CN102892734B - 制备鲨烯的改良方法 - Google Patents

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Abstract

从含鲨烯组合物中制备鲨烯的改良方法，所述方法包括步骤(a)在温度T1进行纯化蒸馏;(b)在温度T2进行变性蒸馏;其中步骤(a)和(b)可以任一顺序进行;T1和T2足以使鲨烯沸腾;T2>T1;且T2>200°C。

Description

制备鲨烯的改良方法
本申请要求美国临时申请61/395,448（2010年5月12日提交）的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。
技术领域
本发明处于制造具有适于药学应用纯度的鲨烯的领域。
技术背景
鲨鱼肝油含有称为鲨烯的支链不饱和萜类化合物(C30H50；[(CH3)2C[＝CHCH2CH2C(CH3)]2=CHCH2-]2；2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳己烯；CAS RN 7683-64-9)。已知鲨烯用于人类疫苗中的水包油乳液，例如用于佐剂化流感病毒疫苗的MF59乳液。鲨烯还用于其他药物制品（如油膏、栓剂）和化妆品。
目前鲨烯的来源主要是鱼油，尤其是鲨鱼肝油。使用提取自鲨鱼肝油的鲨烯可产生相关问题，尤其是不能维持严格的制造标准时（如诺华公司（Novartis）生产MF59期间所用的那些）。例如，鲨鱼可被对人也有感染性的病原体感染，或产生对人有害的物质，且可能存在TSE或TSE样鲨鱼制剂[如参考文献1-3]。此外，鲨鱼可含有人类毒素如真鲨毒素（carchatoxin）。另外，鲨鱼可含有人类对之过敏的蛋白。人类过敏的常见鱼蛋白是在鲨鱼中发现的小清蛋白。因此鲨烯的廉价低级别来源不适于人类药学应用。在鲨烯是部分免疫佐剂的情况中，其对人受体伤害的风险增加，这是由于根据定义，所述佐剂可诱导针对杂质的强烈不利免疫应答。
找到制备适于药学应用的鲨烯的其他和改良过程是有用的，即所述鲨烯是满足调节标准且不含可伤害人类的污染物、病原体、病毒、人毒素或蛋白的产品。本发明过程特定用于纯化源自鲨鱼肝油的鲨烯。
发明内容
本发明提供从动物源含鲨烯组合物中制备鲨烯的方法，所述方法包括步骤：(a)在温度T1进行纯化蒸馏;(b)在温度T2进行变性蒸馏;其中步骤(a)和(b)可以任一顺序进行;T1和T2足以使鲨烯沸腾;T2>T1;且T2≥200°C。所述动物来源通常是鱼类来源，如鲨鱼肝油（或其提取物），即本发明提供从鲨鱼肝油或从鲨鱼肝油提取物中制备鲨烯的方法。
本发明还提供从含鲨烯组合物中制备鲨烯的方法，所述方法包括步骤(a)在温度T1进行纯化蒸馏;(b)在温度T2进行变性蒸馏;其中步骤(a)和(b)可以任一顺序进行;T1和T2足以使鲨烯沸腾;T1<140°C;且T2>200°C。有用的所述含鲨烯组合物可为鲨鱼肝油或其提取物。
本发明还提供重蒸馏含至少99%鲨烯的组合物的方法，所述重蒸馏是在T2的温度下进行的变性蒸馏；其中T2≥200。该重蒸馏可将组合物中的含水量降低到如<0.01%。
本发明的方法可用于生产适于药学应用的产品。具体地，本发明方法可用于生产纯化的鲨烯，其不含可伤害人类的污染物、病原体、病毒、人类毒素或蛋白，尤其是蛋白小清蛋白。
本发明还提供制造水包油乳液的方法，包括用上述方法准备的鲨烯制备乳液。
本发明还提供制备疫苗组合物的方法，包括如上所述制备乳液，并将所述乳液与抗原混合。
本发明还提供制备疫苗药盒的方法，包括如上所述制备乳液并将乳液与抗原组分一起包装到药盒中作为药盒组分。
本发明还提供根据本发明方法制备的鲨烯。
本发明还提供含本发明所述方法制备的鲨烯的水包油乳液。
本发明还提供含本发明所述方法制备的鲨烯的疫苗。
本发明还提供本发明方法所述制备的鲨烯在疫苗中的应用。
纯化蒸馏
含鲨烯组合物可源自任何来源，如黑液皂化物撇渣;妥尔油皂;粗制妥尔油;妥尔油树脂;甘蔗油;油和脂肪的提取、脱胶和精炼的残余物;脂肪酸和酯类的蒸馏残余物;植物油的脱臭馏出物;橄榄油;大豆油;米糠油;鲨鱼肝油;牛脂;.咖啡油;鱼油;鳕鱼肝油;麦胚芽油;玉米胚芽油;棕榈油;酸渣树油（andiroba oil）;和番茄残余物的油。具体地，含鲨烯的化合物可源自鲨鱼肝油。
所述纯化蒸馏从含鲨烯组合物中移除杂质，产生纯化组合物。含鲨烯组合物通常是液体。纯化蒸馏前，含鲨烯组合物可含有杂质如角鲨胺、烷基甘油、脂肪酸（如Ω-3-脂肪酸）、维生素A和D、姥鲛烷(pristine)、甘油三酸酯、甘油醚和脂肪醇。
所述纯化蒸馏在温度T1进行，其中T1足以使鲨烯沸腾，即T1可大于或等于鲨烯的沸点。760mm Hg（即1个大气压）时鲨烯的沸点为429-430°C。
液体的沸点表示该化合物液相的蒸气压等于作用于该液体表面上的外部压力的温度。因此，鲨烯的沸点，也即T1的下限取决于施加于含鲨烯组合物的表面的外部压力。该现象为本领域熟知，且技术人员能计算所用给定蒸馏压力下观察到的鲨烯沸点。或者，技术人员能基于所需观察到的鲨烯沸点来计算所需的蒸馏压力。所述计算可用列线图进行。
在一个实施方式中，所述纯化蒸馏可在至少70°C的温度进行，如至少75°C或至少80°C。在另一实施方式中，所述纯化蒸馏可在低于140°C的温度进行，如低于130°C、低于120°C、低于110°C、低于100°C、低于95°C、低于90°C或低于85°C。
在一个实施方式中，所述纯化蒸馏可在接近真空下进行。具体地，所述纯化蒸馏可在至少0.5μm Hg的压力下进行，如至少0.75μm Hg或至少1μm Hg。所述纯化蒸馏可在低于5μm Hg的压力下进行，如低于2.5μm Hg或低于2μm Hg。
本发明的其他实施方式包括上述引用的最小和最大温度以及最小和最大压力的组合。
所述纯化蒸馏可产生含至少95%鲨烯的组合物，如至少96%鲨烯、至少97%鲨烯、至少98%鲨烯、至少99%鲨烯、至少99.5%鲨烯、至少99.8%鲨烯、至少99.9%鲨烯或甚至100%鲨烯。
本文所引全部百分比是重量百分比且可用气相色谱（GC）测量。GC技术可通过将溶于己烷的鲨烯样品注射到配有火焰离子检测器(FID)的气相色谱上来进行。分析可在30m x 0.32mm x 0.50mm毛细管柱上进行，维持于200°C持续2分钟，然后以每分钟提高12°C升到310°C，在此维持9分钟。注射孔和FID分别维持于300°C和320°C。鲨烯峰值的鉴定用GC/MS（用质量选择检测器的气相色谱）建立。纯度报告为鲨烯峰面积占色谱中所有峰面积之和的百分比。
所述纯化蒸馏可在所述变性蒸馏之前进行，产生纯化的组合物。或者，所述纯化蒸馏可在所述变性蒸馏之后进行，产生变性的纯化组合物。
变性蒸馏
鲨鱼和因而源自鲨鱼肝油的鲨烯可含有人类过敏的蛋白。人类可能过敏的常见鱼蛋白是在鲨鱼中发现的小清蛋白。此外，污染蛋白或材料可在例如纯化蒸馏之后或作为鲨烯的降解产物而被引入鲨烯组合物中。可能的污染蛋白或材料包括丙酮、乙醛、甲醛和水。优选地，变性蒸馏步骤使含鲨烯组合物变性和/或从中移除蛋白，尤其是小清蛋白和任何污染蛋白，从而提供变性的组合物。本发明方法的另一优点是变性蒸馏可保证含鲨烯组合物中存在的任何潜在病毒失活和/或从纯化的组合物中移除。因此所述变性组合物用于人类应用比非变性组合物安全。
不希望被理论所限制，鲨烯的沸点取决于施加在含鲨烯组合物表面的外部压力。然而，含鲨烯组合物中存在的任何蛋白会变性的温度通常独立于施加在含鲨烯组合物表面的外部压力。因此，变性蒸馏可在特定温度下进行，而不考虑进行蒸馏的压力。具体地，所述变性蒸馏可在T2的温度下进行，其中T2可大于或等于200°C，如大于或等于205°C、大于或等于210°C、大于或等于215°C、大于或等于220°C、大于或等于230°C、大于或等于240°C、大于或等于250°C、大于或等于260°C。
所述变性蒸馏可在低于500°C的温度下进行如低于480°C、低于450°C、低于420°C、低于400°C、低于350°C或低于300°C。
变性蒸馏可在接近真空下进行。具体地，所述变性蒸馏可在至少0.5mm Hg的压力下进行，如至少0.6mm Hg、至少0.7mm Hg或至少0.8mm Hg。所述变性蒸馏可在低于5mm Hg的压力下进行，如低于4mm Hg、低于3mm Hg、低于2mm Hg、低于1.5mm Hg、低于1mm Hg或低于0.9mm Hg。
本发明的其他实施方式包括上述引用的最小和最大温度以及最小和最大压力的组合。
为了在该高温下进行变性蒸馏，优选使用将含鲨烯组合物与热表面接触的设备。热表面可维持在如上所定义的温度T2，所述热表面周围的压力可为上述定义的压力以用于变性蒸馏。所述热表面周围的压力可选择成确保观察到的鲨烯沸点是T2或更小。随着含鲨烯组合物与所述热表面接触，在所述热表面周围压力下沸点低于T2的那些组合物成分（包括鲨烯）会蒸发。未蒸发组分如蛋白保持在热表面上，且可变性并从鲨烯中分离。
变性蒸馏前，含鲨烯组合物可包括85%-99.9%的鲨烯，如95%-99.5%的鲨烯、95%-99.5%的鲨烯或97%-99.5%的鲨烯。
所述变性蒸馏可产生具有较高鲨烯百分比的鲨烯组合物。具体地，所述变性蒸馏可产生至少含95%鲨烯的变性组合物，如至少99%鲨烯、至少99.5%鲨烯、至少99.9%鲨烯或甚至100%鲨烯。
变性蒸馏可产生含少于0.5%蛋白的变性组合物，如少于0.1%蛋白、少于0.01%蛋白或0%蛋白。因此，本发明提供含少于0.5%蛋白的鲨烯，如少于0.1%蛋白、少于0.01%蛋白或0%蛋白。
在一个实施方式中，所述变性蒸馏可在所述纯化蒸馏之后进行，产生纯化的变性组合物。
T2可大于T1。具体地，T2-T1可为10°C-300°C，如30°C-250°C、50°C-200°C或80°C-150°C。
溶剂
为了避免在含鲨烯组合物中引入杂质，这在所述鲨烯组合物旨在用于疫苗时尤其重要，所述纯化和变性蒸馏可不添加溶剂而进行。
皂化
含鲨烯组合物可经过皂化。皂化通常在上述蒸馏步骤(a)和(b)之前进行。或者，皂化可在以任何顺序进行的蒸馏步骤(a)和(b)之间完成。或者，但不通常，皂化可在蒸馏步骤(a)和(b)之后进行。皂化可破坏含鲨烯组合物中存在的蛋白。
然而，皂化可能不移除所有存在的蛋白。含鲨烯组合物中残留的任何残余蛋白在皂化后可通过变性蒸馏步骤移除。皂化和变性蒸馏的组合具有优势，其增加了鲨烯不含有任何蛋白的可能性。
皂化是酯类在碱性条件下水解形成醇和羧酸盐。含鲨烯组合物的皂化期间，向所述组合物中加入碱（如NaOH或KOH）可引起脂肪酸酯（如甘油三酯）转变为皂。皂化可具有优势，因为其可增加皂化产品沸点和未皂化产品沸点之间的差异，使通过蒸馏如纯化和/或变性蒸馏的分离更有效。或者，所述皂化产品可通过任何方法如离心移除。
通过皂化移除脂肪酸酯可产生皂化的含鲨烯组合物，其相比未皂化的含鲨烯组合物可具有改良的纯度（即更高的鲨烯％）。
鲨烯鉴定
本发明方法生产的鲨烯可具有低于4mg/ml的皂化值，如低于3mg/ml、低于2mg/ml或低于1mg/ml。该检测表明鲨烯中存在的可皂化物质的量。皂化值可如美国药典(USP)<401>所述测定为氢氧化钠的水解和中和等价物。用NaOH获得的皂化值可通过将其乘以KOH和NaOH的分子量之比（1.403）转换为KOH值。
本发明方法生产的鲨烯可具有小于或等于1mg KOH/g的酸值，如小于或等于0.8mg KOH/g、小于或等于0.6mg KOH/g、小于或等于0.5mg KOH/g、小于或等于0.4mg KOH/g、小于或等于0.2mg KOH/g、小于或等于0.1mg KOH/g、小于或等于0.05mg KOH/g、小于或等于0.03mg KOH/g、小于或等于0.02mgKOH/g或小于或等于0.01mg KOH/g。如USP<401>所述，酸值可测定为鲨烯消耗的氢氧化钾的中和等价物。
水包油乳液
一旦如上所述制备了含鲨烯组合物，其可用于制备下游产物如药物、水包油乳液佐剂等。
为了避免污染，优选鲨烯在蒸馏处理后和制备下游产物前保持无菌。例如，若下游产物是乳液，则所述蒸馏和乳液设备可形成封闭***以避免制备所述乳液形成前鲨烯的污染。或者或此外，所述鲨烯在制备下游产物前可保持在惰性气体如氮气中。
发现水包油乳液特别适用于含佐剂的疫苗。本发明制备的乳液除了水性组分之外，还包括鲨烯和至少一种表面活性剂。所述乳液可含额外的油。理想地，油与表面活性剂是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。
可使用鲨烯和生育酚的油组合物。当组合物包含生育酚时，可采用α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚中的任何一种，但优选α-生育酚。可同时采用D-α-生育酚和DL-α-生育酚。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚。生育酚可取多种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等。如果采用生育酚的盐，那么优选的盐是琥珀酸盐。可使用包括角鲨烯和生育酚（如DL-α-生育酚）的油组合。
油含量通常为2-20%(体积)。
所述水性组分可为淡水（如w.f.i.）或可包括其他组分如溶质。例如，可包含盐以形成缓冲液，例如柠檬酸或磷酸盐，例如钠盐。常用缓冲液包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。包含的缓冲液一般是5-20mM。表面活性剂优选是可生物降解(可代谢)和生物相容性的。可通过'HLB'(亲水/亲脂平衡)对表面活性剂分类，其中1-10范围内的HLB表示该表面活性剂比起水更易溶于油，而10-20范围内的HLB表示比起油更易溶于水。乳液优选包含至少一种HLB为至少10，例如至少15或优选至少16的表面活性剂。
可以与本发明一起使用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨酯20和聚山梨酯80；以商品名DOWFAXTM出售的环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，如直链EP/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1,2-乙二基)数量不同的辛苯聚醇，特别感兴趣的是辛苯聚醇9(曲通(Triton)X-100，或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；
(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；衍生自十二烷醇、十六烷醇、十八烷醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为苄泽表面活性剂)，如三乙二醇单月桂基醚(苄泽30)；聚氧乙烯-9-月桂醚以及去水山梨糖醇酯(通常称为司盘)，如去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和去水山梨糖醇单月桂酸酯。乳液中包含的优选表面活性剂是聚山梨酯80(吐温80；聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(去水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X100。
所述乳液中可包括这些表面活性剂的混合物，如吐温80/司盘85混合物或吐温80/曲通-X 100混合物。聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯（吐温80）和辛苯聚醇如叔辛基苯氧基-聚乙氧基乙醇（曲通X-100）的组合也适用。另一种有用的组合包含月桂醇聚醚-9加聚氧乙烯去水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。有用的混合物可包括HLB值为10-20的表面活性剂（如吐温80，HLB为15.0）和HLB值为1-10的表面活性剂（如司盘85，HLB为1.8）。
优选的表面活性剂的含量（重量%）为：聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(如吐温80)0.01-2%；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通X-100或曲通系列的其它去污剂)0.001-0.1%；聚氧乙烯醚(如月桂醇聚醚9)0.1-20%。
优选含鲨烯的水包油乳液，所述乳液含有聚山梨酯80表面活性剂。
所述水包油乳液可用包括下述步骤的方法制造：(i)制备具有第一平均油滴尺寸的第一乳液，也称作初步乳液或预乳液；(ii)微流化第一乳液形成具有比第一平均油滴尺寸小的第二平均油滴尺寸的第二乳液；和(iii)过滤第二乳液。所述第一乳液可通过均质制备。
乳液中的油滴直径通常小于5μm，甚至可具有亚微米直径，随后通过微流化床方便地实现这种小尺寸以提供稳定乳液。优选尺寸小于220nm的液滴，因为其可进行过滤灭菌。
用本发明所制备鲨烯生产的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：
·鲨烯、聚山梨酯80(吐温80)和去水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)的乳液。所述乳液的体积组成可以是约5%鲨烯、约0.5%聚山梨酯80和约0.5%司盘85。以重量计，这些比例为4.3%鲨烯、0.5%聚山梨酯80和0.48%司盘85。这种佐剂称为‘MF59’[4-6]，参考文献7的第10章和参考文献8的第12章更详细地描述了该佐剂。MF59乳液宜包含柠檬酸根离子，如10mM柠檬酸钠缓冲液。
·鲨烯、生育酚(理想的是DL-α-生育酚)和聚山梨酯80的乳液。这些乳液可含有(以重量计)2-10%鲨烯，2-10%α生育酚和0.3-3%聚山梨酯80，例如4.3%鲨烯、4.7%生育酚、1.9%聚山梨酯80。鲨烯：生育酚的重量比优选≤1(例如0.90)，因为这提供了更稳定的乳液。鲨烯和聚山梨酯80的体积比可以约为5:2，或者重量比约为11:5。可通过以下方法制备一种这类乳液：将聚山梨酯80溶解于PBS产生2%溶液，然后将90ml该溶液与5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯的混合物相混合，然后使该混合物微流体化。得到的乳液含有(如)平均直径为100-250nm，优选约180nm的亚微米油滴。该乳液也可含有3-脱-O-酰化单磷酰脂质A(3d-MPL)。此种类型的另一种有用乳液可包含(每个人用剂量)0.5-10mg鲨烯、0.5-11mg生育酚和0.1-4mg聚山梨酯80[9]。
·鲨烯、生育酚和曲通去污剂(如曲通X-100)的乳液。该乳液也可包含3d-MPL。所述乳液可包含磷酸盐缓冲液。
·含有鲨烯、聚山梨酯(如聚山梨酯80)、曲通去污剂(如曲通X-100)和生育酚(如琥珀酸α-生育酚)的乳液。该乳液可包含这三种组分，其质量比约为75:11:10(如750μg/ml聚山梨酯80、110μg/ml曲通X100和100μg/ml琥珀酸α-生育酚)，且这些浓度应包括抗原中这些组分的贡献。该乳液也可包含3d-MPL。该乳液也可包含皂苷，如QS21。所述水相可包含磷酸盐缓冲液。
·含有鲨烯、水溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(如聚氧乙烯(12)十六十八醚)和疏水性非离子型表面活性剂(如去水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如去水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。该乳液优选为热可逆的和/或其中至少90%油滴(以体积计)的尺寸小于200nm[10]。该乳液也可含有以下一种或多种以下物质：糖醇；低温保护剂(例如，糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。该乳液可包含TLR4激动剂[11]。这类乳液可冻干。
·鲨烯、泊洛沙姆-105和Abil-Care的乳液[12]。含佐剂疫苗中这些组分的终浓度(重量)是5%鲨烯、4%泊洛沙姆-105(普流罗尼克多元醇)和2%Abil-Care 85(双-PEG/PPG-16/16PEG/PPG16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。
如上以百分数表示的这些乳液的组合物可通过稀释或浓缩来改变(例如可以改变整数倍，如2或3倍，或改变部分，例如2/3或3/4)，其中其比例保持不变。例如，2倍浓缩的MF59可包含约10%鲨烯，约1%聚山梨酯80和约1%去水山梨糖醇三油酸酯。可稀释浓缩形式(例如用抗原溶液)，得到所需的乳液终浓度。
本发明的乳液理想地储存在2°C-8°C。其不应冷冻。理想上避直射光保存。具体地，本发明含鲨烯的乳液和疫苗应当受到保护以避免鲨烯的光化学分解。如果储存本发明的乳液，那么优选在惰性气体例如氮气或氩气中。
疫苗
虽然可能将水包油乳液佐剂本身给予患者(如为单独给予患者的抗原提供佐剂效应)，但更常见的是将佐剂与抗原混合后给予，从而形成免疫原性组合物例如疫苗。可以在临用前或者在疫苗生产过程中混合乳液和抗原，然后装填。本发明的方法可用于这两种情况。
因此，本发明方法还可包括将含本发明所制备鲨烯的乳液与抗原组分混合的工艺步骤。或者，还可包括将佐剂与抗原组分一起包装到药盒中作为药盒组分的步骤。
因此，综上所述，制备混合的疫苗时或制备包含易混合抗原和佐剂的药盒时，可使用本发明。如果在生产过程中混合，那么所混合的散装抗原和乳液的体积一般大于1升，例如≥5升、≥10升、≥20升、≥50升等。如果在使用时混合，那么所混合的体积一般小于1毫升，例如≤0.6ml、≤0.5ml、≤0.4ml、≤0.3ml、≤0.2ml等。在这两种情况下，通常混合的乳液和抗原溶液的体积基本相等，即基本上为1:1(例如1.1:1-1:1.1，优选1.05:1-1:1.05，更优选1.025:1-1:1.025)。然而，在一些实施方式中，可采用过量的乳液或过量的抗原[13]。当一种组分的体积过量时，过量通常为至少1.5:1，例如≥2:1、≥2.5:1、≥3:1、≥4:1、≥5:1等。
抗原和佐剂作为药盒中的单独组分时，它们在药盒中物理上相互分离，这种分离可通过多种方式实现。例如，组分可以装在不同的容器，如药瓶中。需要时，可通过(例如)取出一个药瓶的内容物并将其加入另一个药瓶，或者分别取出两个药瓶的内容物并在第三个容器中将它们混合在一起，来混合两个药瓶的内容物。
在另一种配置中，一种药盒组分在注射器中，另一种组分在容器如药瓶中。可使用该注射器(例如装有针头的注射器)将其内含物注入药瓶中混合，然后将该混合物抽回注射器中。然后，一般通过新的无菌针头将该注射器中的混合内容物给予患者。将一种组分包装到注射器中无需用单独注射器对患者给药。
在另一优选配置中，这两种药盒组分在同一注射器中但分开保存，例如双室注射器，如参考文献14-21等所述。操作注射器时(例如给予患者时)，将这两室中的内容物混合。这种配置在使用时无需单独的混合步骤。
不同药盒组件的内容物通常均为液体形式。在一些配置中，组分(一般是抗原组分而非乳液组分)是干燥形式(例如冻干形式)，而另一组分是液体形式。可将这两种组分混合，以再次激活干燥组分，得到给予患者的液体组合物。冻干组分一般置于药瓶中，而非注射器中。干燥组分可包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置使用预填装注射器中的液态乳液组分和药瓶中的冻干抗原组分。
如果疫苗还含有乳液和抗原以外的组分，那么这些其它组分可包含在这两种药盒组分之一中，或者可以是第三种药盒组分的一部分。
适用于本发明混合疫苗或单独药盒组分的容器包括药瓶和一次性注射器。这些容器应无菌。
组合物/组分装在药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料材料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行灭菌。为了避免胶乳过敏患者可能产生的问题，药瓶优选用无胶乳塞子密封，且优选所有包装材料均不含胶乳。在一个实施方式中，药瓶具有丁基橡皮塞。药瓶可包含单一剂量的疫苗/组分，或者可以包含一个以上剂量('多剂量'药瓶)，如10个剂量。在一个实施方式中，药瓶包含10x 0.25ml剂量的乳液。优选的药瓶由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如鲁尔（Luer）锁)，以便将预填装注射器***该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物移回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子移除后才能接触到该帽。
将组合物/组分包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可提供注射器单独的针头以组装和使用。优选安全性针头。一般是1-英寸23号、1-英寸25号和5/8-英寸25号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上内含物的批号、流感季节和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有防脱装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，所述顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则针头优选装有丁基橡胶护罩。
可用缓冲液稀释乳液，然后包装入药瓶或注射器。常用缓冲液包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂。稀释可降低佐剂组分的浓度，而维持其相对比例，例如提供“半强度”佐剂。
容器可标注显示半剂量体积，以例如利于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可有显示0.25ml体积的标记。
采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
各种抗原均可用于水包油乳液，包括但不限于：病毒抗原，如病毒表面蛋白；细菌抗原，如蛋白质和/或糖抗原；真菌抗原；寄生虫抗原；和肿瘤抗原。本发明特别用于针对以下的疫苗：流感病毒、HIV、钩虫、乙肝病毒、单纯疱疹病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、衣原体、SARS冠状病毒、水痘-带状疱疹病毒、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria Meningitidis)、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、EB病毒、人***瘤病毒等。例如：
·流感病毒抗原。所述抗原可以采取活病毒或者灭活病毒的形式。采用灭活病毒时，该疫苗可包含全病毒、裂解病毒颗粒或纯化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神经氨酸酶)。流感抗原也可以病毒体形式出现。所述抗原可具有选自下组的任何血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15和/或H16。疫苗可包括来自一种或多种(例如1、2、3、4或更多种)流感病毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原，例如单价A/H5N1或A/H1N1疫苗或三价A/H1N1+A/H3N2+B疫苗。流感病毒可以是重配毒株，并可通过逆向遗传学技术获得[如22-26]。因此，该病毒可包含来自A/PR/8/34病毒(一般是来自A/PR/8/34的6个节段，HA和N节段来自疫苗毒株，即6:2重配毒株)的一个或多个RNA节段。可以在鸡蛋(如含胚鸡蛋)或细胞培养物上培养用作抗原来源的病毒。使用细胞培养物时，细胞底物一般是哺乳动物细胞系，如MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：MDCK细胞[27-30]，衍生自马达二氏(Madin Darby)犬肾；Vero细胞[31-33]，衍生自非洲绿猴肾；或PER.C6细胞[34]，衍生自人胚视网膜母细胞。在哺乳动物细胞系上培养病毒时，该组合物宜不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低变应原性。通常参照血凝素(HA)含量(通常用SRID测定)标准化疫苗的单位剂量。现有的疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但也可使用更低的剂量，特别是使用佐剂时。采用了分数剂量如1/2(即7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8[35,36]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[37,38])。因此，疫苗可包含每流感毒株0.1-150μgHA，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0-5μg等。具体剂量包括例如，每毒株约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约3.75、约1.9、约1.5μg等。
人免疫缺陷病毒，包括HIV-1和HIV-2。该抗原一般是包膜抗原。
乙肝病毒表面抗原。该抗原优选通过重组DNA方法获得，例如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达后获得。与天然病毒HBsAg不同，重组酵母表达的抗原是非糖基化抗原。它可以是基本呈球形的颗粒形式(平均直径约为20nm)，包括含有磷脂的脂质基质。不像天然HBsAg颗粒，酵母表达的颗粒可能包含磷脂酰肌醇。HBsAg可来自以下任何亚型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-和adrq+。
钩虫，特别是犬中发现的钩虫(犬钩虫(Ancylostoma caninum))。这种抗原可以是重组Ac-MTP-1(虾红素样金属蛋白酶)和/或天冬氨酸血红蛋白酶(Ac-APR-1)，它可以在杆状病毒/昆虫细胞***中表达为分泌蛋白[39,40]。
单纯疱疹病毒抗原(HSV)。用于本发明的优选HSV抗原是膜糖蛋白gD。优选使用HSV-2毒株的gD('gD2'抗原)。该组合物可使用C-末端膜锚定区缺失的gD形式[41]，如包含天然蛋白的氨基酸1-306且C-末端加入天冬酰胺和谷胺酰胺的截短型gD。这种蛋白质形式包括信号肽，所述信号肽被切割后产生成熟的283个氨基酸的蛋白质。缺失锚定物可将该蛋白制备成可溶形式。
人***瘤病毒抗原(HPV)。用于本发明的优选HPV抗原是L1衣壳蛋白，该蛋白可组装形成称为病毒样颗粒(VLP)的结构。可通过在酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或昆虫细胞(例如夜蛾(Spodoptera)细胞，如草地贪夜蛾(S.frugiperda)，或果蝇(Drosophila)细胞)中重组表达L1来产生VLP。在酵母细胞中，质粒载体可携带L1基因；在昆虫细胞中，杆状病毒载体可携带L1基因。更优选地，该组合物包含来自HPV-16和HPV-18毒株的L1VLP。已证明这种二价组合非常有效[42]。除了HPV-16和HPV-18毒株外，也可能包含来自HPV-6和HPV-11毒株的L1VLP。也可能采用致癌性HPV毒株。疫苗可包含20-60μg/ml(如约40μg/ml)的L1/HPV毒株。
炭疽抗原。炭疽是由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)引起的。合适的炭疽杆菌抗原包含A组分(致死因子(LF)和水肿因子(EF))，二者共有称为保护性抗原(PA)的共同B组分)。任选地，可使抗原脱毒。其它详情可参见参考文献[43-45]。
·金黄色葡萄球菌(S.aureus)抗原。已知各种金黄色葡萄球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如来自5型和/或8型菌株)和蛋白(例如IsdB,Hla,等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。
肺炎链球菌抗原。已知各种肺炎链球菌抗原。合适的抗原包括荚膜糖(例如来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和/或23F)和蛋白质(例如肺炎球菌溶血素、脱毒的肺炎球菌溶血素、聚组氨酸三聚体蛋白D(PhtD)等)。荚膜糖抗原理想地与载体蛋白偶联。
癌抗原。已知各种肿瘤特异性抗原。本发明可使用引发针对肺癌、黑素瘤、乳腺癌、***癌等的免疫治疗性应答的抗原。
抗原溶液通常与含鲨烯乳液，例如以1:1的体积比混合。该混合可以由疫苗生产商在装填前进行，或可在使用时由健康护理工作者进行。
药物组合物
用本发明方法制备的组合物是药学上可接受的。它们可包含除了含鲨烯乳液和可任选抗原以外的组分。
组合物可含有防腐剂，如硫柳汞或2-苯氧乙醇。然而，疫苗优选应基本不含(即小于5μg/ml)含汞物质，如不含硫柳汞[46.47]。更优选无汞的疫苗和组分。
组合物的pH通常为5.0-8.1，更常为6.0-8.0，例如6.5-7.5。因此，本发明方法可包括在包装前调整疫苗pH的步骤。
该组合物优选无菌。该组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。该组合物优选不含谷蛋白。
该组合物可含有一次免疫的物质，或者可含有多次免疫的物质(即‘多剂量’药盒)。多剂量配置优选含有防腐剂。
疫苗的给药剂量体积一般为约0.5ml，但可将一半剂量(即约0.25ml)给予儿童。
治疗方法和所述疫苗给予
本发明提供用本发明方法制备的药盒和组合物。根据本发明方法制备的组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将这种组合物给予患者的步骤。
本发明也提供用作药品的这些药盒和组合物。
本发明也提供以下应用：(i)抗原的水性制剂；和(ii)按照本发明制备的含鲨烯的水包油乳液在生产引起患者中免疫应答的药物中的应用。
这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。
可以各种方式给予该组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(如注射到上肢或下肢)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[48-50]、口服[51]、皮内[52.53]、经皮、透皮[54]等。可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。患者可以是老年人(如≥50岁，优选≥65岁)、青年(如≤5岁)、住院患者、健康护理人员、军队服役人员和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷患者和去国外旅行的人。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。
可在与其它疫苗基本相同的时间(例如在向健康护理专业人员的同一次医疗咨询或就诊期间)，将本发明疫苗给予患者。
概述
术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是任选的并表示例如x±10%。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。
除非另有明确说明，包括混合两种或多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将该组合再与第三种组分混合等。
本方法的各步骤可在相同或不同时间、相同或不同地理位置如国家以及由相同或不同人或实体进行。
具体实施方式
实施例1
图1显示蒸馏设备的示意图，其用于本发明方法的纯化和/或变性蒸馏步骤。参考图1所述的过程可不向含鲨烯组合物添加任何溶剂而进行。在图1所示的实施方式中，含鲨烯组合物置于氮气覆盖的进料容器（1）中。进口管线(3)的一个末端具有聚丙二醇预滤器且置于进料容器中，而所述进口管线的另一末端具有不锈钢针头(19-ga.)，其***蒸馏设备(5)的顶部。所述蒸馏设备包括形状类似试管的室(7)，有圆柱形“热指（hot finger）”(9)从中央突出。沸点212°C的苯甲酸乙酯在所述指下加热，为所述热指壁提供热量。尽管本实施方式使用苯甲酸乙酯，但明显具有更高沸点的溶剂可用于增加所述热指的温度。蒸馏期间，所述蒸馏设备可抽空。含鲨烯组合物可加入所述蒸馏设备，如通过在所述蒸馏设备中使用低压，通过不锈钢针头并滴在（11）所述热指的热壁上。随着含鲨烯组合物被加热，所述蒸馏设备压力下沸点低于212°C的那些组分会挥发。为了用图1的***挥发鲨烯，所述蒸馏设备内的压力应选择成使鲨烯的沸点低于212°C或更低（如约1.5mm Hg或更低）。挥发的组分会在所述室(7)的外壁冷凝，其可通过周围空气冷却，并会沿着壁流到也可为真空的收集烧瓶(13)中。非挥发性组分如蛋白留在所述热指的壁上，并流入残余物烧瓶(15)。极端挥发性组分可通过真空管线取出，降低其在鲨烯冷凝物中的水平。
已进行纯化蒸馏的鲨烯用此设备蒸馏。不论什么来源，最终鲨烯一般具有≥99.9%的纯度、<0.03mg KOH/g的酸值和<2mg/g的皂化值。变性蒸馏降低鲨烯的含水量，如0.022%-0.010%、0.006-0.005%或0.010%-0.006%。
实施例2-测量皂化值。
皂化值是中和游离酸并皂化1.0g物质中所含酯类所需的氢氧化钾的mg数。
过程(USP<401>):在配衡的250mL烧瓶中放置1.5g-2g物质，精确称重，加入25.0mL 0.5N氢氧化钾-乙醇。在合适的冷凝器下用蒸汽浴加热所述烧瓶，保持回流30分钟，频繁旋转内含物。然后加入1mL酚酞TS，用0.5N盐酸VS滴定过量的氢氧化钾。相同条件下进行空白测定。实际试验和空白试验中消耗0.5N盐酸的体积差异（以mL计）乘以56.1和0.5N盐酸VS的精确当量浓度，并除以所取样品的重量（以g计）即为皂化值。
根据鲨烯来源，可获得<1.4mg/g的皂化值。
实施例3–测量酸值。
脂肪和非挥发油的酸度可表示为中和10.0g物质中游离酸所需的0.1N碱的mL数。酸值是中和1.0g物质中游离酸所需的碱的mg数。
过程(USP<401>):在烧瓶中含有的50mL等体积醇和醚（已用0.1N氢氧化钠中和为酚酞）中溶解精确称重的约10.0g物质。若所述测试样品不溶于***剂，则将所述烧瓶与合适的冷凝器连接并缓慢加热，频繁振荡直到样品溶解。加入1mL酚酞TS，并用0.1N氢氧化钠VS滴定直到溶液振荡30秒后仍为微粉色。计算各酸值。若滴定所需的0.1N碱VS的体积少于2mL，则可使用更稀释的滴定液，或所述样品大小可因此调节。结果可表示为滴定液的体积或0.1N氢氧化钠的相当体积形式。
根据鲨烯来源，可获得0.03mg KOH/g的酸值。
实施例4—掺入研究
进行许多掺入研究以证明所述变性蒸馏的效力。
为了测定变性蒸馏移除的杂质的水平，鲨烯组合物中掺入特定量的污染物（如水）以及可能的鲨烯分解产物（如甲醛、乙醛和丙酮）。掺入后的溶液经过本发明所述的变性蒸馏并分析掺入的物质。
4kg鲨烯组合物中掺入如0.3mL(0.2g)乙醛(>99.5%纯度)、0.3mL(0.2g)丙酮(>99.9%纯度)、0.55mL 37重量%的甲醛水溶液(0.2g)和3.65g水，然后如实施例1所述进行变性蒸馏。收集三部分蒸馏物并与掺入后的起始材料一起分析掺入的物质。结果示于下表1：
表1
表1的结果显示丙酮、乙醛和甲醛浓度在变性蒸馏后全都下降。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。
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Claims (22)

1.一种制备乳液的方法，所述方法包括：
(i)通过包括以下步骤的方法从动物源的含鲨烯组合物中制备鲨烯：(a)在温度T1进行纯化蒸馏；和(b)在温度T2进行变性蒸馏；其中步骤(a)和(b)可以任一顺序进行；T1和T2足以使鲨烯沸腾；T2>T1；且T2≥200℃；
(ii)用步骤(i)中制备的鲨烯制备乳液。
2.一种制备乳液的方法，所述方法包括：
(i)通过包括以下步骤的方法从含鲨烯组合物中制备鲨烯：(a)在温度T1进行纯化蒸馏；和(b)在温度T2进行变性蒸馏；其中步骤(a)和(b)可以任一顺序进行；T1和T2足以使鲨烯沸腾；T1<140℃且T2≥200℃；
(ii)用步骤(i)中制备的鲨烯制备乳液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，T1<140℃。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(i)中制备的鲨烯在蒸馏处理后和步骤(ii)中制备乳液前保持无菌。
5.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(i)中使用的组合物包括一种或多种蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述组合物包含小清蛋白。
7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述变性蒸馏在0.5mm Hg(66.7Pa)-5.0mm Hg(666.6Pa)的压力下进行。
8.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述纯化蒸馏在70-100℃的温度下进行。
9.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述纯化蒸馏在0.5μm Hg(66.7mPa)-5μm Hg(666.6mPa)的压力下进行。
10.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述纯化蒸馏在所述变性蒸馏前进行。
11.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(i)中所用的组合物经历皂化。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述皂化包括在含鲨烯组合物中添加NaOH或KOH。
13.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述乳液是水包油乳液。
14.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述乳液与抗原混合。
15.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述乳液与抗原组分一起包装到药盒中作为药盒组分。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述药盒组分在独立的药瓶中。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述药瓶用硼硅酸盐玻璃制成。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗原是流感病毒抗原。
19.如权利要求18中所述的方法，其特征在于，所述乳液和所述抗原的组合形成疫苗组合物，且其中所述疫苗组合物中每流感病毒株系包含15μg、10μg、7.5μg、5μg、3.8μg、3.75μg、1.9μg或1.5μg红血球凝聚素。
20.如权利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述乳液和所述抗原组合形成疫苗组合物，且其中所述疫苗组合物包含硫柳汞或2-苯氧基乙醇防腐剂。
21.用权利要求1-13中任一项所述的方法获得的水包油乳液。
22.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，含鲨烯的所述组合物包含99％或更多的鲨烯。
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