNA进行反转录后获得的cDNA作为PCR模板，采用BVDV特异性引物，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，扩增出目的条带者携带BVDV，未扩增出目的条带者则不携带BVDV。

用同样的方法进行RNA病毒：猪瘟病毒(Classical Swine feverVirus，CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus，PRRSV)的检测。

对于DNA病毒猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)及猪伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus)的检测也采用PCR的方法进行，提取细胞DNA后，直接进行PCR扩增。

检测结果表明：BVDV、CSFV、PRRSV、PCV、PRV全部为阴性。

二、单个ST细胞及其亚群的培养

对处于对数生长期的单层ST细胞用胰酶消化成单个细胞，尽可能分散，并进行细胞计数，然后采用有限稀释法，按照8个细胞/ml的密度，每孔100μl的细胞生长液的量加入96孔细胞培养板中，对含有单个细胞的孔进行标记后，将96孔板置于含5％ CO2，37℃细胞培养箱中培养直至产生肉眼可见细胞克隆为止。在此过程中可依据细胞生长情况，对克隆细胞进行换液。当孔内的细胞生长达到单层时，将其消化下来，置于24孔细胞培养板中，于含5％CO₂，37℃细胞培养箱中继续培养。当细胞长满24孔后，将其消化后，置于6孔板中继续培养，如有可能，对克隆的细胞进行冻存保种，以备用。条件培养基收集后10000rpm，离心10min后，0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片。

三、高感染性的ST细胞克隆的筛选

将6孔板上扩大培养的ST细胞亚群，用胰酶消化后进行细胞计数，按照2×10⁴个cell/每96孔，接种96孔细胞培养板，重复1孔，接种24h后接毒CSFV病毒液，以MOI＝0.1的接毒量接种病毒，每孔加入200μL病毒原液，37℃孵育1h后，弃掉病毒液，加入细胞维持液，于5％CO2，37℃温箱中培养2d后，用免疫过氧化酶单层细胞试验检测细胞感染病毒情况，阳性细胞数多的孔为CSFV感染率高的ST细胞亚群，为所需的高感染性的ST克隆细胞。然后将其在6孔板上扩大培养，用胰酶消化，并进行第2次或者3次克隆，每次克隆都需要做CSFV感染性检测，以达到纯化的具备高感染性的ST克隆细胞的目的。

实施例2ST克隆细胞培养和生产猪瘟病毒的方法

获得的高感染性的ST克隆细胞株ST-B2(保藏号CCTCCC2011101)用胰酶消化后，同步接种生产种子批毒，37℃温箱中培养3-4d，按照1∶3(体积比)的比例传代，同时收获上清作为制苗用毒液进行冷冻保存，依同样的方法传代至少15代，收获每代的病毒上清作为制苗用毒液。

1、CSFV在阳性ST克隆细胞株ST-B2上病毒滴度的测定

将带毒传毒方法传代获得的CSFV病毒在高感染性克隆细胞ST-B2上连续增殖培养，采用间接免疫荧光方法测定收获的每个代次的CSFV病毒液的滴度，具体如下：将处于对数生长期的ST-B2细胞用胰酶消化，每孔200μL铺到96孔板内，待长满单层后，按照10^-1-10^-8稀释CSFV病毒液，并加入96孔板中，每个稀释度6个孔，3-4天后，弃去培养基，PBS洗两次，用冰甲醇固定细胞10分钟，然后加1％BSA进行封闭30分钟，PBS洗两次后，加入稀释好的一抗，37℃孵育2h后，PBS洗5次，加入稀释好的二抗，37℃孵育1h，PBS洗5次，然后在倒置显微镜下观察每个孔里的荧光，利用Reed-Muench两氏法计算出病毒的滴度。连续生产3批的病毒滴度分别为：20101101批病毒滴度为10^7.0TCID₅₀/ml、20101102批病毒滴度为10^6.92TCID₅₀/ml、20101103批病毒滴度为10^7.27TCID₅₀/ml。

2、阳性ST克隆细胞株ST-B2的稳定性鉴定

对阳性ST克隆细胞株ST-B2进行连续传代30代，细胞生长状态良好，并且每隔5代将细胞接种CSFV病毒，测定CSFV滴度，病毒滴度稳定在10^6.5TCID₅₀/ml左右，选取10代以内的克隆细胞作为生产用种子批细胞。

3、生产用种子批毒的制备

ST-B2细胞长满单层后，用含0.5％EDTA的胰酶进行消化后，采取同步接种的方法以MOI＝0.1接种量含新鲜脾毒的细胞维持液，置37℃含5％二氧化碳的培养箱中培养2-3天，待细胞长满单层后，按照用胰酶消化后按照1∶3的比例进行传代，同时收获病毒上清，收获的第二、第三代病毒上清作为生产种子批毒。

4、制苗用细胞毒液的制备

ST-B2细胞长满单层后，用含0.5％EDTA的胰酶进行消化，采用同步接种的方法接种含5％v/v生产种子批毒的细胞维持液，置37℃含5％二氧化碳的培养箱中培养3-4天，待细胞长满单层后，按照1∶3的比例用胰酶消化进行传代，同时收获病毒上清，用同样的方法传代至少15代，每代都收取病毒上清作为制苗用毒液，保存于-70℃冰箱。

5、猪瘟活疫苗的制备及效力检验

按现行《中华人民共和国兽药典》对制苗用毒液进行检验，结果无细菌、霉菌、支原体生长。细胞毒液对猪安全无副作用，20101101、20101102、20101103批病毒滴度分别为10^7.0TCID₅₀/ml、10^6.92TCID₅₀/ml、10^7.27TCID₅₀/ml。各收次的病毒液加入冻干保护剂，冻干制成猪瘟活疫苗，疫苗批次为20101101、20101102、20101103，分别用家兔测定，每头份病毒含量≥9000个家兔感染量，每头份含细胞毒液≥0.01ml。

用家兔效检疫苗效力的方法如下：

(1)每收次的病毒液用灭菌生理盐水稀释3×10⁵倍、4×10⁵倍、5×10⁵倍、6×10⁵倍、7×10⁵倍、8×10⁵倍、9×10⁵倍、10⁶倍，耳静脉注射体重1.5～3.0kg家兔2只，每只兔耳静脉注射1ml。家兔接种后，上下午各测体温1次，48小时后，每隔6小时测体温1次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。

①家兔接种疫苗后，体温反应标准如下：

定型热反应(++) 潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温1℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反应可判为定型热。

轻热反应(+) 潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0.5℃以上，并稽留12～36小时。

可疑反应(±) 潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。

体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。

无反应(-)体温正常。

②结果判定：

注苗后，当2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。

注苗后，当1只家兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)；或2只兔均呈轻热反应(+)时，可在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂。每兔耳静脉注射1ml。

攻毒后的体温反应标准如下：

热反应(+)潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。

可疑反应(±)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。

无反应(-)体温正常。

攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。

注苗后，如有1只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(±)或无热反应(-)，可对可疑反应兔或无反应兔采用剖杀或采心血分离病毒的方法，判明是否隐性感染；或注苗后，2只兔均呈轻热反应，亦可对其中1只兔分离病毒。方法是：接种疫苗后96～120小时之间，将兔剖杀，采取脾脏，用生理盐水制成50倍稀释乳剂(脾乳剂应无菌)，或采取心血(全血)，接种2只家兔，每只兔耳静脉注射1ml。凡有1只兔潜伏期24～72小时出现定型热反应(++)，疫苗可判为合格。

注苗后，出现其它反应情况无法判定时，可重检。用家兔做效检，不应超过3次。经检验，三个收次所制备的活疫苗均合格，具体结果为20101101批次疫苗1/(3×10⁵)、1/(4×10⁵)、1/(5×10⁵)、1/(6×10⁵)、1/(7×10⁵)、1/(8×10⁵)6个稀释度耳静脉注射家兔各2只，每只1ml，根据体温反应知呈现2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。而1/(9×10⁵)、1/10⁶两个稀释度耳静脉注射家兔各2只，每只1ml，根据体温反应知1只家兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈可疑反应(±)，在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒，即猪瘟兔化弱毒株通过兔体继代，采集定性热反应兔的脾脏作为种毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为100倍乳剂。每兔耳静脉注射1ml。攻毒后，2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。20101102批次疫苗1/(3×10⁵)、1/(4×10⁵)、1/(5×10⁵)、1/(6×10⁵)、1/(7×10⁵)、1/(8×10⁵)、1/(9×10⁵)7个稀释度耳静脉注射家兔各2只，每只1ml，根据体温反应知呈现2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。而1/10⁶稀释度耳静脉注射家兔2只，每只1ml，根据体温反应知1只家兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈可疑反应(±)，在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒，即猪瘟兔化弱毒株通过兔体继代，采集定性热反应兔的脾脏作为种毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为100倍乳剂。每兔耳静脉注射1ml。攻毒后，2只对照兔均呈定型热反应(++)，而2只注苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。20101103批次疫苗1/(3×10⁵)、1/(4×10⁵)、1/(5×10⁵)、1/(7×10⁵)、1/(8×10⁵)5个稀释度耳静脉注射家兔各2只，每只1ml，根据体温反应知呈现2只家兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。而1/(6×10⁵)、1/(9×10⁵)、1/10⁶3个稀释度耳静脉注射家兔各2只，每只1ml，根据体温反应知1只家兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈可疑反应(±)，在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒，即猪瘟兔化弱毒株通过兔体继代，采集定性热反应兔的脾脏作为种毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为100倍乳剂。每兔耳静脉注射1ml。攻毒后，2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(-)，疫苗判合格。详细见表1。

表1家兔效检疫苗效力的结果

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种猪瘟病毒的高感染性猪睾丸克隆细胞，其特征在于，保藏号为CCTCC NO：C2011101。

2.一种使用权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞制备高滴度的猪瘟病毒液的方法，其特征在于，将权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5%CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1:3的比例传代，同时收获传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液。

3.根据权利要求2所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法，其特征在于，所述传代次数为等于或大于15代。

4.根据权利要求2所述的高滴度的猪瘟病毒液的制备方法，其特征在于，所述的病毒滴度为大于10^6.0TCID₅₀/ml。

5.如权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞在生产猪瘟病毒中的应用。

6.一种使用权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）生产用种子批病毒液的制备：将权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞用胰酶消化后，同步接种含新鲜脾毒的细胞维持液，37℃含5%CO₂温箱中培养2-3d，待细胞长满单层后，按照1:3的比例传代2次，同时收获第二代、第三代的传代细胞的上清病毒液即可获得高滴度的猪瘟病毒液；

2）制苗用病毒液的制备：权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞长满单层后，用含0.5%EDTA的胰酶进行消化，采用同步接种的方法接种含5%生产种子批毒的细胞维持液，置37℃含5%二氧化碳的培养箱中培养3-4天，待细胞长满单层后，按照1:3的比例用胰酶消化进行传代，同时收获病毒上清，用同样的方法传代至少15代，每代都收取病毒上清液作为制苗用毒液；

3）病毒液的制苗：将上述收获的病毒液加入冻干保护剂，冻干，即可获得猪睾丸克隆细胞生产的猪瘟活疫苗。

7.根据权利要求6所述的猪睾丸克隆细胞生产猪瘟活疫苗的方法，其特征在于，所述的活疫苗的效价为每头份病毒含量≥9000个家兔感染量，每头份含细胞毒液≥0.01ml。

8.如权利要求1所述的猪睾丸克隆细胞在生产猪瘟活疫苗中的应用。