CN103143007B - 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 - Google Patents
一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法。本发明依次经过生产用毒种制备、制苗材料制备、IBDV细胞病毒液制备、成品检验、配苗及分装、冻干等步骤制得IBDV活疫苗，本发明从接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等方面，对现有的生产方法进行了改良，独创了新的传代细胞培养方法。此外，还包括通过本发明方法制得的IBDV活疫苗在预防鸡传染性法氏囊病中的应用。由本发明方法制备得到的IBDV活疫苗具有耐热性能好，病毒滴度高，稳定性好，适合进行大规模疫苗生产的特点。
Description
技术领域
本发明为一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，属于生物疫苗领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病（Infeetious Bursal Disease，IBD）是由传染性法氏囊病毒(Infeetious Bursal Disease Virus，IBDV)引起的一种高度接触性传染病，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一，主要侵害雏鸡和青年鸡的法氏囊器官，该病的危害不仅直接造成鸡只死亡、增加淘汰率、影响增重，更重要的是破坏法氏囊中的B淋巴细胞，导致免疫抑制，使病鸡更易感其它疫病，对疫苗接种的免疫应答下降或丧失。
由于IBD在外界环境中较为稳定，采取消毒和隔离措施来控制本病不易达到目的。本病至今仍无有效的治疗方法，预防该病最行之有效的办法就是疫苗的接种。目前，市售的法氏囊疫苗绝大多数为鸡胚组织苗，相对于细胞苗而言，其具有成本高、产品质量批间差较大、且容易产生鸡源性潜在疾病的感染等缺点。2011年初，哈药集团生物疫苗有限公司分离了一株法氏囊病毒（命名为：H11株），其具有在鸡胚成纤维细胞上增值的特性，基于此，本研究针对该毒种良好的细胞噬性，从接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等方面，对现有的生产方法进行了改良，独创了新的传代细胞培养方法，按照本发明方法制备得到的活疫苗具有耐热性能好，病毒滴度高，稳定性好，适合进行大规模疫苗生产的特点，故而，申请人提出对优化过接种材料、培养液改良、培养环境维护、冻干保护剂组分等条件的新生产方法进行专利保护。
发明内容
本发明的目的为提供一种利用传代鸡胚成纤维细胞（CEF）制备传染性法氏囊病毒（IBDV）活疫苗的方法。按照本发明方法制备得到的活疫苗相较于鸡胚组织苗，病毒含量、产品合格率和免疫攻毒保护率都有显著的提高，疫苗的耐热性能显著，并且半成品阳性杂检率和单位体积的生产成本都有明显的降低。
本发明的一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）生产用毒种制备
①毒种繁殖
将毒种用灭菌生理盐水作103～104倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO2条件下，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20℃保存；
②毒种鉴定
符合生产用种子标准；
③毒种保存
在-20℃以下保存，不超过9个月；
④毒种继代
不超过3代；
（2）传代细胞的制备
取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，传代培养，传代次数不超过5代；
（3）传染性法氏囊病毒病毒液的制备
①接种
弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作103～104倍稀释，按培养液体积的1/10接种传代培养后的单层鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；
②培养
病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；
③病毒液收获
将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月；
（4）半成品检验
①无菌检验
每组病毒液分别取样，应无菌生长；
②病毒含量测定
每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗；
（5）配苗及分装
①冻干保护剂的制备
A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；
B液：维生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸钠1.5g，去离子水定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，不超过3天；
②分装
将保护剂A液、B液按1︰1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1︰1体积比加入保护剂中，定量分装；
（6）冻干
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
优选的，所述毒种为传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株，所述的适应株命名为H11株，分类命名为传染性法氏囊病毒，保藏编号为CGMCC NO.6910，保藏日期为2012年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院。
进一步的，本发明还提出了根据本发明所述的方法制备得到的传染性法氏囊病毒活疫苗。及
所述的传染性法氏囊病毒活疫苗在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
通过比较试验发现，本发明利用传代鸡胚成纤维细胞生产疫苗的新方法比利用鸡胚生产疫苗的老方法具有以下优点：
1.改进的细胞培养方法，病毒含量高于鸡胚培养和普通原代CEF培养方法。
2.病毒制造原料为传代鸡胚成纤维细胞，使产品质量均一，生产成本显著降低。
3.添加了还原性谷胱甘肽的改良型细胞培养液，使得病毒在增殖速度和产量上都优于目前鸡胚培养方法和普通原代CEF培养方法。
4.病毒培养过程添加NaHCO3，为病毒的增殖提供稳定的pH环境，延长了病毒增殖曲线高峰区的时间。
5.全过程不添加任何抗生素。
6.优化的耐热冻干保护剂组分，使成品保存条件为2～8℃保存。
7.细胞苗的免疫效力不低于利用鸡胚生产的传染性法氏囊活疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
材料和试剂：
毒株：传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株H11株，保藏编号为CGMCCNO.6910，保藏日期为2012年11月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院。
材料：9～10日龄SPF鸡胚为哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场种蛋在本研发中心孵化、鸡胚原代成纤维细胞由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心制备、0.22μm滤膜购自PALL公司。
试剂：还原型谷胱甘肽购自Sigma、胰酶购自Gibco、明胶购自Sigma、蔗糖购自国药化学试剂有限公司、糊精购自上海酶联生化试剂有限公司、胰蛋白胨购自Amresco、维生素C购自SIGMA、山梨醇购自Amresco、谷氨酸钠购自MBCHEM
实施例1利用传代鸡胚成纤维细胞生产IBDV H11活疫苗
（1）生产用毒种制备
①毒种繁殖
将毒种H11株（保藏编号为CGMCC NO.6910）用灭菌生理盐水作103～104倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO2条件下，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20℃保存；
②毒种鉴定
符合生产用种子标准；
③毒种保存
在-20℃以下保存，不超过9个月；
④毒种继代
不超过3代；
（2）传代细胞的制备
取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2%的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10%初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，即可使用；传代次数不超过5代；
（3）传染性法氏囊病毒病毒液的制备
①接种
弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作103～104倍稀释，按培养液体积的1/10接种传代培养后的单层鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；
②培养
病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；
③病毒液收获
将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月；
（4）半成品检验
①无菌检验
每组病毒液分别取样，应无菌生长；
②病毒含量测定
每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗；
（5）配苗及分装
①冻干保护剂的制备
A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；
B液：维生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸钠1.5g，去离子水定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，不超过3天；
②分装
将保护剂A液、B液按1︰1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1︰1体积比加入保护剂中，定量分装；
（6）冻干
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
试验例1利用鸡胚生产IBDV活疫苗
1、生产用毒种制备
（1）毒种繁殖
将毒种H11株（保藏编号为CGMCC NO.6910）用灭菌生理盐水作100～1000倍稀释后，经绒毛***途径接种10～12日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml。置37℃孵育，选接种48～120小时死亡鸡胚，收取病变胎儿及***，装于无菌容器内，同时吸取部分鸡胚液作无菌检验。将培养无菌的鸡胚、***剪碎混合，用普通肉汤或同批尿囊液制成5倍稀释的乳剂，离心去渣，上清液加适量的抗生素分装，-20℃保存。注明收获日期、毒种代次及装量。
（2）毒种鉴定
应符合生产用种子标准。
（3）毒种保存
在-10℃以下保存，应不超过6个月。
（4）毒种继代
应不超过3代。
2、制苗材料选择
选择发育良好，10～12日龄SPF鸡胚作为制苗材料。
3、制苗毒液的制备
（1）接种
取生产用毒种H11株，用灭菌生理盐水稀释50～100倍，每胚经尿囊腔或绒毛***接种0.1～0.2ml，封口后，置37℃继续孵育，不必翻蛋。
（2）孵育和观察
接种后，将36小时前死亡的鸡胚弃去。36小时后，每隔4～8小时照蛋一次，随时取出48～168小时死亡鸡胚，置2～8℃冷却。
（3）收获
将冷却4～24小时的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部，以无菌手术除去蛋壳，收获胎儿和***，分组置于无菌容器内，置-10℃以下冷冻保存。在收获的同时，应逐个检查胎儿病变，须具有传染性法氏囊病病毒H11株所引起的特异性病变。
4、半成品检验
（1）无菌检验
每组鸡胚分别取样，应无菌生长。
（2）病毒含量测定
每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗。
5、配苗及分装
将检验合格的鸡胚、鸡胚***磨碎，按适当比例加入5%蔗糖脱脂奶制成乳剂，同时加入适量的抗生素充分混匀，定量分装。
6、冻干
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
试验例2利用原代鸡胚成纤维细胞生产IBDV H11活疫苗
（1）生产用毒种制备
①毒种繁殖
将毒种H11株（保藏编号为CGMCC NO.6910）用灭菌生理盐水作103～104倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5%CO2条件下，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20℃保存；
②毒种鉴定
符合生产用种子标准；
③毒种保存
在-20℃以下保存，不超过9个月；
④毒种继代
不超过3代；
（2）制苗材料制备
取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，即可使用；
（3）传染性法氏囊病毒病毒液的制备
①接种
弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作103～104倍稀释，按培养液体积的1/10接种单层原代鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1%体积的10%还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；
②培养
病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2%的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80%细胞出现特异性病变时收获病毒液；
③病毒液收获
将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月；
（4）半成品检验
①无菌检验
每组病毒液分别取样，应无菌生长；
②病毒含量测定
每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗；
（5）配苗及分装
①冻干保护剂的制备
A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；
B液：维生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸钠1.5g，去离子水定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，不超过3天；
②分装
将保护剂A液、B液按1︰1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1︰1体积比加入保护剂中，定量分装；
（6）冻干
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
试验例3
通过本发明传代细胞培养获得的细胞毒与鸡胚培养获得的组织毒和普通原代CEF培养获得的细胞毒相比较，现将其中一些指标的比较结果总结如下：
表1两种种毒鸡胚毒力的比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 20/20 | 19/20 | 19/20 | 17/20 | 17/20 | 19/20 | 18/20 | 20/20 | 20/20 | 20/20 |
| 细胞毒 | 17/20 | 17/20 | 20/20 | 18/20 | 18/20 | 18/20 | 20/20 | 19/20 | 19/20 | 20/20 |
注：病变数/接种数
表2三种种毒病毒含量的比较（单位：10XELD50/0.2ml）
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织毒 | 6.1 | 5.9 | 6.5 | 6.1 | 5.7 | 5.7 | 6.3 | 6.1 | 6.1 | 6.3 |
| 原代细胞毒 | 6.3 | 6.3 | 6.5 | 6.1 | 6.3 | 6.1 | 5.9 | 6.1 | 6.3 | 6.1 |
| 传代细胞毒 | 6.7 | 6.9 | 6.9 | 6.7 | 6.5 | 6.9 | 6.7 | 6.7 | 6.9 | 6.7 |
表3两种种毒病毒TCID50的比较（单位：10XELD50/0.2ml）
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 原代细胞毒 | 6.7 | 6.7 | 6.9 | 6.5 | 6.7 | 6.3 | 6.3 | 6.7 | 6.9 | 6.5 |
| 传代细胞毒 | 7.1 | 7.5 | 7.5 | 7.3 | 7.7 | 7.7 | 7.1 | 7.1 | 7.7 | 7.3 |
如表1-3所示，本发明通过原代细胞培养获得的细胞毒相较于鸡胚培养获得的组织毒和普通原代CEF培养获得的细胞毒，病毒的毒力、病毒TCID50、病毒的含量较高。
试验例4
通过实施例1细胞培养制备的10批次IBDV H11株活疫苗（细胞苗）与通过试验例1组织培养制备的10批次IBDV H11株活疫苗（组织苗）相比较，结果如下：
表4 两种生产方法半成品杂检阳性率比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织苗 | 1% | 0 | 0 | 0.5% | 0 | 1% | 1.5% | 0 | 1% | 0 |
| 细胞苗 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表5 两种生产方法产品合格率比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织苗 | 99.9% | 100% | 100% | 100% | 100% | 99.5% | 100% | 98% | 100% | 99.9% |
| 细胞苗 | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
表6两种生产方法产品成本比较（单位：元/ml）
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织苗 | 1.22 | 1.21 | 1.21 | 1.20 | 1.20 | 1.21 | 1.22 | 1.22 | 1.21 | 1.25 |
| 细胞苗 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 | 0.60 |
表7两种生产方法制备的活疫苗不同保存温度病毒含量的比较
（单位：10XELD50/0.2ml）
两种生产方法疫苗免疫保护率的比较：
21～28日龄SPF鸡60只，由购自哈药集团生物疫苗有限公司SPF鸡场的SPF鸡胚自行孵化后使用。疫苗免疫组为2组，每组20只鸡，分别免疫细胞毒活苗（按照实施例2方法制备得到）和组织毒活苗（按照试验例1方法），点眼，1羽份/只，另20只作对照组。接种后21日，免疫组各取10只鸡、对照组取10只鸡，用10个法氏囊最小感染量的强毒BC6-85株点眼0.1ml，至72小时全部剖检，观察法氏囊变化，判断免疫效果，两种种毒活苗免疫保护率的比较如表8所示。
表8两种生产方法疫苗免疫保护率的比较
| 批次 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 组织苗保护率 | 80% | 100% | 90% | 80% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% | 100% |
| 细胞苗保护率 | 100% | 80% | 100% | 90% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% | 100% |
如表1-表8所示，利用传代细胞生产的疫苗与鸡胚培养和普通原代CEF培养方法生产的疫苗相比，保存温度由原来的-15℃储藏变为2～8℃保存；产品合格率和免疫攻毒保护率都有显著的提高；产品的耐热性能显著，而半成品阳性杂检率和单位体积的生产成本都有明显的降低，故细胞苗更能提升产品质量，节约生产费用，此方法在国内尚无在生产中使用的记载，处于国内领先水平。
Claims (2)
1.一种传染性法氏囊病毒活疫苗，其特征在于通过以下方法制备得到：
(1)生产用毒种制备
①毒种繁殖
将传染性法氏囊病毒毒种用灭菌生理盐水作103～104倍稀释后，接种单层鸡胚成纤维细胞；弃掉细胞培养液，按培养液体积的1/10接毒，37℃吸附1小时，加入培养液，并向其添加1％体积的10％还原型谷胱甘肽溶液；37℃，5％CO2条件下，培养3～4天，待80％细胞出现特异性病变时收获病毒液；于-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，-20℃保存；
所述的传染性法氏囊病毒毒种为传染性法氏囊病毒鸡胚成纤维细胞适应株，所述的适应株命名为H11株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.6910；
②毒种鉴定
符合生产用种子标准；
③毒种保存
在-20℃以下保存，不超过9个月；
④毒种继代
不超过3代；
(2)传代细胞的制备
取9～10日龄SPF鸡胚，制备鸡胚成纤维细胞，37℃培养，待细胞长成单层后，用质量分数为0.2％的胰酶溶液进行消化，加入原体积2倍的含10％初生牛血清的DMEM，吹打均匀，再取原体积细胞液至另外细胞培养瓶中培养，直至长成单层，传代培养，传代次数不超过5代；
(3)传染性法氏囊病毒病毒液的制备
①接种
弃掉细胞培养液，取生产用种毒，用灭菌生理盐水作103～104倍稀释，按培养液体积的1/10接种传代培养后的单层鸡胚成纤维细胞；37℃吸附1小时，加入培养液，并向其中添加1％体积的10％还原型谷胱甘肽溶液，轻轻混匀，37℃培养；
②培养
病毒接种24小时后，每6小时向培养液中加入总体积0.2％的0.5mol/LNaHCO3，培养3～4天，待80％细胞出现特异性病变时收获病毒液；
③病毒液收获
将装有病毒液的培养瓶，放入-20℃冰柜中反复冻融3次，收获于灭菌容器内，在-15℃以下保存，应不超过1个月；
(4)半成品检验
①无菌检验
每组病毒液分别取样，应无菌生长；
②病毒含量测定
每0.2ml病毒含量应为105.5EID50，方可配苗；
(5)配苗及分装
①冻干保护剂的制备
A液：明胶5g、蔗糖5g、糊精5g、胰蛋白胨2g，去离子水定容至100ml，116℃，高压灭菌30min，15℃保存，不超过7天；
B液：维生素C0.1g、山梨醇2g、谷氨酸钠1.5g，去离子水定容至100ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，不超过3天；
②分装
将保护剂A液、B液按1︰1体积混合均匀，将检验合格的细胞病毒液，按1︰1体积比加入保护剂中，定量分装；
(6)冻干
分装后迅速进行冷冻真空干燥。
2.权利要求1所述的传染性法氏囊病毒活疫苗在制备预防鸡传染性法氏囊病药物中的应用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310061699.8A CN103143007B (zh) | 2013-02-27 | 2013-02-27 | 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN201310061699.8A CN103143007B (zh) | 2013-02-27 | 2013-02-27 | 一种利用传代鸡胚成纤维细胞制备传染性法氏囊病毒活疫苗的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN103143007A CN103143007A (zh) | 2013-06-12 |
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