CN105296625A - 一种辅助鉴定辣椒灰霉病抗性的分子标记引物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辅助鉴定辣椒灰霉病抗性的分子标记引物及其用途。本发明所提供了一种辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助鉴定辣椒灰霉病抗性的试剂，是分子标记引物对CARpi-1-200，核苷酸组成的特异性引物对。利用本发明提供的引物对，辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒，与田间鉴定结果抗病吻合率达90％。在辣椒育种过程中，利用本发明公开的分子标记，可在苗期灰霉病未发病前对辣椒育种材料中的抗灰霉病基因进行分子标记辅助选择，提高育种效率，加速育种进程。

Description

一种辅助鉴定辣椒灰霉病抗性的分子标记引物及其用途

技术领域

本发明涉及辣椒抗灰霉病基因分子的标记引物，属于辣椒生物技术领域，具体涉及一种可用于鉴定与筛选，辣椒甘肃陇椒品系中抗灰霉病基因的分子标记引物及其用途。

背景技术

辣椒(Capsicumspp.)是世界上最重要的蔬菜作物之一，品种多，产量高，营养丰富，用途广泛，在人们的日常生活中具有重要的作用。在中国，辣椒种植业经过几十年的发展，已经成为我国第二大蔬菜作物，据***粮农组织的统计数据显示，2012年我国辣椒年播种面积为75万公顷，年产鲜椒和干椒1631万吨，播种面积和产量均居世界首位。目前，辣椒已成为我国设施作物生产中重要的经济作物之一，在重点产区已经成为当地种植业中农民增收的支柱产业。但生产中诸多不利因素(如生物胁迫和非生物胁迫)，制约了辣椒种植业的发展。辣椒灰霉病又半知菌亚门，灰葡萄孢(Botrytiscinerea)侵染引起，是大部分地区春季冷床育苗和大中小棚移栽后的主要病害之一。近年来，从幼苗至成株均有发病，发病率在10-15％左右，严重时达到50％以上。由于辣椒灰霉病发生的普遍性和所引起病害的严重性，而且传播途径多样，病害发生常呈现暴发性，导致生产上还没有出现特别有效防治辣椒灰霉病的方法，加强灰霉病的防治对于保证辣椒稳产、高产有着重要的作用。由于传统的病害防治措施如种子处理，轮作和杀菌剂使用对辣椒灰霉病防治难度较大，利用抗性品种是消除这种毁灭性病害潜在威胁的最有效途径。

常的抗病育种方法虽然发挥了重大作用，但也存在很多缺点。常规抗病育种主要通过杂交和多代自交，抗病材料的选择和田间鉴定过程复杂，周期相对较长，而且易受环境条件影响造成可靠性较差。

利用DNA分子标记进行辅助选择，为育种和品种抗性鉴定提供了新的途径。分子标记可以直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，准确性和可靠性极高。

开发简单有效的分子标记技术鉴定抗性材料和追踪目标抗性基因，在多种作物中都是行之有效的一种方法。在利用分子标记进行辣椒灰霉病鉴定的过程中，特异性的引物序列是关键。

经检索发现，申请号CN201410811975.2授权公布号CN104560973A的中国发明专利公开了一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用，该方法是一种利用辣椒疫病转录组和全基因组测序数据信息、差异表达基因鉴定、生物信息学分析、分子标记开发以及疫霉菌接种鉴定来获得辣椒疫病抗病候选基因。由于该方法需要利用了lluminaHiSeqTM₂₀₀₀高通量测序仪器，以及生物信息学分析与预测，成本比较高，技术含量比较高，在农业生产中不能快速的检测与分析出辣椒的抗病与感病性，并且大部分SNP标记只能通过仪器测得，不能通过PCR产物大小直接做出判断，很难大面积推广应用。

与不稳定的RAPD和程序繁琐的AFLP标记相比，简单而特异性强的以PCR为基础的SCAR标记技术在大规模检测方面具有明显优势。与抗性基因紧密连锁的分子标记研究已有大量报道,例如苹果(Xuetal.2007),以及甜瓜(TakahiroTezukaetal.2009)等植物中，但与辣椒灰霉病抗性基因紧密连锁的分子标记目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供辅助鉴定辣椒灰霉病抗性的分子标记、专用引物及其应用。提供了一种辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒的试剂，是由分子标记引物对CARpi-1-200核苷酸组成的特异性引物对组成。其中所述的分子标记引物对CARpi-1-200核苷酸引物对序列为：

上游引物(F)：5′-GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3′；

下游引物(R)：5′-CAGTTCAGCATCATCAATCG-3′；

所述试剂可用于辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒。

要完成辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒，包括如下步骤：

(1)以待测辣椒的基因组DNA为模板，CARpi-1-200核苷酸引物进行PCR扩增；如果没有得到200bp的PCR扩增产物，PCR扩增的反应条件具体可为：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，38个循环；72℃延伸10min，待测辣椒具有灰霉病抗性。

(2)以待测辣椒的基因组DNA为模板，CARpi-1-200核苷酸引物进行PCR扩增，待测辣椒为候选的具有灰霉病抗性的辣椒。所述PCR扩增的反应条件具体可为：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，38个循环；72℃延伸10min。

步骤1所述的待测辣椒具体可为以辣椒品种夏强(高抗灰霉病的自交系‘陇椒5号’)和EarlyCalwonder(高感灰霉病的自交系)为亲本得到的子代、辣椒品种陇椒5号或EarlyCalwonder。

本发明的有益效果：利用本发明提供的试剂(引物对)或SCAR标记辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒，与田间鉴定结果抗病吻合率达90％。将本发明的试剂、分子标记或方法用于育种，具有准确、快速、可以实现早期选育等优点，具有重大应用前景。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法,下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的,以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

高抗灰霉病的自交系‘陇椒5号’，(由甘肃省农业科学研究院出售的高抗灰霉病的自交系)，辣椒品种EarlyCalwonder(高感灰霉病的自交系)上述两个辣椒品种均已经广泛被辣椒育种家使用并可以不受限制地从上述单位购买或索取。将高抗灰霉病的自交系‘陇椒5号’(父本)和高感灰霉病的自交系‘EarlyCalwonder’(母本)杂交，得到F1代。将F1代自交得到F2代分离群体(142个F2代单株)。F2代单株分别自交获得F3代家系种子，根据F3代每个家系人工接种鉴定的抗性分离特征，推测相应F2代单株基因型。

人工接种鉴定方法如下：辣椒灰霉病原x菌株CCO，接种于装有液体PDA培养基的培养瓶中，28℃、150rpm的恒温振荡培养箱内暗培养7天，得到菌液；菌液用双层纱布过滤后3000r/min离心10分钟，倒掉上清液，将沉淀的孢子重新用无菌水配成1×106个/ml的孢子悬浮液备用；辣椒种子经0.5％NaClO消毒1小时后播于10cm×10cm育苗杯中，培养基质为高温灭菌后的蛭石和草炭(1∶2)，每品种播种10株，2次重复，播种后置于抗病温室，保持稳定的苗床温度为28±2℃；在辣椒3叶1心期采用浸根法接种，辣椒植株接种后10天进行调查，植株真叶变黄或植株枯萎直至死亡为感病，无症状为抗病。(参见抗辣椒灰霉病鉴定相关文献)。

与辣椒抗灰霉病基因紧密连锁的AFLP分子标记的获得，分别随机选择纯合基因型的抗病F2单株(10株)和纯合基因型的感病F2单株(10株)用于2个纯合抗病基因池(R1，R2)和2个纯合感病基因池(S1，S2)的构建。分别等量取5株纯合抗病单株和5株纯合感病单株DNA构建2个平行BSA(BulksegregantAnalysis)抗感池R1/S1和R2/S2。

AFLP分子标记分析：选用256对AFLP引物组合扩增抗病基因池、感病基因池和父母本。引物组合：16对EcoRI+ANN(N：A，G，C和T)及16对MseI+ANN引物组合共256对AFLP引物。预扩增程序：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共24个循环；72℃10min。预扩增产物用2％琼脂糖电泳检测。选择性扩增程序：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，共12个循环，每个循环递减0.7℃；94℃30s，56℃30s，72℃1min，共24个循环；72℃10min。酶切和连接：内切酶选用EcoRI和MseI，酶切和连接同步进行。37℃反应过夜，然后70℃水浴15min使酶失活。将连接产物稀释20倍保存备用。变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染：6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，电压2000V，功率70W。选择性扩增产物中加入变性上样缓冲液(98％的甲酰胺，10mmol/L的EDTA，0.25％的溴酚蓝，0.25％的二甲苯青)，然后95℃变性6min，电泳2h左右，电泳完毕后进行银染显色。

特异条带的回收克隆测序：切下多态条带，转入装有50μL重蒸水的离心管中，沸水浴10min，然后12000r/min离心10min。取5μL上清液作为模板再次以相应引物组合，相同条件进行扩增。扩增产物使用2％琼脂糖电泳检测分子量并回收，克隆于pEASY-T1载体上，经蓝白斑筛选挑取白斑后摇菌培养，进行菌液PCR检测后进行DNA测序。

得到一条在抗感自交系之间表现稳定的AFLP片段E-ATT/M-CAC211。重复一次，结果一致。在构建BSA抗感池的10个抗病单株和10个感病单株中该标记与灰霉病抗性共分离。以上利用AFLP标记技术发展出与灰霉病抗性基因紧密连锁的AFLP标记E-ATT/M-CAC211，此标记在感病植株中可扩增出稳定条带。

实施例2

与辣椒抗灰霉病基因紧密连锁的特异检测基因片段的序列获得，从聚丙烯凝胶上回收和纯化2条目的AFLP条带后用pEASY-T1载体进行连接，连接体系：PCRproducts4μl，pMD-Tvoctor1μl，solutionI5μl，totalvolume10μl。将上述试剂冰浴加入0.5离心管中，轻弹混匀，瞬时离心，过夜连接(4℃)。将50μl感受态菌体悬液的离心管从-80℃冰箱中取出，放于冰盒上慢慢解冻，加入全部连接产物约10μl，轻弹管壁混匀，在冰水混合物上放置30min；迅速于42℃水浴中热击90s；迅速置于冰上进行冰浴3-5min，其间不要摇动离心管；加入700μl不含AmP的LB液体培养基，转移至37℃，150r/min摇床上培养1-1.5h；在室温下10000rpm离心1min，弃去上清约700μl，再重悬沉淀。在超净台中每管加入4μlIPTG(200mg/ml的IPTG水溶液)，40μlX-Gal(20mg/μll的X-Gal二甲基甲酰胺溶液)，充分混匀。将混匀后的全部菌液涂布100ug/ml的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜(约10-12h)。取出后放于4℃冰箱正置显色。利用IPTG诱导X-Gal为底物显色反应筛选可能的重组子，进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，放于含有10μlAMP，10mlLB液体培养基的三角瓶中，于37℃，150r/min的摇床中培养8-10h，然后从每个三角瓶中取出1ml放于密封于4℃冰箱中保存，标好标号，用于测序之用。利用原AFLP引物对菌液直接进行PCR扩增比较扩增片段与AFLP常规扩增产物片段大小，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，验证克隆的重组片段E-ATT/M-CAC211的真实性。将检测得的阳性克隆菌液交奥科公司进行克隆片段的DNA序列测定。

实施例3

由特异基因片段序列开发鉴定辣椒灰霉病抗性的SCAR引物，根据测序结果，去除载体及接头序列，利用剩余的序列结合酶切位点设计SCAR引物，按照AFLP引物编号规则，将此新开发的标记命名为CARpi-1-200，其中C表示SCAR标记，下标200表示该SCAR标记的扩增片段长度，引物序列为：

CARpi-1-200(F)：5′-GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3′；

CARpi-1-200(R)：5′-CAGTTCAGCATCATCAATCG-3′；

利用抗病基因池、感病基因池和父母本DNA以及组成抗感池的各个单株的DNA，利用新合成的CARpi-1-200进行扩增，只在感病基因池和母本中扩增出大小为200bp的特异条带，初步验证SCAR标记转化成功。进一步在组成抗感池的各单株中对SCAR标记验证，结果与预期完全相同，表明AFLP标记E-ATT/M-CAC211已被成功转化成SCAR标记。SCAR标记为相斥相连锁(repulsion-phase3marker)，与感病基因在同一染色体上。CARpi-1-200标记是目前国内外报道的第一个与辣椒灰霉病抗性基因连锁的SCAR标记，该标记可以有效地用于辣椒灰霉病抗性的分子标记辅助鉴定和选择。

实施例4

应用CARpi-1-200-F/R鉴定辣椒品种或育种材料的灰霉病抗性，将142个F2代单株分别进行如下检测：提取基因组DNA,以基因组DNA为模板(10-30ng)，用CARpi-1-200-F和CARpi-1-200-R组成的引物对(上下游引物各10-20ng)进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。PCR反应条件：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共38个循环；72℃延伸10min。将PCR扩增产物用进行2％琼脂糖凝胶电泳，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察。如果没有扩增出200bp的PCR扩增产物，该植株为候选的抗病植株。部分结果。人工接种鉴定为纯合基因型(F3代没有发生抗性分离)的抗病F2单株(28株)中，27株都没有扩增出200bp的PCR扩增产物，只有一株扩增出了198bp的PCR扩增产物。

结果表明，采用CARpi-1-200-F和CARpi-1-200-R组成的引物对辅助鉴定与田间鉴定结果抗病吻合率达90％。

Claims (4)

1.辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒的试剂，是由分子标记引物对CARpi-1-200核苷酸组成的特异性引物对组成，其中所述的分子标记引物对CARpi-1-200核苷酸引物对序列为：

上游引物(F)：5′-GTCTGCTCCAACTTCCTCT-3′；

下游引物(R)：5′-CAGTTCAGCATCATCAATCG-3′。

2.根据权利要求1所述的辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒的方法，包括如下步骤：

(1)以待测辣椒的基因组DNA为模板，用CARpi-1-200核苷酸引物进行PCR扩增；如果没有得到200bp的PCR扩增产物，待测辣椒具有灰霉病抗性。

(2)以待测辣椒的基因组DNA为模板，用CARpi-1-200核苷酸引物进行PCR扩增；如果没有得到200bp的PCR扩增产物待测辣椒为候选的具有灰霉病抗性的辣椒。

3.根据权利要求1所述的辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒的试剂，在辣椒育种中的应用。

4.根据权利要求2所述的辅助鉴定辣椒灰霉病抗性和/或辅助筛选具有灰霉病抗性辣椒的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：预变性94℃，5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃延伸10min；所述待测辣椒为以抗病辣椒品种陇椒5号和感病辣椒品种EarlyCalwonder为亲本得到的子代、辣椒品种陇椒5号或辣椒品种EarlyCalwonder。