CN104982198A

CN104982198A - 高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用微生物菌株

Info

Publication number: CN104982198A
Application number: CN201510361863.6A
Authority: CN
Inventors: 马艳; 王秋君; 王光飞; 郭德杰
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-06-26
Filing date: 2015-06-26
Publication date: 2015-10-21
Anticipated expiration: 2035-06-26
Also published as: CN104982198B

Abstract

本发明公开一种高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用微生物菌株，该方法为：清除土壤中前茬作物残体，旋耕后施入有机肥和化肥，然后撒施棉隆，调整土壤含水率，再以西瓜栽植行为中心覆盖塑料薄膜，薄膜边缘均埋入土壤，消毒后12-20d后剪开塑料薄膜并揭至两边，通风3-4d，再均匀撒施木霉固体菌剂，栽植西瓜苗，将塑料薄膜覆盖在西瓜苗周围；所述木霉固体菌剂是由保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉制备的；本发明既减少棉隆消毒剂和塑料薄膜的使用对环境造成的污染，且对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制作用，可以达到持续抑制病原菌数量增加、增强病害防控效果的目的。

Description

高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用微生物菌株

技术领域

本发明涉及农作物病害防治领域，特别是一种高效防控西瓜枯萎病的方法及其专用菌株。

背景技术

西瓜是一种深受人们欢迎的水果，随着社会需求量的增加，西瓜的种植面积也不断扩大，而西瓜枯萎病的发生也越来越普遍而严重，成为世界范围内毁灭性的土传真菌病害，该病害的病原菌为尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporumf.sp.niveum FON），病原菌以菌丝、分生孢子、厚垣孢子和菌核能够在土壤或未腐熟的带菌肥料、病残株、种子和土壤中越冬，在离开寄主的情况下也能存活5－6年，少部分病菌甚至可以存活10年以上，一般分布在0-25cm土层内，是来年发病的初侵染源，已成为导致西瓜减产的主要因素。目前，防控西瓜枯萎病的方法主要有化学药剂防控、生物防控、选育抗病品种及农业措施等，虽然这些方法都不断取得进步与发展，也有不少成功的试验报道，但在生产层面、大面积推广应用上，至今仍缺乏简便、经济可行和防效稳定的防控措施。

土壤调控是指运用物理、化学和生物学的方法改良土壤、杀灭或抑制土传病原菌，有效改善土壤理化、养分和生物学性状，改善作物生长环境进而达到防控土传病害的目的，是目前有效防控土传病害的重要手段。常用的土壤调控方法主要有土壤消毒、生物熏蒸、施用有机物料等.土壤消毒是一种通过杀灭或抑制土壤中有害生物进而达到防控土传病害的方法，其中以化学熏蒸剂棉隆使用最为广泛。棉隆（dazomet）,又名必速灭，二甲噻二嗪，是一种安全、高效、无残留的新型化学消毒剂，其遇水分解生成异硫氰酸甲酯气体，可迅速扩散至物料中，杀灭各种病原物和杂草种子，其可有效杀灭枯萎病菌、根腐病菌、立枯丝核病菌、菌核病菌、炭疽病菌、灰霉病菌、早晚疫病菌、黄萎病菌、根结线虫和常见杂草种子等多种有害生物（但对环境中大部分细菌没有抑制作用）。已有报道显示，目前将棉隆用于土壤消毒的方法均是将棉隆均匀撒施在整块土壤上，然后耕耘、浇水、覆膜保持一定时间进行土壤消毒，棉隆和塑料薄膜的用量均较大，消毒成本高，不利于大面积推广应用。

现有文献表明，土壤消毒虽然可以显著降低土壤中病原菌数量，但由于土壤状况的复杂性，在田间状态下，任何土壤消毒方法都很难完全消除病原菌；而如果在土壤消毒结束时短暂的“微生物真空期”（真菌数量极少）立即添加能抑制病原菌生长且在土壤和作物根际有较强竞争优势和良好定殖能力的有益微生物，将会在土壤和作物根际继续营造不利于病原菌生存的环境以达到持续控制病害的效果。“棉隆与粉红螺旋聚孢霉67-1协同防治黄瓜枯萎病的研究”（田甜等，中国生物防止学报，2014）公开了一种化学熏蒸联合生防菌剂防控黄瓜枯萎病的方法，其在化学消毒后的微生物真空期内，引入生防菌67-1定植，取得了较好的黄瓜枯萎病防控效果，然而该方法需将土壤全部统一熏蒸，工作量大；西瓜的种植密度显著不同于黄瓜，因此，基于西瓜实际的田间种植方式，发明一种适宜的土壤消毒方法，对防控西瓜土传枯萎病具有重大的生产指导意义；目前未见到将土壤局部土壤消毒后再施用微生物菌剂防控西瓜土传枯萎病的相关报道。

发明内容

针对上述问题，提供一种棉隆用量少、覆膜少、操作简便的土壤消毒方法及其专用微生物菌株，应用于防控西瓜枯萎病，本发明是这样实现的：

一种高效防控西瓜枯萎病的方法，具体步骤如下：

（a）清除前茬作物残体，土壤旋耕20-25cm，施入有机肥和化肥，土壤温度在15℃以上时，然后以西瓜栽植行为中心、幅宽110cm，按施入量45-50g/m²均匀撒施棉隆，再将土壤旋耕20-25cm，调整土壤含水率为20-30%；

（b）以西瓜栽植行为中心覆盖塑料薄膜，覆盖土壤宽度为100cm，塑料薄膜边缘均埋入土壤，埋入深度为30cm，消毒12-20d；

（c）消毒结束后,沿栽植行中部剪开塑料薄膜并揭至两边，通风3-4d；以45-60g/m²的施入量均匀撒施木霉固体菌剂，然后旋耕土壤，栽植西瓜苗，最后将塑料薄膜覆盖在西瓜苗周围；

所述木霉固体菌剂中木霉菌的含量不低于1x10⁹cfu/g。

进一步，本发明中，所述的棉隆为50%可湿性粉剂或98-100%微粒剂。

进一步，本发明中，所述的塑料薄膜厚度不低于0.4mm。

进一步，本发明中所述木霉固体菌剂是这样获得的：将木霉孢子接种到PDA培养基中活化，28±2℃培养3-5d；然后将活化后的菌种接种至PDB培养基中，28±2℃，160r/min摇床培养3-4d；再将菌种接种至固体培养基中，28±2℃培养6-8d，最后自然风干或30℃烘干至水分小于10%，即获得木霉固体菌剂，其中木霉菌含量为10^10-11cfu/g；所述固体培养基是由麸皮和稻草粉按质量比为4：6混合后，调整水分含量为60-65%获得。

进一步，本发明所述木霉菌为保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉（Trichoderma viride）。

本发明中，施入的化肥和有机肥均为常规用量，一般有机肥使用为600-800kg/亩，化肥用量为50-60kg/亩。

西瓜的种植行距一般在170-180cm，而依据现有文献记载西瓜整个生育期根系最大覆盖宽度约100厘米，因此，将西瓜根系周围100厘米的宽度范围的土壤进行消毒，同时将该部分土壤与未消毒区土壤进行隔离，防止未消毒区土壤中病原菌迁移到消毒土壤中，不但极大减少棉隆的用量，而且覆盖所需的塑料薄膜也随着减少，操作更为便捷。

绿色木霉菌生长速度快、生物量大，具有较强的生态竞争能力、对许多植物病原真菌的生长抑制作用以及对作物生长的促进作用，已被国内外作为一种重要的防病微生物商业化生产，并在农业生产上广泛应用。本申请所使用的保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉菌，是由江苏省农科院从土壤中筛选到的，该菌对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制效果且在西瓜根际有良好定殖能力，将该绿色木霉施用于棉隆消毒后的土壤中，抑制病原菌的生长和侵染，增强对西瓜枯萎病的防控效果。

与现有技术相比，本发明采用新型环保、无残留、已被广泛接受的化学熏蒸剂棉隆对土壤进行消毒处理，最大程度杀灭或降低土壤中病原菌数量；其次，通过对以西瓜栽植行为中心的局部范围内的土壤进行消毒，可以将棉隆和塑料薄膜用量降低40-60%，减少消毒剂和薄膜对环境资源的污染；其三，覆盖用的塑料薄膜深埋（深入土壤30cm，而病菌通常分布在土壤表层0-25cm范围内）到100厘米宽的土壤四周，消毒结束后并不移走，而是起到物理隔离作用，阻止未消毒区土壤中的病原菌迁移到消毒区土壤中，在西瓜整个生长季节还可以起到地膜的作用，节省地膜用量；最后，施用的保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉菌在土壤中繁殖速度快且对西瓜枯萎病菌有强烈的生长抑制作用，可以达到持续抑制病原菌数量增加、增强病害防控效果的目的；整个防控施用过程易于操作，为西瓜枯萎病及其他土传病害防控开辟新的途径和提供新的思路。

附图说明

图1为实施例不同棉隆用量对西瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌）的生长抑制效果示意图；

图2为实施例绿色木霉TV41 对西瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌）的生长抑制效果示意图。

具体实施方式

实施例中涉及的培养基：

PDA培养基：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，琼脂10克，水500毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至500毫升，冷却备用；

PDA平板：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，琼脂10克，水500毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加糖及琼脂，加热煮沸至琼脂溶化，补足体积至500毫升，平均分装到2个1000毫升三角瓶中，121℃高压灭菌15min，高压锅取出后冷却到50℃左右在超净工作台中倒入直径9厘米的无菌培养皿中，每个培养皿倒20毫升，待培养基冷却后备用；

PDB培养基：马铃薯100克，葡萄糖或蔗糖10克，水500毫升，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用2层纱布过滤，再加入葡萄糖，加热煮沸，补足体积至500毫升，适当冷却后分装到三角瓶中，装液量为80 ml /250 ml 三角瓶，用棉塞塞好瓶口，121℃高压灭菌15min，冷却后备用；

水琼脂平板：在蒸馏水中加入1%的琼脂粉或者琼脂条，121℃高压灭菌15min，取出后冷却至55℃左右，在超净工作台中倒入直径为9厘米的无菌培养皿，制备成水琼脂平板备用；

固体培养基：麸皮：稻草粉质量配比为4：6；在本实施例中，取麸皮4kg，稻草粉6kg均匀搅拌，加水调整培养基水分含量为60-65%，121℃高压灭菌40min,间隔24小时后在同样条件重新灭菌一次，冷却后备用；

西瓜枯萎病菌（尖孢镰刀菌）选择性培养基：所用选择性培养基参照Komada H的方法，其具体配制方法为：将1.0 g K2HPO4、0.5 g MgSO4.7H2O、0.5 g KCl、0.01gFe-Na-EDTA、2.0g L-天门冬酰胺(L-asparagine)、20gD-半乳糖(D-galactose)溶于约300ml水中，定容至1000ml，加入20g琼脂装瓶灭菌。等培养基冷却至60℃以下，迅速加入1.0g五氯硝基苯(每1000ml培养基加入量，下同)、0.5g牛胆汁、1g Na2B4O7.10H2O、0.3g硫酸链霉素，再用10%磷酸将pH调至3.8-4.0，然后倒平板备用；

实施例中涉及的试剂、菌种：

棉隆：购买于南通施壮化工有限公司，剂型为98-100%的微粒剂；

西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.niveum FON）：由中科院微生物菌种保藏中心提供；

绿色木霉Tv41：由江苏省农业科学院自行筛选获得，该菌株于2014年6月 12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏号为CGMCC No. 9293。

实施例1 棉隆对西瓜枯萎病菌菌丝生长的抑制作用测试

将西瓜枯萎病菌接种到PDA平板中，28-30℃培养5天后用打孔器打孔获得直径5毫米的菌丝块备用。

在PDA 平板培养基中间接种直径为5 mm的菌丝块，往培养皿皿盖中央分别加入0、0.2、0.4、0.6、1、2、6、10mg/L的棉隆，与无菌水以质量比1:1快速混合，每处理3个重复，同时设立对照组（不加棉隆）；然后将接种了菌丝块的那一半培养皿倒扣在培养皿盖子上，用封口膜密封，28℃恒温培养，72h后培养结果如图1所示，测量病原菌的菌落直径，计算棉隆对菌丝生长的抑制率：

抑制率 (% ) = [ (对照菌落增长直径-处理菌落增长直径 ) / (对照菌落增长直径 ) ] × 100%。

图1中，A为没有棉隆的对照，B-F表示棉隆用量依次为0.01克，0.015克,0.02克,0.025克,0.03克；由图1可见，棉隆分解产物对枯萎病菌菌丝生长具有显著的抑制作用，且随着棉隆用量的增加，抑制作用增强，当棉隆用量为0.025-0.03克时，对菌丝生长的抑制作用达到95%以上。

实施例2 绿色木霉Tv41对西瓜枯萎病菌的生长抑制测试

试验方法：将绿色木霉Tv41孢子和西瓜枯萎病菌分别单独接种到PDA平板上，30℃恒温培养3天后，获得每个菌株的新鲜菌丝块（直径5毫米），再将绿色木霉与西瓜枯萎病菌菌丝块接种到同一个PDA平板中（每个平板接种1个绿色木霉菌丝块及1个西瓜枯萎病菌菌丝块），两个菌丝块之间相距5厘米，置于30℃恒温箱中培养观察，如图2所示，其中，A为单独接种的西瓜枯萎病菌；B为同时接种绿色木霉Tv41和西瓜枯萎病菌时西瓜枯萎病菌的生长情况，B培养皿中上部为西瓜枯萎病菌，下部为绿色木霉Tv41；由图2可见，绿色木霉Tv41对西瓜枯萎病菌有比较明显的生长抑制作用，绿色木霉主要是通过重寄生作用抑制或杀灭病原菌，即通过分泌多种复合抗菌物质或者能降解病原菌细胞壁的多种酶达到抑制靶标病原菌生长的效果。

实施例3 制备绿色木霉Tv41固体菌剂

a）菌种的活化

采用试管斜面保藏菌种的活化方法：

PDA斜面培养基：向试管中装入5mlPDA培养基，121℃高压灭菌15min，然后摆斜面，斜面高度不超过试管高度的1/3；

将绿色木霉Tv41孢子接种到上述PDA斜面培养基中活化，在28±2℃的环境中培养3-5天，形成菌丝块，以打孔器打孔5mm菌丝块备用。

b）液体培养

取一个容量为1L的三角瓶，加入250mlPDB培养基，然后加入三块直径5mm 的菌块，将三角瓶置于摇床，摇床的转速160r/min，于28±2℃的环境中培养3-4天后备用；

c）固体培养

将液体培养好的250ml绿色木霉Tv41培养物接入5kg固体培养基中，即接种量为1:20（ml/g），再将固体培养基平铺在浅盘中（浅盘经***溶液浸泡过夜晾干后使用），厚度5-7cm，上面盖上双层经高压灭菌处理的纱布，在28±2℃环境中培养6-8天，每隔2-3天翻拌一次，同时适当补加无菌水，培养至产孢；最后自然风干或30℃烘干至水分含量小于10%，即为绿色木霉Tv41固体菌剂，其中绿色木霉Tv41含量为10^10-11cfu/g菌剂。

以上所有接种操作必须在无菌条件下，即在超净工作台的酒精灯旁或经紫外线灭菌处理1-2小时的房间，固体培养的房间也需事先用紫外线灭菌处理3-5小时。

实施例4 大棚防控西瓜枯萎病实验

实验在淮安市西瓜连作大棚进行，该大棚连作西瓜多年，枯萎病发生严重。大棚面积为8米（宽）*40米（长）,栽种3行西瓜，实验分三组：

1.对照组：不做任何处理；2.棉隆对照组：棉隆熏蒸；3.实验组：棉隆熏蒸+木霉菌剂；每处理测1个小区，每组重复三次，每小区面积22平方米（宽2.2米，长10米）。

试验操作如下：在土壤温度高于15℃时，将大棚中前茬作物残体清除干净，每小区撒施20公斤商品有机肥和2公斤NPK复合肥(15-15-15),将土壤旋耕20-25厘米深，在每个小区中间划出1米（宽）*10米面积，棉隆对照组和实验组均匀撒施0.99公斤棉隆（对照组不撒施），再将土壤旋耕，迅速浇水至土壤20厘米耕层内水分含量为30-35%，覆盖厚度不低于0.4毫米的塑料薄膜，并且塑料薄膜边缘埋入深度不低于30厘米，覆膜保持15天后，将塑料薄膜从中间剪开后揭开晾置土壤3-4天，每个小区按照S型取土方法采集土样，采用选择性培养基对进行西瓜枯萎病菌计数；对照组均匀撒入实施例3获得的绿色木霉Tv41固体菌剂，施入量为45-50g/m²（对照组和棉隆对照组不施入），然后每个小区移栽西瓜苗30棵，在西瓜收获时调查西瓜发病率和产量，结果如表1、表2所示：

表1 大棚条件下不同处理土壤中尖孢镰刀菌的数量

	对照组	棉隆对照组	实验组
				试验开始前数量（CFU/克土壤）	100000	100000	100000
熏蒸结束时数量(CFU/克土壤）	60000-90000	500-800	500-800

由表1可见，土壤处理15天后，棉隆对照组和实验组中病原菌数量在500-900个CFU/克土壤，而对照组土壤中病原菌数量为80000—90000CFU/克土壤，表明在大田条件下，棉隆可以几乎100%杀灭土壤中病原菌。

表2 大棚条件下不同处理的西瓜枯萎病发病率和西瓜产量

	对照组	棉隆对照组	实验组
				发病率（%）	80	53.3	10
西瓜产量（kg）	12	38	82

由表2可见，西瓜收获时，对照中发病率为80%，而棉隆熏蒸处理中发病率为53.5%，比对照降低26.7%，而棉隆熏蒸后再施用木霉菌剂的处理，发病率显著低于对照和单独棉隆熏蒸处理，仅为10%；另外，在西瓜产量上，三个处理也有显著差别，熏蒸后再施用木霉的处理产量是对照的近7倍，是单独棉隆熏蒸处理的2倍多，可见，棉隆熏蒸后配施木霉菌剂可以显著减少发病率，增加西瓜产量。

Claims

1.一种高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，具体步骤如下：

（a）清除前茬作物残体，土壤旋耕20-25cm，施入有机肥和化肥，土壤温度在15℃以上时，然后以西瓜栽植行为中心，幅宽110cm，45-50g/m²的施入量均匀撒施棉隆，再将土壤旋耕20-25cm，调整土壤含水率为20-30%；

所述木霉固体菌剂中木霉菌的含量不低于1x10⁹cfu/g。

2.根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述的棉隆为50%可湿性粉剂或98-100%微粒剂。

3.根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述的塑料薄膜厚度不低于0.4mm。

4.根据权利要求1所述高效防控西瓜枯萎病的方法，其特征在于，所述木霉固体菌剂是这样获得的：将木霉孢子接种到PDA培养基中活化，28±2℃培养3-5d；然后将活化后的菌种接种至PDB培养基中，28±2℃，160r/min摇床培养3-4d；再将菌种接种至固体培养基中，28±2℃培养6-8d，最后自然风干或30℃烘干至水分小于10%，即获得木霉固体菌剂，其中木霉菌含量为10^10-11cfu/g；

所述固体培养基是由麸皮和稻草粉按质量比为4：6混合后，调整水分含量为60-65%获得。

5.一种用于权利要求1-4任一所述高效防控西瓜枯萎病方法的木霉菌，其特征在于，所述木霉菌为保藏号为CGMCC No.9293的绿色木霉（Trichoderma viride）。