CN103224894B - 桑肠杆菌及其生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的方法和应用 - Google Patents
桑肠杆菌及其生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了桑肠杆菌及其生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的方法和应用，属于生物技术领域及烟用香料技术领域。本发明提供了一株桑肠杆菌（Enterobacter mori）VL4-3CCTCC NO：M2012020。所述的一株桑肠杆菌进行生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法：（1）回流提取；（2）斜面培养；（3）制备种子培养液；（4）发酵；（5）制备浸膏。所述的一株桑肠杆菌进行生物转化制备得到的发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟中的应用。本方法工艺过程简单，环保无害，无污染，原料成本低廉，产物天然，有工业化前景。所得发酵型麸皮烟用浸膏能直接用于卷烟加香，与烟气协调、醇厚甘甜香气、使烟气柔和、丰富香气、改善吸味。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域及烟用香料技术领域，具体涉及一株从香荚兰植株中筛选到的桑肠杆菌，用该桑肠杆菌进行生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法，以及该方法制得的发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟中的应用。
背景技术
现有技术中，烟用香精香料是卷烟生产不可缺少的辅料，也是卷烟产品风格完善、低焦低害香味补偿的有效手段。目前，我国烟用香料主要是直接从烟草或其它植物中提取的天然香料或化学合成香料，天然香料受到植物资源有限性的限制，化工合成香料存在香气单一，制备成本太高的缺陷，而且，有些香料尚不能用人工合成得到。
麸皮为小麦最外层的表皮，是小麦加工面粉后得到的副产品，主要用作饲料，经济价值不高。小麦麸皮含有大量人体必需的营养成分，如相当丰富的维生素E和B族维生素，维生素E与动物的生殖功能有关，是防止不育症和人体细胞衰老的营养素，还可以抗癌。维生系E有不溶于水、溶于脂肪和脂溶剂、耐热、在无氧时加热到200℃不受影响的特点；麸皮中含有15％左右的蛋白质的有机氮源；含有硫胺素、核黄素、尼克酸等微生物生长必需的生长素；富含纤维素和半纤维素；此外，还含有a-淀粉酶、β-淀粉酶、氧化酶、过氧化酶等，这些都是微生物所必需的。据现代科研测定，其对氨基苯甲酸含量是植物中最高的，对氨基苯甲酸是机体细胞生长和***所必需的物质叶酸的组成部分之一，并有回复皮毛颜色作用。实际上麸皮作为中药的一味，具有润肺、滋润皮肤，防癌抗癌，健脾和胃，乌发固发，清理肠胃等作用。但直接从麸皮中提取制得浸膏无法用于卷烟加香，因其与烟气不协调，杂气重，刺激性大，对卷烟吸味有较大的负面影响。
微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，可使原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。但现有技术中用微生物发酵方法生产烟用香料的得率低且不容易控制。现有技术未见用麸皮制得的烟用浸膏用于卷烟的报道。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种桑肠杆菌及其生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的方法和应用，从香荚兰植株中筛选到的一株桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3CCTCC NO：M2012020，用其生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏并将制备的发酵型烟用麸皮浸膏应用于卷烟中，具有与烟气协调、增加醇厚甘甜香气、使烟气柔和、丰富香气、刺激小、杂气少、改善烟草吸味的优点。
本发明提供了一株桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3，于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012020，所述桑肠杆菌的菌株VL4-3的16SrRNA序列，其序列全长1414bp，与桑肠杆菌的相似度达到99.608％。
如上所述的一株桑肠杆菌进行生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法依以下步骤进行：
(1)回流提取：将干燥的麸皮和水按质量比1：8～50混合，回流提取1～3小时后过滤，取麸皮滤液，在115℃下灭菌25分钟；
(2)斜面培养：将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72小时后得到斜面培养物，置于4℃冰箱中；
(3)制备种子培养液：用步骤(2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm/min条件下振荡培养12～36h，连续转接1～4次后制得种子培养液；
(4)发酵：将步骤(3)中所得的种子培养液按体积比2～20％接种到上述步骤(1)中的麸皮滤液中形成发酵液，所述发酵液的装罐量为罐体积的10～40％，在pH6～10，温度25～35℃，转速100～200rpm/min，不避光条件下发酵24～72小时；
(5)制备浸膏：将步骤(4)中所得的发酵液和重量百分比为95％乙醇按体积比1：3～4混合，沉淀过夜后抽滤，将抽滤液减压浓缩除去溶剂，所得黄褐色浸膏即为发酵型烟用麸皮浸膏；所述发酵型烟用麸皮浸膏的密度为1.2100～1.3500之间。
所述的麸皮为小麦麸皮。所述的斜面培养基中：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。所述的种子培养基中：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
如上所述的一株桑肠杆菌进行生物转化制备得到的发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟中的应用：在卷烟加香工序中，按烟丝总重0.05％～0.1％的比例加入发酵型烟用麸皮浸膏。
本发明的优点是：本发明采用桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020，所述桑肠杆菌以小麦麸皮为天然、唯一碳源、氮源、生物转化底物，经发酵能生产天然烟用的发酵型麸皮烟用浸膏，方法工艺过程简单，环保无害，对环境无污染，原料成本极为低廉，产物天然，有工业化应用前景；所得发酵型麸皮烟用浸膏能直接用于卷烟的加香，具有与烟气协调、增加醇厚甘甜香气、使烟气柔和、丰富香气、刺激小、杂气少、改善烟草吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用，克服了直接使用麸皮提取物浸膏与烟气不协调，杂气重，刺激性大，无法烟用的致命缺陷。
生物材料保藏信息
一株桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012020。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式及相关技术问题作进一步详细的描述。本发明的桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3CCTCC NO：M2012020是从香荚兰植株中筛选到，已于2012年2月16日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心。其生物学特征是：菌株为直杆状，为革兰氏阴性菌，兼性好氧，具有ONPGβ-半乳糖苷酶、LDC赖氨酸脱羧酶、ADH精氨酸双水解酶、ODC鸟氨酸脱羧酶的酶活性；色氨酸脱氨酶、尿酶反应、H2S产生、明胶液化、吲哚产生呈阴性；能利用柠檬酸、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、***糖，产酸和气，生成酸甜香气物质。能以多种氨基酸、大部分单糖、多糖、酯类和氨基酸为唯一碳源生长；在以环糊精、衣康酸、α-酮戊酸、奎尼酸、阿东糖醇、i-赤藻糖醇、L-墨角藻糖、琥珀酰胺酸、乳果糖、羟基-L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-焦谷氨酸、D,L-肉碱、γ-氨基丁酸、D-乳糖酸内酯、α-酮戊二酸、癸二酸、γ-羟基丁酸、苯乙胺、丁二胺、2-氨基乙醇、2,3-丁二醇为唯一碳源的培养基上不能生长。
本桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3的分子鉴定特征为：以待测菌株的染色体DNA为模板，通过合成引物进行。16S rRNA基因PCR扩增。上游引物：5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；下游引物：5’-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3’(上海英骏生物公司提供)。经回收测序、校正后得到菌株L4-3的16S rRNA序列，其序列全长1414bp。与桑肠杆菌(Enterobacter mori)的相似度达到99.608％。
本发明的桑肠杆菌生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法中采用的桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020，没有人采用过这一菌株进行发酵生产烟用香料，也没有人采用麸皮作为天然、唯一的碳源、氮源、生物转化底物来发酵，转化生产发酵型烟用麸皮浸膏。
本发明还将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020进行生物转化制备得到的发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟中应用，发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟加香工序中，按烟丝总重0.05％～0.1％的比例加入。
本申请人采用GC/MS对本发明“发酵型烟用麸皮浸膏”进行了挥发性致香成分的测定，并以(未利用桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020发酵的)普通“麸皮提取物浸膏”作为对比样，进行同样的测定和对比，简述如下。
(1)同时蒸馏萃取
将本发明的发酵型烟用麸皮浸膏和麸皮提取物浸膏各取5g分别装入蒸馏萃取装置的一个圆底烧瓶中，加入400mL水，用电热套加热至沸腾，在另一侧的圆底烧瓶中加入200mL的二氯甲烷，60℃水浴沸腾，待中间分液管处液面出现分层后计时萃取2h。萃取结束后，向二氯甲烷萃取液中加入无水硫酸钠，过夜，过滤并浓缩至1mL，浓缩液用于进行GC/MS分析。
(2)GC/MS分析：HP-5MS(50m×0.25mm×0.25μm)毛细管柱；进样温度：250℃；分流比20:1；载气：He，1mL/min；升温程序：从50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；传输线温度：250℃；离子源：EI源；电子能量：70eV；扫描范围：50～550amu；使用WILEY和MINILAB谱库进行检索。
(3)挥发性成分对比分析
GC/MS对本发明的发酵型烟用麸皮浸膏和麸皮提取物浸膏进行香气成分分析的结果见表1，从表1中可以看出，本发明的发酵型烟用麸皮浸膏一共鉴定出40种香气成分，其中酮类5种，酸类6种，醇类5种，醛类3种，以及烷烃、烯类、酚类、酯类、吡喃、吡啶、吡唑、硫氰酸盐、对乙烯基愈创木酚等21种香气物质。
对比麸皮提取物浸膏，本发明的发酵型烟用麸皮浸膏发酵后新增加了27种香气物质，消失了9种香气物质。消失的9种挥发性香气物质主要为烷烃类、苯酚类和邻苯二甲酸酯类，属于不利烟气的成分。增加的27种香气物质中：丙酮醛具有刺激性辛辣气味和焦糖样甜味；2,3-丁二酮具有甜的、奶油、黄油香气，在酒类、奶制品有天然存在；乙酸是重要的有机酸，呈刺激性特殊香气；3-羟基-2丁酮，相对百分含量40.935％，为发酵型烟用麸皮浸膏的重要香气成分，大量稀释后呈奶油香气；1,1-2乙氧基乙烷，呈愉快的坚果和新鲜青水果香气，天然品存在于米酒、威士忌、朗姆酒等中，或浆果、蔬菜和乳制品等中；异丁酸具有强烈的似哈败奶油气味和干酪味；丁酸具有呈强烈的奶油和干酪香气及奶油脂肪酸败气味；2,3-丁二醇具有香气微弱的水果香，天然存在于糖蜜发酵的产物中；糠醛具有焦香味；3-甲基-2-丁烯，1％或更高浓度的乙醇溶液，具有浆果、红莓、葡萄、覆盆子、欧黑莓和樱桃样果香香气，有尖刺的酸气，并带有发酵蜜糖样香调，存在于黑加仑、可可、坚果等中，属于天然等同香料；对乙烯基愈创木酚呈强烈香辛料、丁香和发酵似香气，有炒花生气息。
相对百分含量有变化的香气物质中：苯乙醇具有特殊玫瑰香气，丁酸-2-甲基-2-苯乙酯具有青香、花香、甜的果香和蜡样香气。上述的发酵型烟用麸皮浸膏所有这些香气糅合在一起赋予烟气协调、醇厚甘甜香气、使烟气柔和、丰富香气、改善烟草吸味。
本发明的发酵型烟用麸皮浸膏能成功改善卷烟吸味，是由于微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以麸皮为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、吡啶类和萜烯类等，这些香气物质很好地丰富和改善了卷烟的质量和吸昧品质。
表1、发酵型烟用麸皮浸膏与麸皮提取物浸膏挥发性香气成分对比
备注：丙酸苯乙酯为内标，设定其在麸皮提取物浸膏与发酵型烟用麸皮浸膏中的相对百分含量比值为6.833:5.928＝1.153:1，以此值来比较两者香气物质变化及其相对百分含量的变化。
下面列举实施例。有必要在此指出，以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
本发明利用微生物桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3CCTCC NO：M2012020生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的制备方法如下：
1)将麸皮和水按质量比1:8回流提取3小时后过滤，取滤液，115℃灭菌25分钟；
2)斜面培养：将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25℃、pH9条件下，静置培养24小时后置于4℃冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3)制备种子培养液：用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25℃，转速150rpm/min条件下振荡培养12h，连续转接4次后制得种子培养液；
种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4)发酵：将步骤3)中所得的种子培养液按体积比5％接种到上述步骤1)中的麸皮滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为40％，在pH6，温度35℃，转速100rpm/min，不避光条件下发酵48小时；
5)将步骤4)中所得的发酵液和95％乙醇按体积比1：4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得褐色浸膏为发酵型烟用麸皮浸膏，密度为1.2450。
实施例2
本发明本发明利用微生物桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3CCTCC NO：M2012020生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的制备方法如下：
1)将麸皮和水按质量比1:30回流提取2小时后过滤，取滤液，115℃灭菌25分钟；
2)斜面培养：将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在30℃、pH7条件下，静置培养36小时后置于4℃冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3)制备种子培养液：用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在30℃，转速120rpm/min条件下振荡培养24h，连续转接3次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L；
4)发酵：将上步骤3)中所得的种子培养液按体积比10％接种到上述步骤1)中的麸皮滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为30％，在pH8，温度30℃，转速150rpm/min，不避光条件下发酵36小时；
5)将步骤4)中所得的发酵液和95％乙醇按体积比1：3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得褐色浸膏为发酵型烟用麸皮浸膏，密度为1.2710。
实施例3
本发明利用微生物桑肠杆菌(Enterobacter mori)VL4-3CCTCC NO：M2012020生物转化发酵型烟用麸皮浸膏的制备方法如下：
1)将麸皮和水按质量比1:50回流提取1小时后过滤，取滤液，115℃灭菌25分钟；
2)斜面培养：将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在35℃、pH5条件下，静置培养72小时后置于4℃冰箱中；
斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L；
3)制备种子培养液：用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在35℃，转速100rpm/min条件下振荡培养36h，连续转接2次后制得种子培养液；
所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L
4)发酵：将步骤3)中所得的种子培养液按体积比20％接种到上述步骤1)中的麸皮滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为40％，在pH10，温度25℃，转速200rpm/min，不避光条件下发酵24小时；
5)将步骤4)中所得的发酵液和95％乙醇按体积比1：3，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得褐色浸膏为发酵型烟用麸皮浸膏，密度为1.3123。
实施例4
发明人将上述发酵型烟用麸皮浸膏按烟丝量0.05％、0.1％、0.5％的比例、麸皮提取物浸膏按烟丝量比例0.05％，分别添加到烟丝中进行评吸，评吸按照国标GB5606.4-1996进行。评吸结果如下表2所示。经专家评吸小组反复评吸，认为：本烟用麸皮浸膏，按烟丝量0.05％、0.1％的比例添加到烟丝中时，具有与烟气协调、增加醇厚甘甜香气、使烟气柔和、丰富香气、刺激小、杂气少、改善烟草吸味的优点，能与其它烟用香精香料混合调配使用，改善了麸皮提取物浸膏添加到烟丝中，与烟气不协调、杂气重、刺激性大，无法烟用的致命缺陷。
表2.发酵型烟用麸皮浸膏和麸皮提取物浸膏在卷烟加香评吸对比
Claims (5)
1.一株桑肠杆菌生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法，其特征在于所述方法依以下步骤进行：
(1)回流提取：将干燥的麸皮和水按质量比1：8～50混合，回流提取1～3小时后过滤，取麸皮滤液，在115℃下灭菌25分钟；
(2)斜面培养：将桑肠杆菌CCTCC NO：M2012020接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～9条件下，静置培养24～72小时后得到斜面培养物，置于4℃冰箱中；
(3)制备种子培养液：用步骤(2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm/min条件下振荡培养12～36h，连续转接1～4次后制得种子培养液；
(4)发酵：将步骤(3)中所得的种子培养液按体积比2～20％接种到步骤(1)中的麸皮滤液中形成发酵液，所述发酵液的装罐量为罐体积的10～40％，在pH6～10，温度25～35℃，转速100～200rpm/min，不避光条件下发酵24～72小时；
(5)制备浸膏：将步骤(4)中所得的发酵液和重量百分比为95％乙醇按体积比1：3～4，沉淀过夜后抽滤，将抽滤液减压浓缩除去溶剂，所得黄褐色浸膏即为发酵型烟用麸皮浸膏，所述发酵型烟用麸皮浸膏的密度为1.2100～1.3500之间。
2.如权利要求1所述的一株桑肠杆菌生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法，其特征在于：所述的麸皮为小麦麸皮。
3.如权利要求1所述的一株桑肠杆菌生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法，其特征在于所述的斜面培养基中：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。
4.如权利要求1所述的一株桑肠杆菌生物转化制备发酵型烟用麸皮浸膏的方法，其特征在于所述的种子培养基中：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
5.如权利要求1所述的一株桑肠杆菌生物转化制备得到的发酵型烟用麸皮浸膏在卷烟中的应用，其特征在于：在卷烟加香工序中，按烟丝总重0.05％～0.1％的比例加入发酵型烟用麸皮浸膏。
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