CN106566888A - 一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法 - Google Patents

一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法 Download PDF

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周颖君
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Abstract

发明提供了一种选育抗水稻稻瘟病和白叶枯病的水稻新品种的方法，属于水稻抗病育种技术领域。本发明选用生产上推广面积最大的两系恢复系9311作待改良亲本，利用分子标记辅助选择结合田间农艺选择的方法，分别与稻瘟病、白叶枯病抗性亲本杂交、回交和自交，再对得到的目的基因纯合株系进行抗性鉴定，选育出农艺性状保持不变，目标抗性性状改良的三种株系，最后将这三个株系根据不同种植区域的实际情况，按不同比例混合，得到抗性多样性的新品种超抗9311；本发明选育的抗性多样性水稻品种在保证原有背景材料农艺性状的基础上，对稻瘟病和白叶枯病的抗性得到巨大提高即有利于增产稳产、又有利于环保，对确保粮食可持续发展具有重大意义。

Description

一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法
技术领域
本发明属于水稻抗病育种技术领域，具体讲是一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法。
背景技术
现有研究报道，由稻瘟菌(Pyricutaria oryzae Cav.)引发的稻瘟病和由白叶枯菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae)引发的白叶枯病是世界范围内对水稻生产危害最严重的真菌性病害和细菌性病害。这两种病害给水稻的稳产增产带来了严重危害，在一般流行年份里能使水稻减产20％左右，严重时甚至会造成绝收。近年来，随着杂交稻亲本遗传基础变窄，以及栽培中氮肥的不合理使用，稻瘟病和白叶枯病害呈逐年递增趋势，给水稻生产带来了很大的威胁。目前主要的防治手法是喷洒药剂和推广应用抗病新品种。药剂防治虽然在水稻抗病过程中起到非常重要的作用，但其所带来劳动成本的增加和环境污染的加剧，已成为当前农业生产的突出问题。因此，培育和种植抗病品种是防治稻瘟病最经济、有效、环保的措施和方法。
但是，目前常规培育和应用水稻抗病品种的策略，存在着育种周期长、对种质资源利用率低，以及所育品种抗性丧失快等缺陷和问题。因此，***研究和利用抗病基因的信息，建立新的应用策略和技术方法，提高对抗性基因资源的利用，是水稻抗病育种的趋势。
已有研究表明，由于病原菌频繁发生致病性变异，导致普通抗病品种往往种植3～5年后抗性逐渐丧失；混合使用不同品种组合形成的异质环境，有利于增强水稻对病菌的持久性抗性。利用水稻抗病基因培育抗性品种，结合分子标记辅助选择(Molecular marker-assisted selection,MAS)，可以快速实现抗性基因向目的材料的转移，扩展其遗传多样性，拓宽抗谱，增强抗性，从而达到控制病害的目的。利用分子标记辅助选择能够实现多种抗性基因的转育，为进一步抗病育种提供种质资源。
在目前已报道的稻瘟病抗性基因及白叶枯抗病基因中，稻瘟病抗病基因Pi2,Pi9和白叶枯抗病基因Xa23是其中抗性最好、实践应用最好的基因之一。Pi2抗谱相当广，对在中国收集的792个稻瘟菌生理小种中的绝大部分表现抗性，只有7.55％的小种能侵染携带Pi2的亲本C101A51，此外，C101A51对来自13个国家的43个稻瘟病菌株中的36个表现抗性。同样，Pi9对来自13个国家的43个稻瘟病菌株均表现出高抗性。Xa23是已报道的对白叶枯病抗性最好的基因之一，其对10个来自菲律宾的白叶枯菌株生理小种、3个来自日本的生理小种，以及七个来自中国的生理小种都表现出很好的抗性。近年来，国内外的众多研究也表明这些基因用于改良品种抗性方面具有良好的效果。
因此，鉴于稻瘟病和白叶枯病害对水稻生产量所产生的危害，选育出对抗稻瘟病以及白叶枯病表现高抗性的水稻新品种/品系的方法迫在眉睫。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明公开了一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，在抗性多样性水稻品种在保证原有背景材料农艺性状的基础上，将稻瘟病抗病基因Pi2,Pi9和白叶枯抗病基因Xa23导入到水稻待改良亲本，提高了稻瘟病和白叶枯病的抗性，即有利于增产稳产、又有利于环保，对确保粮食可持续发展具有重大意义。
本发明是这样实现的：一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，包含以下步骤：
(1)选用两系强优势恢复系9311作待改良亲本，分别与含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料、含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料进行杂交、回交和自交；分子检测是通过提取杂合后代群体的基因组DNA，利用各基因的特异分子标记引物进行PCR扩增及电泳分析；
(2)对分别得到含Pi2、Pi9、Xa23不同抗性基因纯合的BC3F4代种子，种植BC3F4代材料，收种，并分别进行抗性鉴定，选育出农艺性状得到保持，且目标抗病性状得到改良的三种株系；
(3)最后对这三种含不同抗性基因的材料，依据各种植地区具体情况，按一定比例混合，得到抗性多样性的新品种“超抗9311”。
进一步，所述的分子检测是通过提取各杂交后代群体的基因组DNA，利用各基因的特异分子标记引物进行PCR扩增及电泳分析；PCR扩增所用分子标记引物如下所示序列：
Pi2-InDel-F的序列为：5’GCAGCGGCTAGGGTTTATC3’
Pi2-InDel-R的序列为:5’CACCCAGCAACTGATTTGTCA 3’
Pi9-195-F的序列为：5’TTGCTCCATCTCCTCTGTT 3’
Pi9-195-R的序列为：5’ATGGTCCTTTATCTTTATTG 3’
Xa23-C189-F的序列为：5’TAAGTTCTACATCGACCCCA 3’
Xa23-C189-R的序列为：5’CACATGAAGAGCTGGAAACG 3’。
进一步，所述的步骤(1)中的含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料、含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料分别指含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料华占、含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料75-1-127以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料CBB23。
进一步，所述的步骤(1)具体指：
1.1，9311的待改良材料，分别与抗稻瘟病、抗白叶枯病供体亲本75-1-127(Pi9)、华占(Pi2)和CBB23(Xa23)杂交；
1.2，后代利用Pi9、Pi2和Xa23基因标记195、Pi2-Indel和C189对杂交后代个体植株进行选择，并同时用田间农艺性状偏向于9311的后代个体与轮回亲本回交4次，再自交一次，最终得到含不同抗性基因的BC4F2株系。
进一步，所述的步骤(1)中PCR扩增反应体系如下:
2x Reaction Mix:12.5μL；
引物Fl(10μΜ):1μL；
引物Rl(10μΜ):1μL；
Golden DNA Polymerase:0.2μL；
DNA模板(20-50ng/μL):1μL；
ddH2O:补足至25μL；
PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
进一步，所述的步骤(3)具体指按1：1：1混合三种类型改良材料，得到含有三个抗病基因的新品种“超抗9311”。
本发明相较于现有技术的有益效果在于：1.选育过程的高效性：选用稻瘟病抗病基因Pi2,Pi9和白叶枯抗病基因Xa23的水稻材料分别改良亲本9311，能快速得到各单个基因改良的纯合株系；2.生产的适用性：选育得到的各纯合株系，可根据不同地区病害发生的差异，针对性的调配不同的株系的比例，以达到最佳效果的组合；本发明的方法结合田间农艺性状和分子生物学鉴定方法，选育方法具有高效和快捷性。
附图说明
图1是本发明分子标记Pi2-InDel在稻瘟病抗性基因Pi2的抗性亲本华占和待改良亲本9311及纯合后代个体的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图2是本发明分子标记195在稻瘟病抗性基因Pi9的抗性亲本75-1-127和待改良亲本9311及纯合后代个体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本发明分子标记C189在白叶枯病抗性基因Xa23的抗性亲本CBB23和待改良亲本9311及纯合后代个体的扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图4：超抗9311的选育流程图.
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
如图4所示，本发明选育超抗9311的具体步骤为，将分别来自于水稻华占、75-1-127、CBB23的抗病材料与受体亲本9311进行杂交和三次回交，并通过分子标记辅助选择和表型选择得到BC3F1,随后进行3次自交，得到三种BC3F4改良材料；然后根据各不同种植区病害发生的实际情况，按一定比例混合三种类型改良材料，得到含有三个抗病基因，农艺形状保持与轮回亲本9311一致的优良水稻新品种“超抗9311”。具体实施例如下：
实施例1
含稻瘟病抗性基因Pi2的抗性亲本华占与待改良亲本9311杂交、回交及自交群体的鉴定筛选：
利用含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料华占与优质、高产的中籼品种9311为稻瘟病和白叶枯病抗性的待改良材料杂交，得到F1代材料，苗期利用Pi2-InDel选出阳性单株，拔除阴性单株；F1代材料进行苗期稻瘟病抗性基因Pi2的鉴定，保留含目标基因的单株；从苗期开始调查田间表型性状，然后筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。BC1F1代材料也是在苗期标记选择阳性单株，筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。以此类推，直至得到BC4F1种子。种植BC4F1种子，标记辅助结合田间表型选择与9311表型一致的阳性单株自交。BC4F2代选出目的基因纯和、农艺性状与9311一致的单株自交。BC4F2代自交种子进行室内外稻瘟病抗性鉴定，选出综合表现优良的株系。对杂交后代单株提取基因组DNA，以检测各基因的所用引物进行PCR扩增。
如图1所示，以Pi2-InDel-F,R所示序列的引物对，扩增待检测DNA，检测水稻DNA中是否存在稻瘟病抗性基因Pi2；
Pi2-InDel-F的序列为：5’GCAGCGGCTAGGGTTTATC 3’
Pi2-InDel-R的序列为:5’CACCCAGCAACTGATTTGTCA3’
如图1所示，华占中目标基因Pi2基因鉴定方法，110bp所示带为含有Pi2基因特异条带,而对照材料9311中条带大小为108bp。
具体的检测方法如下：
1.DNA提取
取1-50g新鲜植物材料装入2mlEP管中，加钢珠于液氮中震荡成粉。加入600μl(w/v)预热的2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。加入500μl的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10分钟。将上清液转入一干净的1.5mlEP管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min离心10分钟。将上清液转入另一新的1.5mlEP管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。3500-4000r/min离心5-10分钟，去上清液,70％乙醇漂洗，沉淀吹干。然后加入40ul的ddH2O溶解DNA，取2ul溶液电泳检测，4℃保存备用。
2.PCR扩增，扩增反应体系如下:
2x Reaction Mix:12.5μL
引物Fl(10μΜ):1μL
引物Rl(10μΜ):1μL
Golden DNA Polymerase:0.2μL
DNA模板(20-50ng/μL):1μL
ddH2O:补足至25μL。
PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
3.电泳分析
Pi2-InDel引物对PCR反应结束后，取适量样品在10％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测，电泳条件为180V，电泳时间是1:30小时。
实施例2
含稻瘟病抗性基因Pi9的抗性亲本75-1-127与待改良亲本9311杂交、回交及自交群体的鉴定筛选：
利用含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料华占与优质、高产的中籼品种9311为稻瘟病和白叶枯病抗性的待改良材料杂交，F1代材料进行苗期稻瘟病抗性基因Pi9的鉴定，保留含目标基因的单株，然后筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。BC1F1代材料也是在苗期标记选择阳性单株，筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。以此类推，直至得到BC4F1种子。种植BC4F1种子，标记辅助结合田间表型选择与9311表型一致的阳性单株自交。BC4F2代选出目的基因纯和、农艺性状与9311一致的单株自交。BC4F2代自交种子进行室内外稻瘟病抗性鉴定，选出综合表现优良的株系。对杂交后代单株提取基因组DNA，以检测各基因的所用引物进行PCR扩增。
如图2所示，以195-F,195-R所示序列的引物对，扩增待检测DNA，检测水稻DNA中是否存在稻瘟病抗性基因Pi9；
195-F的序列为：5’TTGCTCCATCTCCTCTGTT 3’
195-R的序列为：5’ATGGTCCTTTATCTTTATTG 3’
如图2所示，75-1-27中目标基因Pi9基因鉴定方法，2031bp所示带为含有Pi9基因特异条带,而对照材料9311中没有这条带。
具体的检测方法如下：
1.DNA提取：
取1-50g新鲜植物材料装入2mlEP管中，加钢珠于液氮中震荡成粉。加入600μl(w/v)预热的2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。加入500μl的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10分钟。将上清液转入另一干净的1.5mlEP管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min离心10分钟。将上清液转入新的1.5mlEP管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。3500-4000r/min离心5-10分钟，去上清液,70％乙醇漂洗，沉淀吹干。然后加入40ul的ddH2O溶解DNA，取2ul溶液电泳检测，4℃保存备用。
2.PCR扩增：
扩增反应体系如下:
2x Reaction Mix:12.5μL
引物Fl(10μΜ):1μL
引物Rl(10μΜ):1μL
Golden DNA Polymerase:0.2μL
DNA模板(20-50ng/μL):1μL
ddH2O:补足至25μL。
PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
3.电泳分析：
195引物对PCR反应结束后，取适量样品在1-2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，0:30小时。
实施例3
含白叶枯病抗性基因Xa23的抗性亲本CBB23与待改良亲本9311杂交、回交及自交群体的鉴定筛选：
利用含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料CBB23与优质、高产的中籼品种9311为稻瘟病和白叶枯病抗性的待改良材料杂交，F1代材料进行苗期白叶枯病抗性基因Xa23的鉴定，保留含目标基因的单株，然后筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。BC1F1代材料也是在苗期标记选择阳性单株，筛选出农艺性状与9311一致的单株，在适宜杂交期取这些单株的混合花粉与9311回交。以此类推，直至得到BC4F1种子。种植BC4F1种子，标记辅助结合田间表型选择与9311表型一致的阳性单株自交。BC4F2代选出目的基因纯和、农艺性状与9311一致的单株自交。BC4F2代自交种子进行接种白叶枯病强致病菌P6鉴定，选出综合表现优良的株系。对杂交后代单株提取基因组DNA，以检测各基因的所用引物进行PCR扩增。
如图3所示，以C189-F,C189-R所示序列的引物对，扩增待检测DNA，检测水稻DNA中是否存在稻瘟病抗性基因Xa23；
C189-F的序列为：5’TAAGTTCTACATCGACCCCA 3’
C189-R的序列为：5’CACATGAAGAGCTGGAAACG 3’
如图3所示，CBB23中目标基因Xa23基因鉴定图，750bp所示带为含有Xa23基因特异条带,而对照材料9311中条带大小为800bp。
具体的检测方法如下：
1.DNA提取：
取1-50g新鲜植物材料装入2mlEP管中，加钢珠于液氮中震荡成粉。加入600μl(w/v)预热的2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。加入500μl的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min离心10分钟。将上清液转入另一1.5mlEP中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min离心10分钟。将上清液转入新的1.5mlEP管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。3500-4000r/min离心5-10分钟，去上清液,70％乙醇漂洗，沉淀吹干。然后加入40ul的ddH2O溶解DNA，取2ul溶液电泳检测，4℃保存备用。
2.PCR扩增：
扩增反应体系如下:
2x Reaction Mix:12.5μL
引物Fl(10μΜ):1μL
引物Rl(10μΜ):1μL
Golden DNA Polymerase:0.2μL
DNA模板(20-50ng/μL):1μL
ddH2O:补足至25μL。
PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；72℃7分钟；10℃保存。
3.电泳分析：
C189引物对PCR反应结束后，取适量样品在1-2％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为80V，0:30小时。
实施例4
Pi2、Pi9和Xa23纯合株系的稻瘟病、白叶枯病抗性室内外鉴定；其中对于稻瘟病抗性分级标准，见表1；白叶枯病鉴定的分级标准，见表2.
表1.稻瘟病抗性鉴定的分级标准
表2.白叶枯病鉴定的分级标准
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)选用两系强优势恢复系9311作待改良亲本，分别与含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料、含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料进行杂交、回交和自交，后对各杂交后代群体进行分子检测；
(2)对分别得到含Pi2、Pi9、Xa23不同抗性基因纯合的BC3F4代种子，种植BC3F4代材料，收种，并分别进行抗性鉴定，选育出农艺性状得到保持，且目标抗病性状得到改良的三种株系；
(3)最后对这三种含不同抗性基因的材料混合，得到抗性多样性的新品种“超抗9311”。
2.根据权利要求1所述的利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，所述的分子检测是通过提取各杂交后代群体的基因组DNA，利用各基因的特异分子标记引物进行PCR扩增及电泳分析。
3.根据权利要求1所述的利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中的含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料、含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料分别指含有稻瘟病抗性基因Pi2的水稻材料华占、含有稻瘟病抗性基因Pi9的水稻材料75-1-127以及含有白叶枯病抗性基因Xa23的水稻材料CBB23。
4.根据权利要求3所述的利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体指：
1.1，9311的待改良材料，分别与抗稻瘟病、抗白叶枯病供体亲本75-1-127(Pi9)、华占(Pi2)和CBB23(Xa23)杂交；
1.2，后代利用Pi9、Pi2和Xa23基因标记195、Pi2-Indel和C189对杂交后代个体植株进行选择，并同时用田间农艺性状偏向于9311的后代个体与轮回亲本回交四次，再自交一次，最终得到含不同抗性基因的BC3F4株系。
5.根据权利要求1所述的利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，所述的步骤(1)中PCR扩增反应体系如下:
2x Reaction Mix:12.5μL；
引物Fl(10μΜ):1μL；
引物Rl(10μΜ):1μL；
Golden DNA Polymerase:0.2μL；
DNA模板(20-50ng/μL):1μL；
ddH2O:补足至25μL；
PCR温度循环条件如下:94℃5分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃30秒，35个循环；
72℃7分钟；10℃保存。
6.根据权利要求1所述的利用分子标记辅助选育抗性多样性品种的方法，其特征在于，所述的步骤(3)具体指按1：1：1混合三种类型改良材料，得到含有三个抗病基因的新品种“超抗9311”。
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