CN102864219A

CN102864219A - 一种用多重pcr矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法

Info

Publication number: CN102864219A
Application number: CN2012102333185A
Authority: CN
Inventors: 张成岗; 吴永红; 卢一鸣; 屈武斌; 李军怀; 高艳; 李志慧
Original assignee: Suzhou Sciscape Bio Pharmaceutical Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Current assignee: Suzhou Sciscape Bio Pharmaceutical Technology Co ltd; Institute of Radiation Medicine of CAMMS
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2012-07-05
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明公开了一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。本发明能够在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加样体系中同时进行多重PCR扩增和数据分析，具有可规模化、高通量、高可信度等优点，并且具有十分广泛的应用前景，有望成为基因表达水平和核酸高通量检测的重要技术手段之一。

Description

一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域和分子诊断领域中的多重PCR矩阵检测方法，特别是涉及一种集PCR引物设计、多重PCR矩阵、凝胶电泳及图像采集、基因表达谱定量化及聚类分析为一体的多重PCR矩阵检测方法及其在高通量基因表达谱检测中的应用。

背景技术

随着基因组时代的到来，基因表达调控成为分子生物学及分子诊断学领域的研究重点。目前常用的基因表达调控检测方法主要有：Southern blot、基因芯片、实时定量PCR、大规模基因测序及多重PCR等(Mukherjee et al.Intrachromosomal tandemduplication and repeat expansion during attempts to inactivate thesubtelomeric essential gene GSH1 in Leishmania.Nucleic Acids Res.2011,doi:10.1093/nar/gkr494;Osamu et al.Multiplex cDNA quantification method thatfacilitates the standardization of gene expression data.2011,39(10):e70.doi:10.1093/nar/gkr138.Khan et al.Quantitative analysis of six geneproducts as candidate markers of early placental villi development in thehuman.Indian J Physiol Pharmacol.2010,54(4):299-308;Hua et al.Genomicprofile of Toll-like receptor pathways in traumatically brain-injured mice:effect of exogenous progesterone.J Neuroinflammation.2011,doi:10.1186/1742-2094-8-42)。其中，基于多重PCR技术规模化高通量筛选靶基因表达水平的变化对微生物分类鉴定等有重要意义。虽然传统的基于基因芯片、实时定量PCR和大规模基因测序等技术能够实现基因表达水平的检测，但是由于它们存在假阳性率高、特异性差、成本高以及通常需要反转录PCR(RT-PCR)技术进行进一步验证等缺点使其大规模应用受到了一定限制。同时，近年来出现的PCR阵列技术则以实时定量PCR技术为核心并结合阵列技术(张艳春,任长虹，高艳，屈武斌，张成岗.实时定量PCR阵列技术在规模化检测基因表达中的应用.军事医学科学院院刊,2010,34(6):589-591)，能够用于检测信号转导过程、疾病相关通路等的基因表达图谱，在规模化检测基因表达方面具有一定的优势，但是却不具备高通量的特点。

发明内容

基于发明人长期从事PCR引物设计及评估、凝胶电泳及图像采集分析、基因表达谱定量化及聚类分析的多学科研究，本发明的目的在于提出了一种多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，旨在多重PCR基础上结合矩阵技术更大规模地筛选靶基因，进而进行基因表达水平定量化及聚类分析，以获得靶基因表达谱特征。

本发明提供一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。

所述多重PCR矩阵法检测包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成；

2）模板制备：总RNA的提取及反转录；

3）多重PCR矩阵反应体系加样；

4）多重PCR反应；

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离；

6）凝胶电泳图像采集及预处理；

7）基因表达谱定量化分析；

8）基因表达谱聚类分析，获得具有显著性差异的靶基因。

所述步骤1）中的多重PCR引物包括：多重PCR引物和基因特异反转录引物；多重PCR引物用于多组具有潜在相关性靶基因表达谱的扩增及鉴定，可根据靶基因的基因组或mRNA序列设计多重PCR引物；基因特异反转录引物用于低丰度靶基因的扩增及鉴定，可根据低丰度基因的基因组或mRNA序列设计基因特异反转录引物。

所述引物设计及评估可用以下软件：MPprimer、MFEprimer2.0、Primer3.0、PrimerPremier 6.0、Oligo7.35和DNAman，优选为MPprimer和MFEprimer2.0。

所述步骤2）中模板的制备方法中，首先提取生物体细胞的总RNA，然后用基于通用引物的常规反转录法或基于基因特异性引物与通用引物的两步反转录法将总RNA反转录成cDNA；所述反转录方法优选为基于基因特异性引物和通用引物的两步反转录法。

所述步骤3）中的加样***可以为：自动加样***和手动加样***，优选为自动加样***。

所述步骤5）中的凝胶电泳可以为：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和脉冲场电泳等常规电泳。

所述步骤6）中的凝胶电泳图像采集***可以为：目前市售的各种凝胶图像采集***，针对多重PCR的不同扩增产物，首先采用凝胶电泳进行分离，然后用凝胶成像仪采集图像并结合图像处理软件进行图像预处理(包括图片的删减和明亮度的调节等)，最后用凝胶成像仪自带软件对不同的基因量进行灰度值分析。

所述步骤7）中的基因表达谱定量化分析可以为：内标基因的相对定量法、毛细管电泳或荧光探针绝对定量法等，优选为内标基因的相对定量法和毛细管电泳绝对定量法；所述内标基因的相对定量方法为：根据步骤6）中的凝胶电泳图像采集***获得的目的基因及内标基因的积分光密度值取比值以界定基因表达谱的相对变化趋势；所述毛细管电泳的绝对定量为：对多重PCR扩增产物直接进行毛细管电泳分离，然后结合荧光染料进行实时检测目的基因的表达水平，最后利用定量Marker实现目的基因表达水平的绝对定量。

所述步骤8）中的基因表达谱聚类分析方法为：针对步骤7）中的基因表达谱定量化分析结果，采用生物信息学技术对不同基因进行聚类分析，具体分析过程如下：

①将步骤7）的基因表达谱定量化分析结果形成数据矩阵，每列为一个处理组，每行为一个基因，然后对基因(每一行)和样本(每一列)都进行进一步的标准化，即每个值都除以所在行或列的标准差；

②对①标准化后的矩阵进行无监督聚类分析：使用已知的R软件中分层聚类方法，对基因和处理组同时进行聚类分析；

③对①标准化后的矩阵进行显著性差异统计分析：利用R软件中SAM算法对①标准化后的矩阵进行分析，并且利用分析结果中的q-value（质量因数）对基因的显著性差异进行假阳性控制，将质量因数小于5%定义为显著性差异基因。

以上所述的检测方法用于检测秀丽隐杆线虫中33个Globin基因的表达谱，所述步骤1）中设计的多重PCR引物序列如序列表中序列1-76所示；所述步骤2）中的模板为秀丽隐杆线虫mRNA；所述步骤3）中的多重PCR矩阵反应体系可为：ExTaq酶0.125μl（5U/μl），10×ExTaq Buffer2.5μl，dNTP Mixture2μl，模板（cDNA浓度300μg/mL）1μl，多重PCR引物1.0μl（上游引物浓度10pmol/L，下游引物浓度10pmol/L），ddH2O16.375μl；所述步骤4）中的多重PCR反应条件为：先95℃ 5min；然后95℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃停止反应。

所述的检测方法可对于任意数量的基因表达水平和DNA含量进行多重PCR矩阵检测。

所述的检测方法能够在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加样体系中同时进行多重PCR扩增和数据分析。

本发明的发明人基于在该领域的长期研究，将多重PCR技术和PCR矩阵检测技术相结合，提出了以上多重PCR矩阵检测技术，旨在进行多重PCR基础上结合矩阵技术更大规模地筛选基因表达水平，并根据基因表达水平的高低将其进行聚类，以获得靶基因表达谱特征。该技术不仅克服了传统基于基因芯片、实时定量PCR和大规模基因测序等技术检测基因表达水平方法在可靠性方面的不足，而且还可规模化、高通量、高可信度地获得靶基因的表达谱。

本发明提供了一种多重PCR矩阵检测方法以及利用该检测方法进行高通量核酸检测的方法，与现有多重PCR检测方法的区别在于集成了多重PCR引物设计、多重PCR矩阵检测、凝胶电泳及图像采集、基因表达谱定量化及聚类分析等技术，实现了多重PCR引物设计、规模化基因检测、基因表达谱定量化及聚类分析，具有可规模化、高通量、高可信度等优点，并且具有十分广泛的应用前景，有望成为高通量核酸检测的重要技术手段之一。目前分别有报道多重PCR技术和PCR矩阵技术，但是却并没有发展出多重PCR矩阵技术。相对于目前的多重PCR技术和PCR矩阵技术而言，本发明集成了从多重PCR引物设计及特异性评估、多重PCR矩阵方式检测、基因表达谱定量化和聚类分体为一体、能够在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加样体系中同时进行多重PCR扩增和数据分析的新型多重PCR***，具有规模化程度高、假阳性率低等优点。通过该多重PCR矩阵检测方法，不仅可实现基因表达谱的定量化分析，而且可实现基因表达谱的聚类分析，进而为功能基因间相互调控关系的研究提供重要技术参考。

本发明检测方法由PCR引物设计、多重PCR矩阵、凝胶电泳及图像采集、基因表达谱定量化及聚类分析等部分组成，具有假阳性率低、规模化程度高等特点，具有十分广泛的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为本发明多重PCR矩阵检测方法的整体框架图

图2为用本发明的多重PCR矩阵检测方法对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的表达变化进行检测的流程图

图3为用多重PCR矩阵检测方法及基因特异性引物对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的表达变化进行检测的虚拟电泳图

图4为本发明多重PCR矩阵检测方法中秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因多重PCR扩增产物的1.5％琼脂糖凝胶电泳检测图谱

图5为用图像分析技术对上述琼脂糖凝胶电泳图谱中的核酸条带进行识别和参数计算的结果

图6为用无监督分层聚类方法对秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因的鉴定结果进行聚类分析结果

图7为用SAM算法对秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因鉴定结果进行差异分析结果

具体实施方式

本发明提供了一种用于高通量基因表达谱检测的多重PCR矩阵检测方法，该检测方法包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。

具体来讲，所述多重PCR矩阵检测方法，可包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成；

2）模板制备：总RNA的提取及反转录；

3）多重PCR矩阵反应体系加样；

4）多重PCR反应；

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离；

6）凝胶电泳图像采集及预处理；

7）基因表达谱定量化分析；

8）基因表达谱聚类分析。

在上述多重PCR矩阵检测方法中，所述步骤1）中的多重PCR引物包括：常规多重PCR引物和基因特异反转录引物；常规多重PCR引物用于多组具有潜在相关性靶基因表达谱的扩增及鉴定，可根据靶基因的基因组或mRNA序列设计多重PCR引物；基因特异反转录引物用于低丰度靶基因的扩增及鉴定，可根据低丰度基因的基因组或mRNA序列设计基因特异反转录引物。

所述步骤4）中的凝胶电泳可以为：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和脉冲场电泳等常规电泳。

所述步骤5）中的凝胶电泳图像采集***可以为：目前市售的各种凝胶图像采集***。针对多重PCR的不同扩增产物，首先采用凝胶电泳进行分离，然后用凝胶成像仪采集图像并结合图像处理软件进行图像预处理(包括图片的删减和明亮度的调节等)，最后用凝胶成像仪自带软件对不同的基因量进行灰度值分析。

以上步骤中，步骤7)结合内参基因的积分光密度值对其它各条带进行标准化，增加了不同实验组中核酸电泳条带信号值的可比性，提高了整个方法体系的定量效果；步骤①特别针对多重PCR矩阵检测时噪声较大的特点，对数据进行进一步的标准化，特异地提高了基因表达检测的信噪比；步骤②和③将国际上用于基因芯片数据分析的方法加以继承，发挥了多重PCR矩阵中高通量方法的可视化等，能够直观、清楚地将基因的表达变化展示出来，并且采用严格的统计方法进行差异检验。这些步骤都明显地区别于经典的PCR实验方法，是多重PCR矩阵方法所特有的数据分析方法。

在下述实施例中，用本发明的多重PCR矩阵检测方法检测秀丽隐杆线虫中33个Globin基因的表达变化，所述步骤1）中设计的多重PCR引物序列如序列表中序列1-76所示；所述步骤2）中的模板为秀丽隐杆线虫mRNA；所述步骤3）中的多重PCR矩阵反应体系可为：ExTaq酶0.125μl（5U/μl），10×ExTaq Buffer2.5μl，dNTP Mixture2μl，模板（cDNA浓度300μg/mL）1μl，多重PCR引物1.0μl（上游引物浓度10pmol/L，下游引物浓度10pmol/L），ddH₂O16.375μl；所述步骤4）中的多重PCR反应条件为：先95℃ 5min；然后95℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃停止反应。该实施例的矩阵数量为8组，即分为8管进行多重PCR扩增，其中每组中分别使用了4-6重PCR进行说明，构成了一个含有8组扩增体系的、含有4-6重的多重PCR矩阵扩增体系。类似地，本发明也能够在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加样体系中同时进行多重PCR扩增和数据分析。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、利用本发明的多重PCR矩阵检测方法对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的表达谱进行检测

如图1所示，本发明的多重PCR矩阵检测方法对目的基因的表达谱进行检测，是首先针对目的基因获得基因序列并进行多重PCR引物设计前的预处理(包括保守性分析和引物设计区域分析等)，进而采用引物设计及特异性评估软件针对目的基因序列进行多重PCR引物设计；紧接着针对设计的引物进行稀释、制备模板和多重PCR扩增以获得目的基因；然后针对多重PCR扩增产物采用凝胶电泳进行分离、采集图像及预处理；最后针对基因表达鉴定结果进行定量化和聚类分析。具体来讲，用本发明的多重PCR矩阵检测方法对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的表达谱进行检测，如图2所示，具体方法包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成

针对秀丽隐杆线虫33个Globin基因信息，以act-1为内参基因，分别从NCBI数据库下载相关基因序列，进而采用多重PCR引物设计软件MPprimer(http://biocompute.bmi.ac.cn/MPprimer/)进行多重PCR引物设计，多重PCR引物序列如表1所示（表1总共引物有76条，38对），并采用引物特异性评估软件MFEprimer2.0(http://biocompute.bmi.ac.cn/MFEprimer/)进行特异性评估及虚拟化分析(虚拟电泳图如图3所示（图中，横向1-34依次表示不同电泳泳道，泳道1-33(从左向右)为单重虚拟结果，泳道34(最右一道)为33重虚拟结果，其中白色条带表示不同核酸片段），最后将设计的引物送英俊公司直接合成备用。通过上述引物设计及特异性评估方法，可以根据实验目的获得任意目的基因的多重PCR扩增引物。

表1用于对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的表达谱

进行多重PCR矩阵检测的多重PCR引物序列

2）模板制备

首先将秀丽隐杆线虫正常株系培养到L2期，然后采用0.5g/L浓度亚硫酸钠制备秀丽隐杆线虫低氧模型，并分别于处理后8小时、10小时、12小时和14小时收集线虫，然后利用总RNA提取试剂盒提取线虫的总RNA，具体方法为：将秀丽隐杆线虫采用M9缓冲液清洗三次后转移至组织匀浆器中，然后加入350μl含β-巯基乙醇的TRK裂解缓冲液(1mL TRK Lysis Buffer中加20μl β-巯基乙醇)并研磨至均匀；将研磨均匀的液体吸至1.5mL EP管中，14000r/min室温离心5min，取上清至一新的1.5mLEP管中；向EP管中加入350μl用DEPC处理的70％乙醇，吹打混匀；将混合好的液体加至离心柱上，10000r/min室温离心1.5min；在离心柱中加入300μl RNA WashBufferⅠ，12000r/min室温离心1.5min；DNaseⅠ消化处理（73.5μl DNaseⅠDigestion Buffer和1.5μl RNase-free DNaseⅠ），室温静置15min；加入500μlRNA Wash BufferⅠ，10000r/min室温离心1.5min；加入用无水乙醇稀释过的RNA WashBufferⅡ500μl，10000r/min室温离心1.5min；再次加入500μl RNA Wash BufferⅡ，10000r/min室温离心1.5min；换新的收集管，120000r/min室温空甩2.5min；将柱子插到新的1.5mL离心管中，加入40μl DEPC水，10000r/min室温离心1.5min，收集RNA至离心管中；取出1μl RNA并稀释100倍，利用紫外分光光度计检测其在260nm、280nm的吸光值并计算其纯度和浓度，其余放于-80℃保存。

最后将上述提取的总RNA按照说明书加样后反转录成cDNA以用作多重PCR扩增模板，具体方法为：按照下述加样体系加样：总RNA1μg+10pmol/L oligo d(T)₁₂1μl+RNase Free water补齐至12μl，65℃变性5min后迅速冰浴冷却，然后加入4μl5×RT buffer，2μl dNTP，1μl RNase Inhibitor和1μl Rever TraAce进行反转录(步骤为：30℃×10min→42℃×30min→85℃×5min→4℃停止)。

3）多重PCR矩阵反应体系加样

采用自动加样***按照如下加样量进行多重PCR矩阵反应体系加样：ExTaq酶0.125μl（5U/μl），10×ExTaq Buffer2.5μl，dNTP Mixture2μl，模板（cDNA浓度300μg/mL）1μl，多重PCR引物1.0μl（上游引物浓度10pmol/L，下游引物浓度10pmol/L），ddH₂O 16.375μl。

4）多重PCR反应

将上述加样体系放入PCR检测仪，按照以下多重PCR反应条件进行多重PCR扩增为：先95℃ 5min；然后95℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃停止反应。

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离

将上述多重PCR扩增产物采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对多重PCR扩增产物进行分离，得到琼脂糖凝胶电泳图谱，如图4所示。

6）凝胶电泳图像采集及预处理

针对上述琼脂糖凝胶电泳分离电泳图（图4）采用凝胶成像仪（型号ChampGel^TM5000，购自北京赛智创业科技有限公司）采集图像，进而结合Photoshop、Picturemanager等图像处理软件对琼脂糖凝胶电泳图谱进行图像预处理(包括图片的删减和明亮度的调节等)，最后用凝胶成像仪自带的Lane 1D软件对不同的基因条带进行灰度值分析以获得每个条带的积分光密度值（Integrated Optical Density,IOD，该IOD值与基因表达量正相关），从而为后续基因表达谱的定量化及聚类分析提供原始数据。Lane 1D软件针对秀丽隐杆线虫33个Globin基因的分析结果如图5所示，其中，横向泳道1-8分别表示常氧培养8小时、缺氧培养8小时、常氧培养10小时、缺氧培养10小时、常氧培养12小时、缺氧培养12小时、常氧培养14小时、缺氧培养14小时，纵向条带1-6分别表示Globin-30、Globin-29、Globin-26、Globin-27、Actin-1、Globin-28，Marker为DL2000 DNA Marker。

7）基因表达谱定量化分析

基因表达谱定量化分析可以采用两种方法：

其1.基于内标基因相对定量法：利用内标基因来界定目的基因的相对表达量，是将上述得到的每个基因的积分光密度值除以其内标基因的积分光密度值,所得的比值作为相对表达量，结果见表2。随着缺氧时间的增加，glb-5的表达上调，但在缺氧14小时有所下降；glb-8的表达下调，10小时缺氧组下降水平最大；glb-11的表达水平上调，但14小时缺氧组下降明显；glb-13的表达水平先增加后减少，说明对缺氧产生了适应性，提示glb-13可能是缺氧调控基因；glb-14、22表达水平下调；glb-29表达上调。

表2基于多重PCR矩阵技术获得的秀丽线虫33个Globin基因

在不同时间常氧和缺氧处理后的表达水平

单位：相对表达量

其2.基于毛细管电泳的绝对定量法：将上述步骤1）-4）获得的多重PCR矩阵扩增产物可以直接采用毛细管电泳进行分离，获得各基因条带的峰图后利用内标Marker进行基因表达量的绝对定量分析。

8）基因表达谱聚类分析

针对步骤7）中的基因表达谱定量化分析结果，采用生物信息学技术对不同基因进行聚类分析，具体分析过程如下：

①将步骤7）中的基因表达量（相对表达量如表2所示）形成数据矩阵，每列为一个处理组，每行为一个基因，然后对基因(每一行)和样本(每一列)都进行进一步的标准化，即每个值都除以所在行或列的标准差；

②对①标准化后的矩阵进行无监督聚类分析：使用已知的R软件中分层聚类方法，对基因和处理组同时进行聚类，结果如图6所示，横向表示每个实验分组，纵向表示多重PCR检测的不同基因；绿色（图6中较浅部分）表示高表达基因，红色（图6中较深部分）表示低表达基因，黑色（图6中最深部分）表示中等表达基因，可以看出不同的检测基因（横坐标所列）在不同的实验条件下（纵坐标所列）表现出协同或不同的表达变化模式，表明本方法可以有效地同时检测不同实验条件下各类模式的基因表达；

③对①标准化后的矩阵进行显著性差异统计分析：利用R软件中SAM(Significance Analysis of Microarrays，微阵列显著性分析，可用于统计学意义上的基因差异表达的限制性检验)算法对①标准化后的矩阵进行分析（对秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因表达谱的差异分析结果如表3所示），并且利用分析结果中的q-value（质量因数，又称False Discovery Rate，是以假阳性事件数量为分子、以假阳性和真实阳性事件数量为分母计算得出的）对基因的显著性差异进行假阳性控制，将质量因数小于5%定义为显著性差异基因（对秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因鉴定结果的差异分析如图7所示）。

表3秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因表达谱的差异分析结果

从表3和图7可以看出秀丽隐杆线虫体内33个Globin基因中有29个正调控基因和4个负调控基因，其中有3个基因（glb-8、glb-11、glb-5基因）为显著正调控基因，如图7中浅灰色的正方形点所示，观测分值高于期望分值的阈值，表明这三个基因为显著上调基因，同时q-value为0。

本实施例通过以上步骤，获得了秀丽线虫globin 33个基因在不同的实验条件下的表达量，得到了三个显著正调控的基因，可以确定其为缺氧相关靶基因。

以上使用了秀丽线虫globin 33个基因的表达检测作为实施例，只作为一个应用例子，不作为对本发明的限定。本发明方法可用于大量任意基因的检测，是该方法的优势所在，理论上可以用来检测全部人类基因或者部分人类基因以及其他物种基因的表达水平，以及含有相同来源或不同来源的复杂样品中的核酸含量。

Claims

1.一种用多重PCR矩阵法进行高通量基因表达谱检测的方法，包括多重PCR引物设计、多重PCR矩阵扩增、凝胶电泳及图像采集和基因表达谱定量化及聚类分析。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于,多重PCR矩阵法检测包括以下步骤：

1）高度特异性引物设计、评估及合成；

2）模板制备：总RNA的提取及反转录；

3）多重PCR矩阵反应体系加样；

4）多重PCR反应；

5）多重PCR扩增产物凝胶电泳分离；

6）凝胶电泳图像采集及预处理；

7）基因表达谱定量化分析；

8）基因表达谱聚类分析，获得具有显著性差异的靶基因。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：所述步骤1）中的多重PCR引物包括：多重PCR引物和基因特异反转录引物；多重PCR引物用于多组具有潜在相关性靶基因表达谱的扩增及鉴定，可根据靶基因的基因组或mRNA序列设计多重PCR引物；基因特异反转录引物用于低丰度靶基因的扩增及鉴定，可根据低丰度基因的基因组或mRNA序列设计基因特异反转录引物。

4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述引物设计及评估可用以下软件：MPprimer、MFEprimer2.0、Primer3.0、Primer Premier 6.0、Oligo7.35和DNAman，优选为MPprimer和MFEprimer2.0。

5.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤2）中模板的制备方法中，首先提取生物体细胞的总RNA，然后用基于通用引物的常规反转录法或基于基因特异性引物与通用引物的两步反转录法将总RNA反转录成cDNA；所述反转录方法优选为基于基因特异性引物和通用引物的两步反转录法。

6.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤3）中的加样***可以为：自动加样***和手动加样***，优选为自动加样***。

7.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤5）中的凝胶电泳可以为：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳和脉冲场电泳等常规电泳。

8.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤6）中的凝胶电泳图像采集***可以为：目前市售的各种凝胶图像采集***，针对多重PCR的不同扩增产物，首先采用凝胶电泳进行分离，然后用凝胶成像仪采集图像并结合图像处理软件进行图像预处理(包括图片的删减和明亮度的调节等)，最后用凝胶成像仪自带软件对不同的基因量进行灰度值分析。

9.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤7）中的基因表达谱定量化分析可以为：内标基因的相对定量法、毛细管电泳或荧光探针绝对定量法等，优选为内标基因的相对定量法和毛细管电泳绝对定量法；

所述内标基因的相对定量方法为：根据步骤6）中的凝胶电泳图像采集***获得的目的基因及内标基因的积分光密度值取比值以界定基因表达谱的相对变化趋势；

所述毛细管电泳的绝对定量为：对多重PCR扩增产物直接进行毛细管电泳分离，然后结合荧光染料进行实时检测目的基因的表达水平，最后利用定量Marker实现目的基因表达水平的绝对定量。

10.根据以上任一权利要求所述的检测方法，其特征在于：所述步骤8）中的基因表达谱聚类分析方法为：针对步骤7）中的基因表达谱定量化分析结果，采用生物信息学技术对不同基因进行聚类分析，具体分析过程如下：

11.根据权利要求1-10任一项所述的检测方法，其特征在于：检测秀丽隐杆线虫中33个Globin基因的表达谱，所述步骤1）中设计的多重PCR引物序列如序列表中序列1-76所示；所述步骤2）中的模板为秀丽隐杆线虫mRNA；所述步骤3）中的多重PCR矩阵反应体系可为：ExTaq酶0.125μl（5U/μl），10×ExTaq Buffer 2.5μl，dNTPMixture 2μl，模板（cDNA浓度300μg/mL）1μl，多重PCR引物1.0μl（上游引物浓度10pmol/L，下游引物浓度10pmol/L），ddH₂O 16.375μl；所述步骤4）中的多重PCR反应条件为：先95℃ 5min；然后95℃ 45s，62℃ 45s，72℃ 1min，共35个循环；最后72℃ 7min，4℃停止反应。

12.根据权利要求1-11任一项所述的检测方法，其特征在于：可对于任意数量的基因表达水平和DNA含量进行多重PCR矩阵检测。

13.根据权利要求1-12任一项所述的检测方法，其特征在于：能够在25孔板、96孔板、384孔板、1536孔板等PCR加样体系中同时进行多重PCR扩增和数据分析。