CN102181504A - 伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及维生素C第二步发酵领域，具体为一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用。(1)选Vc二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基等中，33℃震荡培养至生长稳定期，收集发酵醪液，以0.45μm滤膜过滤弃菌体，滤液再用截留分子量3-5万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成伴生菌活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至山梨糖终浓度达10-11wt％。本发明可解决现有技术中发酵过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定、严重影响生产效率等问题。
Description
技术领域：
本发明涉及维生素C生物发酵领域，具体为一种Vc二步发酵中发酵水平的调控方法，即伴生菌活性胞外液制剂的制取及在Vc二步发酵中的应用。
背景技术：
维生素C第二步发酵是两种菌的混合发酵过程，是一类介质依赖型发酵。发酵中伴生菌通过释放介质(活性蛋白质)促进产酸菌的产酸(古龙酸)，产酸量随其介质的释放而变化。发酵和转化中所依赖介质本身具有生物活性，其释放和发挥作用有其特定规律：混菌发酵开始阶段，伴生菌(如巨大芽孢杆菌)培养4-6小时进入对数生长期，12小时进入稳定期至24小时，之后转入衰亡期，细胞破裂，芽孢释出，不再进行生长和代谢过程，也不再有介质释放，因为在发酵过程中介质的活性可保持12小时，故伴生菌高效促进产酸菌产酸的最佳时段当为12-40小时。
受巨大芽孢杆菌生物活性释放的制约，产酸菌(即氧化葡萄糖酸杆菌)初期生长较慢，产酸很少，处于准闲置状态；进入发酵中期，随伴生菌活性蛋白质大量泌出，产酸菌生长加速，产酸率大幅提高；进入发酵后期，因不再有新的介质补充，产酸菌活性逐渐减弱至终止，发酵40小时后其产酸量仅为前24小时的25％。为提高发酵效率、增加产量，需充分挖掘发酵中期和后期的发酵潜能。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，解决现有技术中发酵过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定，生产效率难以进一步提高等问题。
本发明的技术方案是：
一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，包括如下步骤：
(1)选Vc二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33℃震荡培养至生长稳定期，收集发酵醪液，以0.45μm滤膜过滤弃菌体，滤液用截留分子量3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；
(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达10-11wt％。
所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，伴生菌为巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等。
所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，伴生菌的生长稳定期为培养20-30小时。
所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，无菌滤液用截留分子量为3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至内含10-20mg蛋白质/ml，即制成活性胞外液制剂，无菌分装、20℃以下可保藏3-5日，4℃可保藏10-20日左右。
所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，Vc二步发酵进入中期和后期(35-50小时)，向发酵罐内加入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时应补加10-20wt％的发酵山梨糖水溶液。
本发明具有如下优点：
1、Vc二步发酵是两种菌的混合发酵，这种混菌发酵，在生产上已应用50多年，但由于对混菌间的相互作用未完全查清，实际生产中暴露出了不少问题，主要包括过程可控性差、发酵水平高低波动过大、生产不稳定，严重影响生产效率的进一步提高等。本发明可从根本上解决发酵水平高低、波动过大的难题，稳定了生产，使其真正步入高产、稳产的轨道。
2、本发明依据伴生菌-巨大芽孢杆菌生物活性的释放及活性变化，开发出伴生菌活性胞外液制剂；依据产酸菌，即氧化葡萄糖酸杆菌的发酵特性，在发酵的特定阶段适量添加活性胞外液制剂，补足届时活性介质的缺失，保持发酵的高效运转。
3、在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和后期时，适量添加活性胞外制剂和山梨糖液，可有效调节发酵朝预定的方向发展，发酵底物山梨糖浓度提高20-40％，发酵收率提高2-4个百分点。
具体实施方式：
本发明伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，包括如下步骤：
(1)选Vc二步发酵伴生菌(巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等)接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33℃震荡培养至生长稳定期(20-30小时)，收集发酵醪液，以0.45μm滤膜过滤弃菌体，滤液用截留分子量3-5万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白质含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；
(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期(发酵35-40小时)和/或后期(发酵41-50小时)时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加浓度为10-20wt％的山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达10-11wt％，发酵周期50小时，发酵转化率达92％。
实施例1：
选Vc发酵组合菌G.o+B2980，组合菌中G.o与B2980的个数比例约为1000∶1，接入250ml三角瓶(内含牛肉膏蛋白胨培养基20ml)，29℃，震荡(180转/分)培养35小时，加活性胞外液制剂0.2ml、山梨糖0.4g，继续培养8小时，再加入活性胞外液制剂0.2ml，山梨糖0.2g，6小时后发酵结束，发酵收率提高3％，发酵底物浓度提高37％。
其中，G.o(Gluconobacter oxydans)为产酸菌，即氧化葡萄糖酸杆菌，B2980为伴生菌，即巨大芽孢杆菌。
实施例2：
选组合菌G.o+B2980，组合菌中G.o与B2980的个数比例约为1000∶1，接入250ml三角瓶(内含牛肉膏蛋白胨培养基20ml)，29℃，震荡(180转/分)培养42小时，加活性胞外液制剂0.2ml、山梨糖0.4g，继续发酵6小时，发酵结束，发酵收率提高2.7％，发酵底物浓度提高25％。
实施例3-6：
与实施例1不同之处在于(表1)：
表1
表1中，G.o+B2980组合菌中，G.o与B2980的个数比例约为1000∶1。
应用例1：
4M3发酵罐，注入牛肉膏蛋白胨培养基2.8吨，接入0.3吨G.o+B2980种液，常规发酵40小时，加活性胞外液制剂0.5L，发酵4小时，提高古龙酸收率3.0％；发酵6小时达终点，较对照提早4小时结束发酵。
应用例2：
4M3发酵罐，注入牛肉膏蛋白胨培养基2.8吨，接入0.3吨G.o+B2980种液，常规发酵35小时，加活性胞外液制剂0.4L、山梨糖56kg，继续发酵8小时后，再加入活性胞外液制剂0.5L，6小时后发酵结束，提高古龙酸收率4.6％，山梨糖浓度增加了25％。
Claims (5)
1.一种伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选Vc二步发酵伴生菌接入牛肉膏蛋白胨培养基中，33℃震荡培养至生长稳定期，收集发酵醪液，以0.45μm滤膜过滤弃菌体，滤液再用截留分子量3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至蛋白含量为10-20mg/ml，制成活性胞外液制剂，无菌分装、低温保藏；
(2)在Vc二步发酵中，当发酵进入中期和/或后期时，分别向发酵罐注入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加山梨糖水溶液至终山梨糖浓度达10-11wt％。
2.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，伴生菌为巨大芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、掷孢酵母、类脱发假丝酵母、苏云金芽孢杆菌或啤酒酵母菌等。
3.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，伴生菌的生长稳定期为培养20-30小时。
4.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，滤液用截留分子量为3-10万道尔顿的超滤膜超滤浓缩至内含10-20mg蛋白质/ml，即成活性胞外液制剂，无菌分装、20℃以下保藏3-5日，4℃保藏10-20日。
5.按照权利要求1所述的伴生菌活性胞外液制剂在Vc二步发酵中的应用，其特征在于，Vc二步发酵35-50小时的发酵中期和发酵后期，向发酵罐内加入活性胞外液制剂10-12L/100M3，同时补加浓度为10-20wt％的山梨糖水溶液。
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| CN105420222A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-23 | 帝斯曼江山制药（江苏）有限公司 | 一种普通生酮基古龙酸菌的诱变筛选方法 |
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