CN102851230A - 一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用谷壳浸膏的制备方法和应用 - Google Patents
一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用谷壳浸膏的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO：M 2012004。本发明提供利用微生物食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏以及烟用谷壳浸膏在烟草中的应用。本发明的优点：发酵纯化后烟用谷壳浸膏用于卷烟中协调烟气、减少杂气、降低刺激、明显增加特征香气、丰富烟香，改善卷烟吸味；方法工艺过程简单，反应条件温和，环境污染小，产物浓度较高，提取步骤简单，生产清洁，产品环境友好，安全可靠，主要原料来源广泛，成本极为低廉，具有天然性和工业化生产前景。
Description
技术领域
本发明涉及烟用香料技术领域，具体是指一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用谷壳浸膏的制备方法和应用。
背景技术
在烟草制品中，烟草的香气和吸味至关重要，添加香料是卷烟工艺中的关键环节，也是完善产品风格和提高卷烟香气质量的有效手段。烟用香料有化学合成香料和天然香料之分。近年来，天然植物香料，因其具有中国特色，天然无害，原料易得等原因，成分研发重点和热点。植物提取香料的开发由于可用植物资源的有限而存在局限性，将微生物发酵工程应用于香精香料的生物合成中，以工农业废料为原料，利用微生物可以生产各种天然香料，是一种很好的解决途径。
谷壳是大米外面的一层壳，常作为植物废料，价格低廉。中国是世界上最大的水稻种植国家，据农业部的统计，2005年中国稻谷产量18059万吨，稻壳通常占稻谷的20％，照此计算，稻壳3600多万吨，稻壳资源十分丰富。然而，稻壳表面坚硬，硅含量高，不易被细菌分解，且堆积密度小，废弃破坏环境，成为米业企业的包袱，稻壳的开发利用意义重大。谷壳的主要组成是纤维素类、木质素类和硅类，脂肪、蛋白的含量较低，含有较高含量的阿魏酸，可作为生物转化生产香兰素的前体物质。直接提取谷壳制成的浸膏，若用于卷烟加香，与烟气不协调，刺激性大，使喉咙干涩，杂气多，无法烟用。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用 及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以谷壳为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足。烟用浸膏中烟碱的含量比较高，这对发展低烟碱含量、高安全性卷烟是不利的。另一方烟用浸膏的质量有待提高，在生产过程中的得率也不容易控制。如CN91106654.3公开一种烟草浸膏的生产方法，CN200710032351公开一种烟草浸膏的制备方法，这两种方法获得烟草浸膏均不能彻底解决上述缺陷。CN101624555A公开一种烟用浸膏的制备方法虽然提高生产得率，副产物较多，且与烟气不协调、刺激性大、使喉咙干涩。
发明内容
针对目前化学合成烟用浸膏提取步骤复杂，环境污染严重，烟用浸膏的香气味道单一且香气强度尚显不足的缺陷，本发明提供了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2012004，其生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10%NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-***糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillus methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100%。
本发明提供一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法，包括以下步骤：
1）将谷壳和水按质量比1∶20~40回流提取1~3h后过滤，将滤液灭菌；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25~35℃、pH 5~10条件下，静置培养24~72h后置于冰箱中；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25~35℃，转速100~150rpm条件下振荡培养12~36h，连续转接1~4次后制得种子培养液；
4）发酵：将种子培养液按体积比5~20%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为20~40%，在pH 4~10，温度25~40℃，转速100~200rpm，不避光条件下发酵7~14天，得到发酵液；
5）将发酵液和95%乙醇按体积比1∶3~4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20~1.36的烟用谷壳浸膏。
优选地，所述斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
优选地，所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
本发明提供一种所得烟用谷壳浸膏的应用，其特征在于：所述烟用谷壳浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、减少杂气、降低刺激、明显增加特征香气、丰富烟香，改善卷烟吸味，加入卷烟中烟用谷壳浸膏的质量比为0.05~0.1%。
采用GC/MS对利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏与未利用食甲醇芽孢杆菌经历相同发酵步骤的谷壳提取液相同条件下浓缩制成的浸膏（以下简称谷壳提取物浸膏）进行挥发性致香成分进行对比。
（1）同时蒸馏萃取
将5g烟用谷壳浸膏装入圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液 中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。谷壳提取物浸膏同样进行同时蒸馏萃取，萃取浓缩液用于进行GC/MS分析。
（2）GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比20∶1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃（1min）以5℃/min升到250℃（5min）；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50~650amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
（3）挥发性成分对比分析
通过GC/MS对本发明的烟用谷壳浸膏进行香气成分分析，从表1中可以看出，一共鉴定出20种香气成分，其中酯类4种，酸类2种，醇类2种，以及烷烃、醛类、香兰素、咖啡因等10种香气物质，对比谷壳提取物浸膏，新增加了10种香气物质，其中香兰素（相对百分含量0.569%）具有浓郁的奶香气息，是用于烟草的高级香料；咖啡因（6.456%）具有持久不散的苦味，具有兴奋作用；异丁酸苯乙酯（0.024%）具有青香、水果及玫瑰式香气；乙缩醛二乙醇（0.195%）呈愉快的坚果香气；棕榈酸乙酯（0.095%）呈微弱蜡香、果爵和奶油香气，天然品存在于杏、酸樱桃、葡萄柚汁、黑加仑、菠萝、红葡萄酒、苹果白兰地、黑面包、羊肉、大米等中。这些新增加的香气物质具有特征香气、能丰富烟香。相对百分含量大幅增加的香气物质有2种，棕榈酸相对百分含量增加到12.368%，它是天然脂肪酸，具有特殊香气和滋味；亚油酸相对百分含量1.83%，是人体必须脂肪酸，能降低血液胆固醇、软化血管、降低血压、促进微循环，可预防或减少心血管病的发病率，也可提高和改善烟香味。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以谷壳为原料发生分解、降解、氧 化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。
表1.烟用谷壳浸膏与谷壳提取物浸膏的挥发性香气成分对比
注：丙酸苯乙酯为内标，根据其在谷壳提取物浸膏与烟用谷壳浸膏香气成分中的相对百分含量比值为16.315∶10.8=1.51∶1，来比较两者香气物质相对百分含量的变化。
本发明的优点是：
1、本发明以植物废料谷壳为唯一碳源、氮源、以及底物，含有生长因子，比单一碳源更容易让微生物酶体系利用来发酵产香，来源广泛，成本极为低廉，具有天然性、工业化生产前景及变废为宝的社会效益。
2、本发明谷壳经微生物菌株食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusVJ4-1 CCTCC NO：M 2012004发酵能生产天然烟用谷壳香料，方法工艺过程简单，原料成本低廉，有工业化使用前景；所得天然烟用谷壳浸膏能直接用于卷烟的加香，具有协调烟气、减少杂气、降低刺激、明显增加特征香气、丰富烟香，改善卷烟吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用。
具体实施方式
下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法如下：
1）将谷壳和水按质量比1∶20回流提取3h后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1 CCTCCNO：M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25℃、pH 10条件下，静置培养24h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25℃，转速150rpm条件下振荡培养12h，连续转接4次后制 得种子培养液；
种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4）发酵：将种子培养液按体积比5%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为40%，在pH 4，温度40℃，转速100rpm，不避光条件下发酵14天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20的烟用谷壳浸膏。
实施例2
本发明本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusVJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法如下：
1）将谷壳和水按质量比1∶30回流提取2h后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCCNO：M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH 7条件下，静置培养36h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在30℃，转速120rpm条件下振荡培养24h，连续转接3次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4）发酵：将种子培养液按体积比10%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为30%，在pH 8，温度30℃，转速150rpm，不避光条件下发酵10天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.36的烟用谷壳浸膏。
实施例3
本发明利用微生物食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCC NO：M 2012004生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法如下：
1）将谷壳和水按质量比1∶40回流提取1h后过滤，将滤液在115℃高温灭菌25分钟；
2）斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus VJ4-1CCTCCNO：M 2012004接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在35℃、pH 5条件下，静置培养72h后置于冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3）制备种子培养液：用上述步骤2）中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在35℃，转速100rpm条件下振荡培养36h，连续转接2次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L
4）发酵：将种子培养液按体积比20%接种到上述步骤1）中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为为40%，在pH10，温度25℃，转速200rpm，不避光条件下发酵7天；
5）将步骤4）中所得的发酵液和95%乙醇按体积比1∶3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.32的烟用谷壳浸膏。
实施例4
发明人将上述烟用谷壳浸膏按烟丝量0.5%、0.1%、0.05%的比例、谷壳提取物浸膏按烟丝量比例0.05%分别添加到烟丝中进行评吸，评吸按照国标GB 5606.4-1996进行。评吸结果如下表2所示。经专家评吸小组反复评吸，认为：本烟用谷壳浸膏，添加量为烟丝量0.05%、0.1%时，具有与烟气协调，丰富香气、提升香气质量的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用，改善了谷壳提取物浸膏添加到卷烟中，不协调、刺激大、杂气重、无法烟用的缺点。
表2.烟用谷壳浸膏在卷烟加料中的应用
Claims (5)
1.一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，保藏编号CCTCC NO：M 2012004，食甲醇芽孢杆菌Bacillus methylotrophicusCCTCC NO：M 2012004的生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10％NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-***糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillus methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100％。
2.一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将谷壳和水按质量比1∶20～40回流提取1～3h后过滤，将滤液灭菌；
2)斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH 5～10条件下，静置培养24～72h；
3)制备种子培养液：用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm条件下振荡培养12～36h，连续转接1～4次后制得种子培养液；
4)发酵：将种子培养液按体积比5～20％接种到上述步骤1)中的灭菌的滤液，接种后的滤液的装罐量为20～40％，在pH 4～10，温度25～40℃，转速100～200rpm，不避光条件下发酵7～14天，得到发酵液；
5)将发酵液和95％乙醇按体积比1∶3～4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20～1.36的烟用谷壳浸膏。
3.根据权利要求2所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法，其特征在于，所述斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
4.根据权利要求2所述的一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用谷壳浸膏的制备方法，其特征在于，所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
5.一种根据权利要求2所得烟用谷壳浸膏的应用，其特征在于：所述烟用谷壳浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、减少杂气、降低刺激、明显增加特征香气、丰富烟香，改善卷烟吸味，加入卷烟中烟用谷壳浸膏的质量比为0.05～0.1％。
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