CN102876766B - 一种头孢菌素c的发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种头孢菌素C的发酵方法。通过在头孢菌素C发酵后期通过补加消沫剂替代豆油进行消沫，在不影响效价增长和滤速的情况下，原材料成本可以降低15%。

Description

一种头孢菌素C的发酵方法

技术领域

本发明属于生物工程和微生物学领域；更具体地，本发明涉及一种头孢菌素C的发酵方法。

背景技术

头孢菌素C由顶头孢霉(Cephalosporium acremonuim)产生，是顶头孢霉菌的初级代谢在特定条件下的继续与发展的产物，是继青霉素之后又一重要的β-内酰胺类抗生素。

目前在头孢菌素C工业发酵过程中使用豆油作为主要碳源，同时也起到消沫的作用。到发酵后期，液面容易产生泡沫，由于豆油消沫效果较差，需要补加较多的豆油才能有效的控制液面，同时由于菌体开始衰老自溶，对豆油的利用能力下降，残留在发酵液中过多的豆油会对头孢菌素C的提取造成影响。

因此，本领域需要研究改进的头孢菌素C发酵方法，来克服上述技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种头孢菌素C的发酵方法。

在本发明的第一方面，提供一种头孢菌素C的发酵方法，所述方法包括：在头孢菌素C发酵过程中，在需要去除泡沫时(较佳地，在产生使液面增高的泡沫时)，以聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂进行消沫处理。

在一个优选例中，所述的聚醚类消沫剂是：聚氧乙烯氧丙烯甘油。

在另一优选例中，所述的聚氧乙烯氧丙烯甘油H₂C-O-(C₃H₆O)m-(C₂H₄O)n-H；分子量8000-10000。

在另一优选例中，所述的高碳醇类消沫剂是：聚乙二醇。

在另一优选例中，所述的聚乙二醇是聚合度1000-4000的聚乙二醇；更佳地，所述的聚乙二醇是PEG2000。

在另一优选例中，在发酵起始70-120小时后，进行消沫处理；更佳地，在发酵起始90-110小时后，进行消沫处理。

在另一优选例中，聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的添加量为：0.01-0.1g/L泡沫发酵液总量；较佳地为0.02-0.08g/L泡沫发酵液总量；更佳地为0.03-0.06g/L泡沫发酵液总量。

在另一优选例中，采用的发酵培养基为：

花生粉：25g/L、玉米粉：17.5g/L、谷朊粉：30g/L、金枪鱼膏：20mL/L、玉米浆：40mL/L、葡萄糖：5g/L、蔗糖：10g/L、蛋氨酸：9g/L、硫酸铵：10g/L、硫酸钙：12g/L、碳酸钙：5g/L、豆油：70mL/L、消沫剂：1mL/L；

上述成分在培养基中的含量可±10%(较佳地，±5%)。

在另一优选例中，发酵前期(较佳地前50小时)补加铵离子，控制发酵液中的铵离子浓度在1.2-1.5g/L。

在另一优选例中，发酵起始第40-60小时起，以20-40g/hr的速度补加豆油，至发酵起始第90-110小时停止补加豆油。

在另一优选例中，发酵起始第35-45小时之前，培养温度控制为28±1℃，发酵起始第35-45小时后控制为25±1℃。

在本发明的另一方面，提供聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的用途，用于发酵生产头孢菌素C。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、不同种类消沫剂对头孢菌素C发酵的影响。

图2、补加消沫剂对头孢菌素C生物合成的影响。

图3、补加消沫剂对头孢菌素C发酵液滤速的影响。

具体实施方式

为了解决现有技术的缺陷，本发明人经过大量研究实验，发现在头孢菌素C发酵的后期，用消沫剂替代一部分豆油，将能够有效的控制液面的泡沫，且对头孢菌素C的生物合成和滤速没有影响。补加消沫剂后原材料成本比单单补加豆油降低约15%。

消沫剂通常也称为消泡剂，现有技术中存在的消沫剂有较多的种类，常用的消沫剂有天然油脂(如植物油脂、动物油脂)和一些化学合成的高分子化合物等。化学消沫剂种类挺多，主要为：聚醚类消泡剂(含GP型消泡剂、GPE型消泡剂、GPES型消泡剂等)，高碳醇类消泡剂(含磷酸三丁酯，C12～C22的高碳醇等)，硅类消泡剂(含聚二甲基硅氧烷等)，聚醚改性硅，自乳化消泡剂，聚硅氧烷消泡剂等。

目前工业发酵中常用的消沫手段包括机械消沫和化学消沫。尽管目前工业发酵中也会采用一些消沫剂来消除发酵过程中产生的泡沫，但是应用何种消沫剂，需要视生产的菌种生理特性、地域情况、反应条件等因素而定。

本发明涉及头孢菌素C的发酵，在以往的发酵方法中，通常以同时作为主要碳源的豆油来兼作消沫剂，因此一般不再添加化学添加剂。然而，本发明人经过深入研究后发现，以聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂进行消沫处理。其能够更好地控制发酵液面，且能够大大降低发酵成本。

因此，本发明提供了一种头孢菌素C的发酵方法，所述方法包括：在头孢菌素C发酵过程中，在需要去除泡沫时，特别是在产生使液面增高的泡沫时，以聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂进行消沫处理。

作为本发明特别优选的方式，所用的消沫剂是聚氧乙烯氧丙烯甘油或聚乙二醇。作为本发明特别优选的方式，所用的消沫剂是聚氧乙烯氧丙烯甘油，该消沫剂对头孢菌素C发酵的影响较小，甚至有增效作用。

本发明人还优化了发酵过程，包括消沫剂的添加时机。较佳地，在发酵起始70-120小时后，进行消沫处理；更佳地，在发酵起始90-110小时后，进行消沫处理。消沫剂的添加量为：0.01-0.1g/L泡沫发酵液总量；较佳地为0.02-0.08g/L泡沫发酵液总量；更佳地为0.03-0.06g/L泡沫发酵液总量。在这一时机停止豆油的添加而改以消沫剂处理，有利于有效降低泡沫产生量，以及有利于下游的头孢菌素C的分离提纯。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

I.材料与方法

1、菌种

顶头孢霉(Cephalosporium acremonium)CA01由山西威奇达药业有限公司提供。

2、培养基

斜面培养基(重量体积比))：

麦芽汁1.2，蛋白胨1.2，琼脂2.2；将以上成分溶解在去离子水中，定容到100毫升；消前(即消毒之前)pH为7.0。

种子培养基：

豆饼粉：30g/L、金枪鱼膏：20mL/L、玉米浆：15g/L、蔗糖：25g/L、葡萄糖：10g/L、碳酸钙：5g/L、豆油：10mL/L；上述成分溶解在去离子水中。

发酵培养基：

花生粉：25g/L、玉米粉：17.5g/L、谷朊粉：30g/L、金枪鱼膏：20mL/L、玉米浆：40mL/L、葡萄糖：5g/L、蔗糖：10g/L、蛋氨酸：9g/L、硫酸铵：10g/L、硫酸钙：12g/L、碳酸钙：5g/L、豆油：70mL/L、消沫剂：1mL/L。上述成分溶解在去离子水中。

3、消沫剂

用于试验的消沫剂如表1。

表1

4、培养方法

斜面培养

将保存于冷冻甘油管中的孢子接到大试管斜面，28℃，相对湿度40～65%培养12天，4℃冰箱保藏。

摇瓶种子培养

由冷冻管孢子接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，28℃，220r/min回转式摇床(偏心距5cm)培养72h。

摇瓶发酵培养

将种子液8mL接入装有46mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，25℃培养，260r/min摇床(偏心距5cm)培养3天，发酵72小时每瓶补加1mL豆油，培养5-6天放瓶。

50L发酵罐培养

将25L发酵培养基加入到发酵罐(针对加消沫剂组和未加消沫剂组，初始发酵培养基中豆油量相同)，从接种口在火焰保护下按15%(v/v)的接种量将种子液接入发酵罐内，培养110-150hr左右，培养温度40h之前28℃，40h后控制为25℃。发酵过程根据需要补加硫酸铵和豆油。

硫酸铵：发酵前期，当铵离子浓度降低到1.5g/L以下时开始补加硫酸铵溶液(20%W/V)，控制发酵液中的铵离子浓度在1.2-1.5g/L。硫酸铵50小时后停止补加。

豆油：50小时开始以30g/hr的速度补加。添加消沫剂组和不加消沫剂组在发酵100小时前补加豆油都是相同的；添加消沫剂组100小时停止补加豆油，开始补加消沫剂；而不加消沫剂组继续补加豆油直到放罐，补加量30g/hr。

5、实验设备

FUS-50L(A)自控发酵罐：发酵***除配备pH、溶氧(DO)、温度、转速等常规的测量控制***外，还配备有整体称重传感器和高精度补料(基质、酸碱、消泡剂等)的测量与控制，并与尾气分析仪连接，整机具有14个在线参数检测或控制功能，并具有能输入实验室手工测定参数的计算机控制与数据处理软件包BIOSTAR，由此可进一步精确得到发酵过程优化与放大所必需的包括各种代谢流特征或工程特征的间接参数，如摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)、呼吸熵(RQ)、体积氧传递系数(KLa)等。

6、分析方法

菌浓测定：取10mL发酵液于离心管中，4000r/min离心20min，计算固形物体体积占发酵液的比例。

头孢菌素C效价测定：HPLC法，色谱柱：Thermo Hypersil ODS C184.6×150mm，5μm；流动相：0.8g磷酸二氢钠于1030mL甲醇、乙腈和水(140：40：850)的混合液中，混合溶解，用四丁基氢氧化铵调pH至7.3用0.45μm过滤器过滤，流速：1.0mL/min，紫外检测波长：254nm，室温，进样量20μL。

II.结果与讨论

实施例1、不同种类消沫剂对头孢菌素C发酵的影响

在摇瓶培养水平上，选择五种消沫剂(A、D属于聚醚类消沫剂，B、E属于硅酮类消沫剂，C属于高碳醇类消沫剂)按照0.25%(v/v)的比例添加到发酵培养基中(初始添加豆油，添加量同对照组)，对照组不加消沫剂，按照前述“摇瓶发酵培养”的方法培养6天，考察不同种类的消沫剂对头孢菌素C发酵的影响，结果见图1。

五种消沫剂中，A、C、D的效价(u/mL)高于对照，B、E的效价低于对照。其中D的效价最高，E的效价最低。可以看出聚氧乙烯氧丙烯甘油对头孢菌素C发酵的影响较小(甚至有增效作用)，而硅酮类消沫剂对头孢菌素C发酵的影响较大。

本实施例中，消沫剂的添加比例较高(0.25%(v/v))，实验结果表明菌种对消沫剂有一定的耐受性，且取决于不同的消沫剂种类。聚醚类消沫剂、高碳醇类消沫剂效果较好，其中聚醚类消沫剂最佳。

因此，利用消沫剂替代豆油是一种可行的方法，甚至可以高于以豆油作为主要碳源的对照。

实施例2、发酵过程中补加消沫剂对头孢菌素C发酵的影响

在50L发酵罐中，按照前述“50L发酵罐培养”进行发酵。选择D消沫剂进行消沫剂的补加实验，100小时开始通过蠕动泵间歇补加消沫剂，当发酵液泡沫上升到泡沫与发酵液总量在35L的位置(通过发酵罐视镜观察)开始补加消沫剂，每次补加1.5g消沫剂(即0.043g/L泡沫发酵液总量)。硫酸铵到50小时后停止补加。豆油50小时开始以30g/hr的速度补加，100小时停止补加豆油，开始补加消沫剂。豆油补加量与对照组相比减少约25%。控制发酵液面在35L左右。

同时设置对照组，对照组中，50小时开始补加豆油一直到放罐，豆油按照30g/hr的速度补加直到放罐，硫酸铵50小时后停止补加。

1、补加D消沫剂后液面情况

根据目测，补加D消沫剂后，液面基本上没有泡沫，消沫效果明显优于豆油。

2、补加D消沫剂对头孢菌素C生物合成的影响

补加D消沫剂后，长势与补加豆油没有明显的差异，见图2。

3、补加D消沫剂对发酵液滤速的影响

115小时同时取实验罐(补加D消沫剂)和对照罐(不补加D消沫剂)的发酵液测定滤速，结果见图3。

从图3可以看出，补加D消沫剂对发酵液滤速没有影响。

结论

在头孢菌素C发酵100小时左右开始补加消沫剂，可以有效的控制液面的泡沫，对的生物合成和滤速没有影响。通过成本测算，补加消沫剂后原材料成本比单单补加豆油降低约15%。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种头孢菌素C的发酵方法，其特征在于，所述方法包括：在头孢菌素C发酵过程中，发酵起始第40-60小时起，以20-40g/hr的速度补加豆油，至发酵起始第90-110小时停止补加豆油；在发酵起始90-110小时后以聚醚类消沫剂聚氧乙烯氧丙烯甘油或高碳醇类消沫剂聚乙二醇进行消沫处理，添加量为0.02-0.08g/L泡沫发酵液总量；

采用的发酵培养基为：花生粉：25g/L、玉米粉：17.5g/L、谷朊粉：30g/L、金枪鱼膏：20mL/L、玉米浆：40mL/L、葡萄糖：5g/L、蔗糖：10g/L、蛋氨酸：9g/L、硫酸铵：10g/L、硫酸钙：12g/L、碳酸钙：5g/L、豆油：70mL/L、消沫剂：1mL/L；

发酵培养基中各成分的含量为±10％。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵起始100小时后，进行消沫处理。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，聚醚类消沫剂或高碳醇类消沫剂的添加量为0.03-0.06g/L泡沫发酵液总量。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基中，所述成分在培养基中的含量为±5％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵前期，当铵离子浓度降低到1.5g/L以下时开始补加硫酸铵溶液，控制发酵液中的铵离子浓度在1.2-1.5g/L；所述的发酵前期是发酵的前50小时。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵起始第35-45小时之前，培养温度控制为28±1℃，之后控制为25±1℃。