CN110606844A - 一种莫匹罗星的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种莫匹罗星的纯化方法，所述方法包括以下步骤：将莫匹罗星粗品加水溶解，加入盐并调节pH至6.0～7.0，采用中等极性大孔树脂进行色谱分离，得到莫匹罗星解吸合格液；将所述莫匹罗星解吸合格液进行纳滤浓缩；对所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的莫匹罗星。本发明采用大孔树脂色谱分离莫匹罗星粗品的水溶液，再经过纳滤、结晶和干燥，可以使莫匹罗星的纯度达到99％以上，而且本发明的纯化过程中完全不使用有机溶剂，工艺简单、成本低、生产效率高且降低生产危险性，适合大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵制药领域，更具体地，涉及一种莫匹罗星的纯化方法。
背景技术
莫匹罗星，化学式C26H44O9，结构式如下所示，分子量是500.63，也叫假单胞菌酸A，是由荧光假单胞菌发酵产生的一种天然广谱抗生素。
莫匹罗星对革兰氏阳性球菌的敏感度高，对某些革兰氏阴性球菌也有效，与其抗生素无交叉耐药性。目前在我国临床上莫匹罗星主要用于治疗由金黄色葡萄球菌和链球菌所致各种感染性皮肤病，包括：原发性皮肤感染，如脓胞疮、毛囊炎和疥疮等；继发性皮肤感染，如湿疹、异位性皮炎、皮肤溃疡、手术伤口、小面积烧伤、皮肤外伤；其他还可用于小伤口、切口以及其他灭菌性病损的预防感染。
现有的从莫匹罗星发酵液中提纯莫匹罗星的方法，都涉及到有机溶剂萃取、结晶以及使用有机溶剂在树脂上解吸。例如，有专利报道，依次经过发酵液膜过滤、滤液膜浓缩、溶剂萃取、脱水剂脱水、减压浓缩、结晶和过滤的步骤，从而提纯莫匹罗星，其中要使用到大量的萃取有机溶剂乙酸乙酯或丙酮等。
但是大量的使用有机溶剂不仅提高了成本而且不利于安全环保。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种完全不使用有机溶剂的莫匹罗星的纯化方法。
本发明提供一种莫匹罗星的纯化方法，包括以下步骤：
(1)将莫匹罗星粗品加水溶解，加入盐并调节pH至6.0～7.0，采用中等极性大孔树脂进行色谱分离，得到莫匹罗星解吸合格液；
(2)将所述莫匹罗星解吸合格液进行纳滤浓缩；
(3)对步骤(2)所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的莫匹罗星。
本发明发现在水相中使用中等极性大孔树脂进行吸附时，加入一定量的盐可以降低莫匹罗星的溶解度，增强树脂对莫匹罗星的吸附能力，而且发现选择中等极性大孔树脂能兼顾吸附和解吸，其对莫匹罗星既吸附好又容易解吸，可以避免使用有机溶剂解吸。
本发明采用中等极性大孔树脂色谱分离莫匹罗星粗品的水溶液，再经过纳滤、结晶和干燥，可以使莫匹罗星的纯度达到99％以上，而且本发明的纯化过程中完全不使用有机溶剂，工艺简单、成本低、生产效率高且降低生产危险性，适合大规模生产。
进一步地，步骤(1)中，所述莫匹罗星粗品通过如下方法得到：将莫匹罗星发酵液pH调节至2.5～3.5后进行固液分离，向分离得到的渣中加入碳酸氢铵溶液后固液分离得滤液，将所述滤液进行纳滤浓缩，再进行粗结晶。
当原料为莫匹罗星发酵液时，前期处理是很关键的，若处理较为粗放或析出物质量不好，则后续很难实现不用有机溶剂进行纯化。本发明先将发酵液调整到酸性，降低莫匹罗星的溶解性，让其经第一次固液分离基本保留在菌渣中，将大量的水溶性的色素、蛋白质去除，再用弱碱水萃取，让大量碱性水溶性差的物质被过滤掉，配合纳滤在收浓的过程中，又可以去除一部分小分子的盐，多次的纯化才得到了成型的粗晶体。将粗晶体再使用中等极性树脂色谱分离，纯化效果得到保证，获得色谱纯度大于99％的莫匹罗星。
进一步地，在所述莫匹罗星粗品制备过程中，所述固液分离优选采用板框压滤。
所述碳酸氢铵溶液的浓度为5～6wt％。
所述碳酸氢铵溶液与所述渣的用量比为1～2ml:1g。
所述纳滤采用截留分子量为200～300的纳滤膜。选择上述范围内的纳滤膜，既能保证收率较高，又不会使过滤速度太慢。
经所述纳滤后浓缩至浓缩液中莫匹罗星的含量为40～60g/L。
所述粗结晶为调节浓缩液pH为3.0～4.0再进行结晶，调节pH采用盐酸、草酸、醋酸、硫酸或磷酸，优选为盐酸。
进一步地，步骤(1)中，所述中等极性大孔树脂为上海华震的HZ-806。
所述色谱分离时，以0.01～0.03wt％的碳酸氢铵为解吸液。
对于莫匹罗星，其在酸性条件下水溶性不好，在碱性条件下水溶性好。碳酸氢氨能使莫匹罗星的水溶性增强，从而减弱它和中等极性大孔树脂的结合，解吸下来；经过实验发现，一定浓度碳酸氢铵溶液能对产品进行色谱分离起到好的作用，其它的碱层析分离，不是解吸太快就是解吸太慢，且分离的色谱纯化较差，达不到理想效果。
所述莫匹罗星解吸合格液为色谱纯度大于90％的解吸液。
在本发明一个优选实施方式中，步骤(1)具体为，将莫匹罗星粗品加水溶解至10g～20g/L，加入2～3wt％氯化钠并调pH至6.0～7.0作为上柱液，进行上柱，上柱完水洗后再用碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液。
进一步地，步骤(2)中，所述纳滤采用截留分子量为200～300的纳滤膜。
经所述纳滤后浓缩至浓缩液中莫匹罗星的含量为40～60g/L。
进一步地，步骤(3)中，所述结晶为调节浓缩液pH为3.0～4.0再进行结晶，调节pH采用盐酸、草酸、醋酸、硫酸或磷酸，优选为盐酸。
此处将浓缩液先调节至酸性可以降低莫匹罗星的溶解度，有利于结晶。实验结果表明，此处采用酸性结晶比常规的直接降温结晶得到的杂质少(不一定是传统意义能够检测的杂质，还包括许多没有紫外吸收值无法定量检测的杂质)。当然，最终能将产品纯化至99％离不开每一步的纯化操作，这是各步骤间相互协同才实现的。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳实施例。
作为本发明一个优选的具体实施方式，所述纯化方法包括以下步骤：
(1)将浓度为2000～3000μg/ml的莫匹罗星发酵液pH调节至2.5～3.5后进行板框压滤得渣，向所得渣中加入浓度为5～6wt％的碳酸氢铵溶液，搅拌2～4小时后进行板框压滤得滤液；
(2)将步骤(1)所得滤液经截留分子量为200～300的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩至莫匹罗星的含量为40～60g/L；
(3)将步骤(2)所得浓缩液pH调节为3.0～4.0进行粗结晶；
(4)将步骤(3)所得莫匹罗星粗品加水溶解至10g～20g/L，加入2～3wt％氯化钠并调pH至6.0～7.0作为上柱液，进行上柱，上柱完水洗后再用0.01～0.03wt％的碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液；
(5)将步骤(4)所得莫匹罗星解吸合格液经截留分子量为200～300的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩至莫匹罗星的含量为40～60g/L；
(6)将步骤(5)所得浓缩液pH调节为3.0～4.0进行结晶；
(7)将步骤(6)所得结晶进行真空干燥。
本发明采用大孔树脂色谱分离莫匹罗星粗品的水溶液，再经过纳滤、结晶和干燥，可以使莫匹罗星的纯度达到99％以上，而且本发明的纯化过程中完全不使用有机溶剂，工艺简单、成本低、生产效率高且降低生产危险性，适合大规模生产。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种莫匹罗星的纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)将2275ug/ml莫匹罗星发酵液60L用稀盐酸调节至pH2.5后，经过板框过滤除去莫匹罗星发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，得到莫匹罗星菌渣；称量菌渣重量后，加入浓度为5％的碳酸氢铵溶液，体积(ml)为菌渣重量(g)的1.5倍，搅拌4小时后再进行板框过滤，进一步去掉色素等杂质，得到莫匹罗星滤液40L，含量为3345.72ug/ml；
(2)将莫匹罗星滤液一次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为40g/L；
(3)将浓缩液用稀盐酸调pH为3.0进行一次结晶，经离心后得到莫匹罗星粗品115.34g；
(4)将莫匹罗星粗品加水溶解至10g/L，加入2％的氯化钠，再调pH为6.0，以1倍柱床的流速上柱，色谱柱为上海华震的HZ-806，上柱完水洗(体积为3倍柱床)，水洗完后用0.025％碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液，含有莫匹罗星103.00g；
(5)将莫匹罗星解吸合格液二次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为40g/L；
(6)浓缩液用稀盐酸调pH为4.0进行二次结晶，经离心后得到莫匹罗星潮晶；
(7)将潮晶在温度55℃下真空干燥，真空为-0.092MPa，得到莫匹罗星成品88.61g，色谱纯度为99.4％。
实施例2
本实施例提供一种莫匹罗星的纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)将2870.22ug/ml莫匹罗星发酵液60L用稀盐酸调节至pH3.5后，经过板框过滤除去莫匹罗星发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，得到莫匹罗星菌渣；称量菌渣重量后，加入浓度为5％的碳酸氢铵溶液，体积为菌渣重量2倍，搅拌2小时后再进行板框过滤，进一步去掉色素等杂质，得到莫匹罗星滤液60L，含量为2812.96ug/ml；
(2)将莫匹罗星滤液一次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为60g/L；
(3)浓缩液用稀盐酸调pH为4.0进行一次结晶，经离心后得到莫匹罗星粗品148.74g；
(4)将莫匹罗星粗品加水溶解至20g/L，加入3％的氯化钠，再调pH为7.0，以1倍柱床的流速上柱，色谱柱为上海华震的HZ-806，上柱完水洗(体积为3倍柱床)，水洗完后用0.025％碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液，含有莫匹罗星131.19g；
(5)将莫匹罗星解吸合格液二次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为60g/L；
(6)浓缩液用稀盐酸调pH为3.0进行二次结晶，经离心后得到莫匹罗星潮晶；
(7)将潮晶在温度60℃下真空干燥，真空为-0.092MPa，得到莫匹罗星成品114.50g，色谱纯度为99.1％。
实施例3
本实施例提供一种莫匹罗星的纯化方法，具体包括以下步骤：
(1)将2091.56ug/ml莫匹罗星发酵液60L用稀盐酸调节至pH3.5后，经过板框过滤除去莫匹罗星发酵液中的水溶性蛋白、色素等大分子物质，得到莫匹罗星菌渣；称量菌渣重量后，加入浓度为6％的碳酸氢铵溶液，体积为菌渣重量1倍，搅拌3小时后再进行板框过滤，进一步去掉色素等杂质，得到莫匹罗星滤液32L，含量为3831.94ug/ml；
(2)将莫匹罗星滤液一次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为40g/L；
(3)浓缩液用稀盐酸调pH为3.53进行一次结晶，经离心后得到莫匹罗星粗品106.37g；
(4)将莫匹罗星粗品加水溶解至15g/L，加入2.5％的氯化钠，再调pH为6.5，以1倍柱床的流速上柱，色谱柱为上海华震的HZ-806，上柱完水洗(体积为3倍柱床)，水洗完后用0.025％碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液，含有莫匹罗星93.93g；
(5)将莫匹罗星解吸合格液二次纳滤浓缩，浓缩至浓缩液中的莫匹罗星含量为50g/L；
(6)浓缩液用稀盐酸调pH为3.50进行二次结晶，经离心后得到莫匹罗星潮晶；
(7)将潮晶在温度55℃下真空干燥，真空为-0.092MPa，得到莫匹罗星成品82.28g，色谱纯度为99.2％。
最后，本发明的实施例仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种莫匹罗星的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将莫匹罗星粗品加水溶解，加入盐并调节pH至6.0～7.0，采用中等极性大孔树脂进行色谱分离，得到莫匹罗星解吸合格液；
(2)将所述莫匹罗星解吸合格液进行纳滤浓缩；
(3)对步骤(2)所得浓缩液进行结晶、干燥，即得纯化后的莫匹罗星。
2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述莫匹罗星粗品通过如下方法得到：将莫匹罗星发酵液pH调节至2.5～3.5后进行固液分离，向分离得到的渣中加入碳酸氢铵溶液后固液分离得滤液，将所述滤液进行纳滤浓缩，再进行粗结晶。
3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述莫匹罗星粗品的制备过程中，所述固液分离采用板框压滤；
和/或，所述碳酸氢铵溶液的浓度为5～6wt％；
和/或，所述碳酸氢铵溶液与所述渣的用量比为1～2ml:1g。
4.根据权利要求2或3所述的纯化方法，其特征在于，所述莫匹罗星粗品的制备过程中，所述纳滤采用截留分子量为200～300的纳滤膜；
和/或，经所述纳滤后浓缩至浓缩液中莫匹罗星的含量为40～60g/L。
5.根据权利要求2～4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述莫匹罗星粗品的制备过程中，所述粗结晶具体为调节浓缩液pH为3.0～4.0再进行结晶，调节pH采用盐酸、草酸、醋酸、硫酸或磷酸，优选为盐酸。
6.根据权利要求1～5任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述中等极性大孔树脂为上海华震的HZ-806；
和/或，所述色谱分离时，以0.01～0.03wt％的碳酸氢铵为解吸液；
和/或，所述莫匹罗星解吸合格液为色谱纯度大于90％的解吸液。
7.根据权利要求6所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)具体为，将莫匹罗星粗品加水溶解至10g～20g/L，加入2～3wt％氯化钠并调pH至6.0～7.0作为上柱液，进行上柱，上柱完水洗后再用碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液。
8.根据权利要求1～7任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述纳滤采用截留分子量为200～300的纳滤膜；
和/或，经所述纳滤后浓缩至浓缩液中莫匹罗星的含量为40～60g/L。
9.根据权利要求1～8任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤(3)中，所述结晶具体为调节浓缩液pH为3.0～4.0再进行结晶，调节pH采用盐酸、草酸、醋酸、硫酸或磷酸，优选为盐酸。
10.根据权利要求1～9任一项所述的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将浓度为2000～3000μg/ml的莫匹罗星发酵液pH调节至2.5～3.5后进行板框压滤得渣，向所得渣加入浓度为5～6wt％的碳酸氢铵溶液，搅拌2～4小时后进行板框压滤得滤液；
(2)将步骤(1)所得滤液经截留分子量为200～300的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩至莫匹罗星的含量为40～60g/L；
(3)将步骤(2)所得浓缩液pH调节为3.0～4.0进行粗结晶；
(4)将步骤(3)所得莫匹罗星粗品加水溶解至10g～20g/L，加入2～3wt％氯化钠并调pH至6.0～7.0作为上柱液，进行上柱，上柱完水洗后再用0.01～0.03wt％的碳酸氢铵解吸，收集色谱纯度大于90％的解吸液；
(5)将步骤(4)所得莫匹罗星解吸合格液经截留分子量为200～300的纳滤膜进行纳滤浓缩，浓缩至莫匹罗星的含量为40～60g/L；
(6)将步骤(5)所得浓缩液pH调节为3.0～4.0进行结晶；
(7)将步骤(6)所得结晶进行真空干燥。
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