CN102845300A

CN102845300A - 甜瓜抗蔓枯病聚合基因的鉴定

Info

Publication number: CN102845300A
Application number: CN2012102545615A
Authority: CN
Inventors: 陈劲枫; 徐兵划; 钱春桃; 娄群峰; 王红英
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2013-01-02

Abstract

本发明的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合方法及其鉴定专用于甜瓜抗蔓枯病聚合抗源筛选以及抗蔓枯病标记辅助聚合育种研究。两个抗蔓枯病材料PI420145和PI482398杂交、后代连续自交得到抗蔓枯病基因稳定遗传的F₄，F₄聚合了PI420145和PI482398的抗蔓枯病基因，且聚合后抗源的聚合抗源的抗性增强，抗性高于亲本。PI420145和PI482398杂交及自交后代F₄聚合双亲的蔓枯病抗性基因，该抗源的蔓枯病抗性基因与AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60连锁，同时SSR标记CMAT170a连锁。通过本发明提供的甜瓜蔓枯病抗性基因聚合及其鉴定方法，获得聚合基因材料，其抗性高于单一抗源，大大提高抗蔓枯病甜瓜的选择效率，在甜瓜抗蔓枯病育种中，该聚合抗源可做为供体亲本，能够加速甜瓜抗蔓枯病育种进程。

Description

甜瓜抗蔓枯病聚合基因的鉴定

一、技术领域

本发明公开了甜瓜抗蔓枯病聚合基因鉴定的方法，专用于甜瓜抗蔓枯病聚合育种及分子标记辅助选择，有利于开展甜瓜蔓枯病抗病品种的选育与种质资源的创制，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

在甜瓜抗蔓枯病研究领域，国际上发现含有不同抗性基因的5份抗源材料PI140471、PI157082、PI511890、PI482398和PI482399，其抗性基因分别命名为Gsb-1、Gsb-2、Gsb-3、Gsb-4和Gsb-5。PI420145是最新筛选出的蔓枯病抗源，通过遗传分析，该抗源的抗性基因也为单显性。这6份抗源的蔓枯病抗性均由单个基因控制，但是随着栽培环境的和病原物致病性的改变，携带单个抗蔓枯病基因的抗源已不能提供足够的、稳定的抗病性。多个抗性基因聚合后，并不简单的表现为单个抗病基因的抗谱之间的简单累加，而是抗性基因之间表现为基因互作，这样能够扩大抗谱，增加抗源的抗性。因此，在进行甜瓜蔓枯病抗性育种时将多个抗蔓枯病基因同时导入改良亲本，是获得持久、高抗蔓枯病甜瓜品种的重要途径之一。

可通过两份抗蔓枯病材料常规杂交将抗性基因聚合到一份抗源中、连续自交多代稳定抗性，实现抗蔓枯病基因的聚合。在聚合的过程中，运用表型结合分子标记技术辅助选择，分子标记辅助选择通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记鉴别目标基因是否存在，不受基因表达、环境条件及植株生长发育阶段的影响，也不受杂交方式的影响，在植株的苗期或低世代就可进行筛选，可以缩短选择年限，提高育种效率。

三、发明内容

技术问题

本发明甜瓜蔓枯病抗性基因聚合鉴定，目的是针对单一抗源抗性基因抗性不足，不持久等缺点，发掘出甜瓜蔓枯病聚合抗病基因资源，为甜瓜的蔓枯病抗病育种提供基因资源和标记辅助选择的技术，从而大大提高选择效率。将不同的抗性基因聚合在同一品种中可以提高抗性，拓宽抗谱，达到持久抗性的目的，加快培育优良抗蔓枯病甜瓜品系的进程。

技术方案

以抗蔓枯病材料PI 420145作为母本，与另一抗蔓枯病材料PI482398进行杂交，得到F₁，F₁自交，每代经蔓枯病菌抗性鉴定选出抗蔓枯病植株连续自交三代得到F₄，F₄经人工接种抗性鉴定，筛选抗蔓枯病遗传稳定的植株。

对F₄抗蔓枯病甜瓜植株进行抗性基因鉴定。用3个AFLP分子标记对抗病材料PI420145、感病材料白皮脆以及40份F₄材料进行PCR扩增，结果表明，PI420145和40份F₄材料中在200、90、60bp处均扩增出一条特异条带，与这3个引物在抗病材料PI420145上扩增的特异的条带完全完全一致，表明F₄含有PI420145的抗蔓枯病基因，感病对照白皮脆未检测出该特异条带。用SSR标记CMAT170a对抗病材料PI482398、感病材料白皮脆以及40份F₄材料进行PCR扩增，PI482398和40份F₄材料在120bp处均扩增出一条特异条带，与该引物在抗病材料PI482398上扩增的特异条带一致，表明F₄含有抗蔓枯病基因Gsb-4，感病对照白皮脆未检测出这些条带。则这40份F₄材料聚合了PI420145和PI482398抗蔓枯病基因。

有益效果

本发明所提供的甜瓜抗蔓枯病基因聚合方法及其鉴定具有以下优点：

1)本发明通过2个甜瓜抗蔓枯病材料PI420145和PI 482398杂交和连续自交三代，得到F₄，获得甜瓜2个抗蔓枯病基因聚合的材料，其抗性稳定，且抗性大于单一抗源。

2)本发明创制的甜瓜抗蔓枯病基因聚合材料F₄，可作为抗性亲本进行抗病育种，通过与性状优良的商品种杂交、回交，获得抗蔓枯病的优异甜瓜品种。对甜瓜抗蔓枯病育种及种质创新具有重要意义。

四、附图说明

图1：SSR引物CMAT170a在抗源PI482398、白皮脆和聚合抗源后代F4上扩增的结果：表明聚合抗源后代F4中含有抗源PI482398的抗蔓枯病基因。

其中，M：Marker，1：抗蔓枯病单株PI482398，2：感蔓枯病单株白皮脆，3：聚合抗源PI420145×PI482398。箭头示为出现的特异带。

图2：AFLP引物EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60在抗源PI420145、白皮脆和聚合抗源后代F₄上的扩增结果：表明后代F₄中含有抗源PI420145的抗蔓枯病基因。

其中，1：抗蔓枯病单株PI420145；2：感蔓枯病单株白皮脆；3：聚合抗源PI420145×PI482398。

箭头示为出现的特异带。

五、具体实施方式

本发明甜瓜抗蔓枯病基因聚合及分子标记鉴定的实施程序包括：

(1)将抗源PI420145(♀)和抗源PI482398(♂)进行杂交，对杂交后代F₁进行田间接种鉴定，筛选抗性植株自交，对自交后代进行蔓枯病菌接种鉴定，筛选出抗病植株，连续自交3代，得到抗蔓枯病后代F₄，对F₄接种鉴定筛选抗性植株，取幼嫩叶片，用CTAB法提取DNA，进而用AFLP和SSR标记鉴定蔓枯病抗性基因。

(2)抗蔓枯病菌鉴定：抗源PI420145、PI482398、感病材料白皮脆和后代F₄人工接种鉴定，其发病率和病情指数如下表1：

表1抗蔓枯病接种鉴定

从发病率和病情指数可以看出，后代F₄抗性大于单一抗源PI420145、PI482398。

(3)利用AFLP标记与SSR标记相结合。用AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60在F₄和抗源PI420145均扩增200、90、60bp的特异条带，则F₄材料含有与PI420145相同的抗蔓枯病基因；用SSR标记CMAT170a在F₄和抗源PI483398中扩增出120bp的特异条带，则F₄材料含有PI482398的抗蔓枯病基因Gsb-4。所以F₄聚合了PI420145和PI482398两份抗源的抗蔓枯病基因。

具体技术过程如下：

(1)杂交及自交过程

将抗源PI420145(♀)和抗源PI482398(♂)进行杂交，对杂交后代F₁进行田间接种鉴定，筛选抗性植株自交，对自交后代进行蔓枯病鉴定，筛选抗病植株，连续自交3代，得到抗蔓枯病后代F₄，对F₄接种鉴定筛选抗性植株。

(2)DNA提取与标记辅助筛选

①基因组DNA的提取：基因组DNA提取采用CTAB法。利用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭显色进行DNA浓度的定量。F₄单株DNA提取后，用于AFLP引物和SSR引物的多态性筛选。

②AFLP引物多态性筛选：

酶切和接头的连接：取0.5μg基因组DNA，采用EcoRI和MseI进行双酶切。酶切后与EcoRI和MseI接头连接。EcoRI和MseI接头序列为：

EcoRI接头：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’

3’-CATCTGACGCATGGTTAA-5’

MseI接头：5’-GACGATGAGTCCTGA-3’

3’-TACTCAGGACTCAT-5’

酶切连接产物的扩增：取5μl酶切连接产物为模板进行预扩增。预扩增程序为：94℃1 min，56℃1min，72℃1min，36个循环；72℃延伸7min。预扩增产物1∶20稀释，作为选择性扩增的模板。选择性引物组合共3对，EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60。选择性扩增程序为：94℃预变性3min；94℃30s，65℃30s，72℃120s，然后每个循环退火温度降低0.7℃，经13个循环后，退火温度降至56℃；再进行23个循环的扩增：94℃30s，56℃30s，72℃120s。

扩增反应在PTC-100PCR仪上进行。所用预扩增和选择性扩增引物序列见表1。

表1AFLP预扩增和选择性扩增引物序列

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳：选择性扩增产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(6％丙烯酰胺，0.32％甲叉丙烯酰胺，7mol·L^-1尿素，1×TBE)中电泳分离。电泳缓冲液为1×TBE，恒功率60W预电泳30min后，将扩增产物加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol·L^-1EDTA，0.25％溴酚蓝)95℃变性5min后，立即转移至冰浴中冷却，然后每个样品取8μL上样，60W电泳2～3h。

银染：电泳后，小心分开两块玻璃板，将附着凝胶的长玻璃板放入10％冰醋酸中固定30min；后用去离子水漂洗2次，每次5min；然后转入染色液(2g硝酸银，3mL 37％甲醛溶于2L去离子水)中染色30min，后用2L去离子水快速漂洗5～6s，立即转入显影液(60g碳酸钠，3mL 37％甲醛，400μL 10％硫代硫酸钠溶于2L去离子水)中，轻摇至条带清晰后，加入等体积的10％冰醋酸停显，约10min后用去离子水漂洗干净。自然干燥保存。

多态性分析：PI420145和聚合抗源EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG603对引物的PCR扩增产物分别在200、90、60bp处扩出了1条多态性条带，而感病材料白皮脆这3对引物的PCR扩增产物在200、90、60bp处没有特异条带。

回收：回收PI420145和聚合抗源的AFLP特异条带，加50μL ddH₂O，沸水浴15min，冷却至室温，以DNA为模板进行PCR扩增，扩增引物为EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60。扩增程序为：94℃预变性3min；94℃30s，65℃30s，72℃120s，然后每个循环退火温度降低0.7℃，经13个循环后，退火温度降至 56℃；再进行23个循环的扩增：94℃30s，56℃30s，72℃120s。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测回收，用试剂盒回收DNA，用1％琼脂糖检测。

③SSR引物多态性筛选：

甜瓜抗源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的分子标记方法，其特征在于用SSR标记引物CMAT170a：

上游引物：5’-AGACGAAGGACGGTTAGCTTT-3’(SEQ ID NO.1)，

下游引物：5’-TTAAATCCCAAAGACATGGCG-3’(SEQ ID NO.2)，

通过PCR扩增含抗源PI482398抗蔓枯病基因Gsb-4的育种材料或品种DNA，如果能扩增出120bp片段，则表明抗源PI482398抗蔓枯病基因Gsb 4的存在。

其中，所述的PCR扩增反应体积为20μL，其中包括50mmol·L^-1KCL，10mmol·L^-1Tris-HCL pH＝9.0，2.5mmol·L^-1MgCL₂，150μmol·L^-1dNTPs，067μmol·L^-1上游引物’和下游引物，40ng DNA模板，1U Taq DNA聚合酶；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，最后4℃下保存。

PCR产物在9％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用改良的银染方法检测。

所述的改良的银染方法为：

1)将凝胶从玻璃板上取下，置于白瓷盘中，加入200mL含乙醇100mL·L^-1，乙酸50mL·L^-1的固定液a，固定15min；

2)回收固定液a，加入200mL，2g·L^-1AgNO₃的染色液b，染色15min；

3)回收染色液b，先用去离子水漂洗1次，40s，再用含有15mg·L^-1Na₂S₂SO₃的去离子水漂洗60-90s。

4)加入200mL的NaOH 15g·L^-1，37％甲醛11mL·L^-1的显色液c，显色至条带清晰为止。

回收：对PI482398、白皮脆、聚合抗源中特异条带回收，加70μl ddH₂O，沸水浴15min，以DNA为模板，PCR扩增，2％琼脂糖凝胶检测，用试剂盒回收，回收的DNA用1％琼脂糖凝胶检测。

④克隆、测序：

连接：回收的DNA 5μL，载体PMD19-TVector(TaKaRa)0.5μL，Solution I(冰上溶解)5μL，16℃连接过夜(12h)。

转化克隆：将连接产物加入含有200μL DH5α感受态细胞1.5mL离心管中，冰上静置30min。42℃热击60s，冰上静置2min。加入500μL LB液体培养基(无Amp)，37℃下培养200rpm振荡培养1h。离心，去上清，留大约200μL涂于含有Amp 100mg/L的LB平板。涂板后先正放1h，再倒置于恒温箱中培养过夜(大约10-12h)。挑选菌落，接种于含有0.1％Amp的1mL LB液体培养基的1.5mL离心管中，37℃下200rpm培养过夜。以菌液为模板进行PCR扩增，将含有正确片段的菌液进行测序，委托公司测序。

⑤测序结果：F₄聚合抗蔓枯病材料PI420145和PI482398的抗蔓枯病基因。

EcoRI-TG/MseI-CTC200

A1 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACTCAGAAAAGAAAGAACTATTTCC 40

A2 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACTCAGAAAAGAAAGAACTATTTCC 40

A1 41 AGTCTAGAACATCCACTATCAAAATACCAAGTATCGGTTG 80

A2 41 AGTCTAGAACATCCACTATCAAAATACCAAGTATCGGTTG 80

A1 81 AAGATTCAATTGTTGTAAAGTCAATATTACAAATTCCAGA 120

A2 81 AAGATTCAATTGTTGTAAAGTCAATATTACAAATTCCAGA 120

A1 121 ATTGGTACGCAGTC 134-3′

A2 121 ATTGGTACGCAGTC 134-3′

EcoRI-AT/MseI-CTG90

A3 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACTGCAAAAATTGCCATGACTACTG 40

A4 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACTGCAAAAATTGCCATGACTACTG 40

A3 41 ATAACCTTCAGCTTGAAGCTCTAGTTCCTCTGGTTCCTCC 80

A4 41 ATAACCTTCAGCTTGAAGCTCTAGTTCCTCTGGcTCCTCC 80

A3 81 CATGAATTGGTACGCAGTC 99-3′

A4 81 CATGAATTGGTACGCAGTC 99-3′

EcoRI-TC/MseI-CAG60

A5 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACAGCACATACATCTGGACTATCAG 40

A6 5′-1GATGAGTCCTGAGTAACAG...gTttATgTatgtTgTgta 37

A5 41 TGTGTGTGACAACAATTCGAGAATTGGTACGCAGTC 76

A6 38 TaTacaTGgtg....TTgGAGAATTGGTACGCAGTC 69

CMAT170a

R：5′-1TTAAATCCCAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATA 40

J：5′-1TTAAATCCCAAAGACATGGCGAGAAATTTGCGTTATTATA 40

R：41 TATATATATATTATATTTGTTTTGGTATTTCCTAAGTCGC 80

J：41 TATATATATATTATATTTGTTTTGGTATTTCCTAAGTCGC 80

R：81 CGCCATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTCGTCT 117

J：81 CGCCATGAAAACCTCAAAAGCTAACCGTCCTTCGTCT 117

测序结果显示A1和A2，A3和A4序列同一性为100％，A5和A6同一性序列为64.47％。R与J序列的同一性为100％，结果表明聚合抗源PI420145×PI482398同时聚合了抗源PI420145和抗源PI482398的抗蔓枯病基因。

注：

A1，A3，A5：为AFLP引物EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，

EcoRI-TC/MseI-CAG60在抗源PI420145中扩出的特异序列

A2，A4，A6：为AFLP引物EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，

EcoRI-TC/MseI-CAG60在聚合抗源PI420145×PI482398中扩出的特异序列

R-SSR引物CMAT170a在抗病材料PI482398中扩出的特异序列

J-SSR引物CMAT170a在聚合抗源PI420145×PI482398中扩出的特异序列

Claims

1.甜瓜抗蔓枯病聚合基因材料创制方法：

通过抗蔓枯病材料PI 420145作为母本与父本抗蔓枯病材料PI482398(Gsb-4)进行杂交，自交，室内PCR鉴定，田间抗性筛选和农艺性状选择，连续自交三代得到F₄，在F₄中筛选出PI 420145和PI482398抗蔓枯病基因聚合的纯合株系。

2.PI 420145、PI482398抗蔓枯病基因分子标记定位：

已筛选出3个AFLP分子标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60与PI420145的抗蔓枯病基因连锁；筛选到一个SSR标记与PI482398的抗蔓枯病基因连锁，该标记为CMAT170a，用该SSR标记能扩增出长度约为120bp的DNA片段。

3.甜瓜PI 420145×PI482398 F4抗蔓枯病基因聚合，其特征在于：

PI420145、PI482398蔓枯病抗基因均为单显性。PI420145×PI482398的自交后代F₄聚合了PI420145和PI482398抗蔓枯病基因，三个AFLP标记EcoRI-TG/MseI-CTC200，EcoRI-AT/MseI-CTG90，EcoRI-TC/MseI-CAG60，在F₄和PI420145上分别扩增出相同大小的特异片段。SSR标记CMAT170a在F₄和PI482398上均扩增出长度大小约为120bp的特异片段。回收AFLP和SSR特异条带，克隆测序，F₄上扩增出的特异片段与在PI 420145、PI482398上扩增出的特异片段大小、序列均相同。