CN110272827A - 一种生产生物油脂的丝状真菌黑曲霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种生产生物油脂的丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)菌株E1及其应用。本发明通过对产油菌株黑曲霉菌株E1的发酵条件和培养基进行优化，使其培养生物量高达10.49g/L，油脂含量高达4.59g/L。生物量和油脂含量分别较优化前提高了14.39％和85.08％。本发明所提供的黑曲霉菌株E1可产生油酸、α‑亚麻酸、二十一烷酸等多种脂肪酸。菌株后续可广泛应用于脂肪酸以及生物柴油的生产，具有广泛的工业应用价值。

Description

一种生产生物油脂的丝状真菌黑曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域。具体地，本发明涉及一种生产生物油脂的丝状真菌黑曲霉菌株及其应用。
背景技术
生物柴油是指植物油(如菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油等)、动物油(如鱼油、猪油、牛油、羊油等)、废弃油脂或微生物油脂与甲醇或乙醇等经酯转化而形成的脂肪酸甲酯或乙酯。生物柴油是典型的“绿色能源”，具有环保性能好、发动机启动性能好、燃料性能好，原料来源广泛、可再生等特性。大力发展生物柴油对经济可持续发展、推进能源替代、减轻环境压力、控制城市大气污染具有重要的战略意义。
当前的生物柴油的制备方法主要是以动植物油脂为原料油，特别是食用植物油，例如棕榈油、大豆油、菜籽油、向日葵油。然而，这些油脂原料都是重要的粮食作物，如果大量使用这些作物作为生物柴油的生产原料，不仅会加剧粮食危机，并且由于其原料成本较高，将会使得生产出的生物柴油难以推广。
人们意外地发现，可以利用产油真菌来生产微生物油脂，并以该微生物油脂为原料进一步生产并获得生物柴油。微生物油脂又称单细胞油脂(Single Cell Oil,SCO)，是酵母菌、霉菌、细菌、藻类等在一定条件利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。在适宜条件下，某些微生物产生并储存的油脂占其生物总量的20％以上，具有这种表型的菌株被称为产油微生物。
常见的产油霉菌有：土霉菌(Asoergullus terreus)、深黄被孢霉 (Mortierellaisabellina)、紫瘫麦角菌(Claviceps purpurea)、高山被孢霉 (Mortierella alpina)、毛霉菌(Mucor circinelloide)、刺孢小克银汉霉 (Cunninghamella echinulata)等。霉菌的油脂含量普遍比酵母低，但霉菌中脂肪酸类型却要比酵母菌丰富得多，多数霉菌能合成某些稀有功能性多不饱和脂肪酸，如γ-亚麻酸(Gamma-Linolenic Acid,GLA)、花生四烯酸(Arachidonic Acid,ARA)等而被广泛关注。
利用微生物生产油脂具有以下优势：微生物细胞生长快速、生长周期较短；微生物生长所需原料来源广泛，能利用一些价格低廉的农业废弃物或农副产品，在培养微生物的同时还有益于环境保护；能连续大规模生产，生产成本较低；微生物油脂生产可人工高效调控，所需劳动力少，且不受季节、场地、环境变化等的影响。由此，采用微生物来生产微生物油脂、随后以该微生物油脂为原料生产生物柴油的方法是非常值得推荐和推广的方法，该方法不仅可以降低生产成本，还可以增加生物柴油的获取途径，减轻我国对于进口石油的依赖。
因此，本领域亟需找到一种可以高效地生产微生物油脂的微生物，由此来生产生物柴油，由此提高生产效率，降低生产成本。
发明内容
为了能有效解决生物柴油短缺的问题，本发明的目的之一是找到一种可以高效地生产微生物油脂的微生物，由此可以利用所获得的微生物油脂来生产生物柴油。
因此，在第一方面，本发明提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger) 菌株E1，于2019年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019130。
在第二方面，本发明提供了一种黑曲霉菌株E1，其ITS序列如 SEQ ID NO:1所示。
在第三方面，本发明提供了一种培养基，用于培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1，所述培养基包括以下成分：葡萄糖90 g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母粉0.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，CuSO4·5H2O 0.0001 g/L或对应量的CuSO4，MnSO4·H2O 0.003g/L或对应量的MnSO4，pH 5.0。
在第四方面，本发明提供了一种微生物油脂，所述微生物油脂是通过培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1获得的。
在第五方面，本发明提供了一种生物柴油，所述生物柴油是利用通过培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1获得的微生物油脂为原料获得的。
在第六方面，本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1在生产微生物油脂中的应用。
在第七方面，本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1在生产生物柴油中的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明所提供的黑曲霉E1菌株的产油率即油脂含量和油脂系数均较高，可用于生产生物柴油。
本发明所提供的培养条件和培养基成功提高了菌株的产油效率，大大降低了生产成本，培养基原料易获取，生产工艺控制简便，具有较高的应用价值。
附图说明
图1为采用基础限氮产脂培养基发酵培养黑曲霉E1菌株所获得的油脂积累发酵生长曲线。
图2为黑曲霉E1菌株发酵优化前的脂肪酸甲酯分析气相色谱图。
图3为黑曲霉E1菌株发酵优化后的脂肪酸甲酯分析气相色谱图。
图4为37种脂肪酸甲酯混合标样的气相色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的生产微生物油脂的丝状真菌黑曲霉菌株及其应用进行更为详细的描述。应注意，上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
如上所述，为有效地解决生物柴油短缺的问题，本发明的目的之一是找到一种可以高效地生产微生物油脂的微生物，由此可以利用所获得的微生物油脂来生产生物柴油。
因此，在第一方面，本发明提供了一种黑曲霉(Aspergillus niger) 菌株E1，于2019年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCC NO：M 2019130。
本发明的黑曲霉E1菌株分离自DY23Ⅰ航次在中太平洋海山区 W154°20′N9°59′上覆水。
对在海水中分离获得的该菌株进行基因组DNA提取，并使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将得到的PCR碱基序列(SEQ ID NO.1)在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。经鉴定发现该菌株是一个新的黑曲霉菌株，命名为黑曲霉菌株E1。
因此，在第二方面，本发明提供了一种黑曲霉菌株E1，其ITS 序列如SEQ ID NO:1所示。
在第三方面，本发明提供了一种培养基，用于培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1，所述培养基包括以下成分：葡萄糖90 g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母粉0.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，CuSO4·5H2O 0.0001 g/L或对应量的CuSO4，MnSO4·H2O 0.003g/L或对应量的MnSO4，pH 5.0。
所述培养基可以使用海水(人工海水或者天然海水)进行配制，并且在配制好之后通过高压灭菌(例如通过在121℃持续20分钟)。在采用人工海水进行配制时，该人工海水的配方可以如下：NaCl 24.477g、 Na2SO4 3.9170g、KBr 0.0960g、CaCl2·2H2O 1.1020g、H3BO30.0260g、 MgCl2·6H2O 4.9810g、KCl 0.6640g，SrCl2 0.0240g、NaHCO3 0.1920g、 NaF0.0039g，使用蒸馏水配制，并定容至1L。
在第四方面，本发明提供了一种微生物油脂，所述微生物油脂是通过培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1获得的。
如上所述，“微生物油脂”又称单细胞油脂(Single Cell Oil,SCO)，是酵母菌、霉菌、细菌、藻类等产油微生物在一定条件利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源、氮源、辅以无机盐生产的油脂。微生物油脂主要为脂肪酸甘油三酯，其组成与植物油相似，以C16和C18脂肪酸为主，包括例如硬脂酸、油酸、亚油酸和棕榈酸等。
在一个实施方案中，所述微生物油脂的脂肪酸成分包括油酸、α- 亚麻酸、二十一烷酸、二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种，但不限于此。
在一个进一步的实施方案中，所述微生物油脂的脂肪酸还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或多种如两种或三种，但不限于此。
可用于培养黑曲霉的任何培养基均可以用于培养本发明第一方面和/或第二方面的黑曲霉菌株E1，并且可以针对不同的目的和阶段选择不同的培养基进行培养。优选地，在本发明中，在生产微生物油脂的发酵培养过程中，采用本发明第三方面所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1，以促使此黑曲霉菌株E1高效地生产微生物油脂，由此提高菌体的油脂含量以及油脂产量。
在此所谓“油脂含量”是指油脂重量与菌体干重之间的百分比
(％)，按照公式(1)进行计算：
在此所谓“油脂产量”是指单位体积培养基中菌体(即生物量 (g/L))产生的微生物油脂的量，按照公式(2)进行计算：
油脂产量(g/L)＝油脂含量(％)×生物量(g/L) (2)
其中，生物量(g/L)按照公式(3)进行计算：
在此所谓“油脂系数”是指100g葡萄糖转化成油脂的质量(％)，按照式(4)计算：
在一个进一步的实施方案中，所述黑曲霉菌株在25-30℃(例如 28℃)振荡培养3-10天(例如5天)，其中所述振荡培养的转速可以为例如120-200rpm。
在第五方面，本发明提供了一种生物柴油，所述生物柴油是利用通过培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1获得的微生物油脂为原料获得的。
生物柴油是油脂原料例如动植物油脂或者微生物油脂与一元醇(例如甲醇、乙醇，作为酯交换剂)经过酯化和转酯化反应而得到的长链脂肪酸单酯(如脂肪酸甲酯或者脂肪酸乙酯)，是一种可以替代普通柴油使用的环保燃油。常见的生物柴油制备方法包括碱催化法、酸碱催化法、酶催化法和超临界法等，但不限于此。
在一个实施方案中，所述生物柴油可以包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种的一元酯如甲酯或乙酯。
在一个进一步的实施方案中，所述生物柴油还可以包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种如两种或三种的一元酯如甲酯或乙酯。
如上所述，可用于培养黑曲霉的任何培养基均可以用于培养本发明第一方面和/或第二方面的黑曲霉菌株E1，并且可以针对不同的目的和阶段选择不同的培养基进行培养。优选地，在本发明中，在生产微生物油脂的发酵培养过程中，采用本发明第三方面所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1，以促使此黑曲霉菌株E1高效地生产微生物油脂，由此提高菌体的油脂含量以及油脂产量。
在一个进一步的实施方案中，所述黑曲霉菌株E1在25-30℃(例如28℃)振荡培养3-10天(例如5天)，其中所述振荡培养的转速可以为例如120-200rpm。
在第六方面，本发明提供了本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1在生产微生物油脂中的应用。
在此所述的黑曲霉菌株E1具有本发明第一方面和/或第二方面所描述的特征和特点，在此所述的微生物油脂也相应地具有本发明第四方面所述的微生物油脂的特征和特点，因此不在此对这两者进行重复描述。
在第七方面，本发明提供了一种本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1在生产生物柴油中的应用。
同样地，在此所述的黑曲霉菌株E1具有本发明第一方面和/或第二方面所描述的特征和特点，在此所述的生物柴油也相应地具有本发明第四方面所述的微生物油脂的特征和特点，因此不在此对这两者进行重复描述。所有本发明第一方面和/或第二方面针对黑曲霉菌株E1的描述适用于本方面中提及的黑曲霉菌株，所有本发明第四方面针对微生物油脂的描述均适用于本方面中提及的微生物油脂。
在第八方面，本发明提供了一种生产微生物油脂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养本发明第一方面和/或第二方面的黑曲霉菌株E1；
b)从经步骤a)培养的黑曲霉菌株E1提取微生物油脂。
如上所述，可用于培养黑曲霉的任何培养基均可以用于培养本发明第一方面和/或第二方面的黑曲霉菌株E1，并且可以针对不同的目的和阶段选择不同的培养基进行培养。优选地，在本发明中，在生产微生物油脂的发酵培养过程中，采用本发明第三方面所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1，以促使此黑曲霉菌株E1高效地生产微生物油脂，由此提高微生物油脂的产油率和油脂系数。
在另一个实施方案中，所述黑曲霉菌株E1在25-30℃(28℃)振荡培养3-10天(5天)，其中所述振荡培养的转速可以为例如120-200 rpm。
本领域中任何用于提取微生物油脂的方法均可以用于从经步骤 a)培养的黑曲霉菌株E1培养物中进行提取，所述方法包括例如本发明中具体采用的酸热-有机溶剂法，但是不限于此。
同样地，在此所提及的微生物油脂具有本发明第四方面所述的微生物油脂的特征和特点，因此在此不再对其进行重复描述，所有在本发明第四方面针对微生物油脂的描述均适用于本方面中提及的微生物油脂。
在第九方面，本发明提供了一种制备生物柴油的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养本发明第一方面或第二方面的黑曲霉菌株E1；
b)从经步骤a)培养的黑曲霉菌株E1提取微生物油脂；
c)将在步骤b)获得的微生物油脂与一元醇进行转酯化反应，从而获得生物柴油。
很显然，步骤a)和b)实质上构成了本发明第八方面所述的生产微生物油脂的方法，因此针对本发明第八方面的描述也同样地适用于本发明的这一方面，所以在此不再对这两个步骤进行重复描述。
在步骤c)中，一元醇为酯交换剂，其可以是低碳醇如甲醇或者乙醇，但不限于此。
在此所提及的生物柴油具有本发明第五方面所述的生物柴油的特征和特点，因此在此不再对其进行重复描述，所有在本发明第五方面针对生物柴油的描述均适用于本方面中提及的生物柴油。
本发明的具体方案可以包括以下：
1.一种黑曲霉(Aspergillus niger)菌株E1，于2019年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国湖北省武汉市武昌区八一路 299号武汉大学校内)，保藏编号为CCTCCNO：M 2019130。
2.一种黑曲霉菌株E1，其ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种培养基，用于培养方案1或2所述的黑曲霉菌株E1，所述培养基包括以下成分：葡萄糖90g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母粉0.5 g/L，KH2PO4 2.0g/L，CuSO4·5H2O 0.0001g/L或对应量的CuSO4， MnSO4·H2O 0.003g/L或对应量的MnSO4，pH5.0。
4.根据方案3所述的培养基，其中所述培养基由海水例如天然海水或人工海水配制。
5.根据方案4所述的培养基，其中所述人工海水配方如下：NaCl 24.477g、Na2SO43.9170g、KBr 0.0960g、CaCl2·2H2O 1.1020g、H3BO3 0.0260g、MgCl2·6H2O 4.9810g、KCl0.6640g，SrCl2 0.0240g、NaHCO3 0.1920g、NaF 0.0039g，使用蒸馏水配制，并定容至1L。
6.一种微生物油脂，所述微生物油脂是通过培养方案1或2所述的黑曲霉菌株E1获得的。
7.根据方案6所述的微生物油脂，其中构成所述微生物油脂的脂肪酸包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或多种如两种、三种或四种。
8.根据方案7所述的微生物油脂，其中构成所述微生物油脂的脂肪酸还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或多种如两种或三种。
9.一种生物柴油，所述生物柴油是利用通过培养根据方案1或2 所述的黑曲霉菌株E1获得的微生物油脂为原料获得的。
10.根据方案9所述的生物柴油，其中所述生物柴油包括油酸、α- 亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种的一元酯如甲酯或乙酯。
11.根据方案10所述的生物柴油，其中所述生物柴油还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种如两种或三种的一元酯如甲酯或乙酯。
12.根据方案1或2所述的黑曲霉菌株E1在生产微生物油脂中的应用。
13.根据方案12所述的应用，其中在生产微生物油脂中采用方案 3-5任一项所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1。
14.根据方案13所述的应用，其中所述黑曲霉菌株E1在25-30℃ (例如28℃)振荡(例如120-200rpm)培养3-10天(例如5天)。
15.根据方案12-14任一项所述的应用，其中构成所述微生物油脂的脂肪酸包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或者四种。
16.根据方案15所述的应用，其中构成所述微生物油脂的脂肪酸还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种，例如两种或三种。
17.根据方案1或2所述的黑曲霉菌株E1在生产生物柴油中的应用。
18.根据方案17所述的应用，其中在生产生物柴油中采用方案3-5 任一项所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1。
19.根据方案18所述的应用，其中所述黑曲霉菌株E1在25-30℃ (例如28℃)振荡(例如120-200rpm)培养3-10天(例如5天)。
20.根据方案17-19任一项所述的应用，其中所述生物柴油包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种的一元酯如甲酯或乙酯。
21.根据方案20所述的生物柴油，其中所述生物柴油还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种如两种或三种的一元酯如甲酯或乙酯。
22.一种生产微生物油脂的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养根据方案1或2所述的黑曲霉菌株E1；
b)从经步骤a)培养的黑曲霉菌株E1提取微生物油脂。
23.根据方案22所述的方法，其中在步骤a)中，采用根据方案 3-5任一项所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1。
24.根据方案22-23任一项所述的方法，其中所述黑曲霉菌株E1 在25-30℃(28℃)振荡培养3-10天(5天)，其中所述振荡培养的转速可以为例如120-200rpm。
25.根据方案22-24任一项所述的方法，其中所述微生物油脂中的脂肪酸成分包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种。
26.根据方案25所述的方法，其中所述微生物油脂中的脂肪酸成分还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种如两种或三种。
27.一种制备生物柴油的方法，所述方法包括以下步骤：
a)培养根据方案1或2所述的黑曲霉菌株E1；
b)从经步骤a)培养的黑曲霉菌株E1提取微生物油脂；
c)将在步骤b)获得的微生物油脂与一元醇进行转酯化反应，从而获得生物柴油。
28.根据方案27所述的方法，其中在步骤a)中，采用根据方案 3-5任一项所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1。
29.根据方案27-28任一项所述的方法，其中所述黑曲霉菌株E1 在25-30℃(28℃)振荡培养3-10天(5天)，其中所述振荡培养的转速可以为例如120-200rpm。
30.根据方案27-29任一项所述的方法，其中所述一元醇为甲醇或者乙醇。
31.根据方案27-30任一项所述的应用，其中所述生物柴油包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种的一元酯如甲酯或乙酯。
32.根据方案31任一项所述的生物柴油，其中所述生物柴油还包括十六烷酸、硬脂酸和亚油酸中的一种或者多种如两种或三种的一元酯如甲酯或乙酯。
本发明的有益效果如下：
本发明人意外地发现了一种黑曲霉菌株E1，并且在对该菌株进行优化培养后发现，其具有极其出色的产油率即油脂含量和油脂产量，可用于生产生物柴油。
另外，本发明人还针对该黑曲霉菌株E1的培养条件和培养基进行了优化，经过优化后的培养条件和培养基成功提高了菌株的产油效率，大大降低了生产成本，培养基原料易获取，生产工艺控制简便，具有较高的应用价值。
实施例
下面结合实施例并参照附图对本发明作进一步说明。
实施例1.黑曲霉E1菌株的分离和鉴定
本发明的黑曲霉E1菌株分离自DY23Ⅰ航次在中太平洋海山区 W154°20′N9°59′上覆水。
对在海水中分离获得的该菌株进行基因组DNA提取，并使用真菌通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，将得到的PCR碱基序列(SEQ ID NO.1)在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，经鉴定发现该菌株是一个新的黑曲霉菌株，命名为黑曲霉菌株E1。其ITS序列如SEQ IDNO.1所示：
TGGAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAG GATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCG GGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACT CGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGA GATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGG GGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAA CAGGGTACAATAGACACGGATGGGAGGTTGGGCCCAAAGGACCCGCACTCGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACC TACGGAAACCTTGTT
实施例2.黑曲霉E1菌株的培养以及相关指标检测
一、培养基配制
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的配制：取马铃薯(去皮)200g 切成小块，加人工海水约1L煮沸30min，8层纱布过滤，取滤液，加 20g葡萄糖和15g琼脂，用蒸馏水定容至1L，121℃高压灭菌20min。
种子培养基(YEPD)的配制：葡萄糖20g、蛋白胨10g、酵母粉 10g，使用人工海水配制，调节pH至6.0，并定容至1L，121℃高压灭菌20min。
基础限氮产脂培养基的配制：葡萄糖70g、蛋白胨1.8g、酵母粉 0.5g、KH2PO4 2.0g、MnSO4·H2O 0.005g、CuSO4·5H2O 0.0003g、 MgSO4·7H2O 0.8g，使用人工海水配制，调节pH至6.0，并定容至1L， 121℃高压灭菌20min。
人工海水的配制：NaCl 24.477g、Na2SO4 3.9170g、KBr 0.0960g、 CaCl2·2H2O1.1020g、H3BO3 0.0260g、MgCl2·6H2O 4.9810g、KCl 0.6640 g，SrCl2 0.0240g、NaHCO30.1920g、NaF 0.0039g，使用蒸馏水配制，并定容至1L。
二、黑曲霉培养
液体种子培养：将菌株接种于PDA培养基上于28℃进行活化。将活化好的真菌以一接种环的量于250mL装有100mL种子培养基的三角瓶中，在28℃下160r/min培养48h。
摇瓶发酵培养：取培养好的种子液以5％的接种量(v/v)分别接种于基础限氮产脂培养基或发酵培养基(见实施例3)中，在28℃160 r/min培养数日。
三、相关指标检测
菌体生物量测定：量取一定体积的菌液加入到已称重的50mL离心管中，在6000r/min下离心10min，沉淀用蒸馏水清洗两遍，再于 6000r/min下离心10min，弃上清液(或取发酵液抽滤，用蒸馏水清洗菌体两遍，弃去滤液，刮取菌体于已称重的50mL离心管中)，取沉淀菌体放入冰箱中冷冻结实，再放入冷冻真空干燥箱中干燥至恒重，取出，待离心管恢复至室温后称菌体和离心管的总质量重。生物量(g/L)的计算公式如下：
油脂提取及油脂含量、油脂产量测定：油脂提取方法应用酸热- 有机溶剂法：称取适量菌体，加入10mL 4mol/L盐酸，再加入无水乙醇5mL，振荡混匀，室温放置1h，沸水浴10min后放置于-20℃迅速冷却30min。往破碎好的菌体加入两倍体积的***-石油醚(2:1)，充分振荡2min，5000r/min离心10min，取***-石油醚层，加入10mL质量分数为0.1％的氯化钠溶液，混匀，5000r/min离心10min，用已知重量试管收集***-石油醚层，挥发掉***-石油醚层，称重，并计算油脂含量和油脂产量。油脂含量和油脂产量的计算按式(1)和(2)进行：
油脂产量(g/L)＝油脂含量(％)×生物量(g/L) (2)
油脂系数的计算：油脂系数为100g葡萄糖转化成油脂的质量，按照式(4)计算：
脂肪酸甲酯化：取大约350mg油样加入50mL烧瓶中，移取6 mL 0.5mol/L的NaOH于油样中，并加入几粒沸石，连接回流装置，开始加热回流，回流过程中要不断摇动烧瓶。当烧瓶内的油珠消失，溶液变得透明时(大约需要5～10min)，从冷凝器上端加7mL BF3-甲醇溶液于烧瓶内(用移液管移取)，继续回流1min。然后从冷凝管上端加入2～5mL正己烷后，再回流1min。撤离火源，取出烧瓶，将烧瓶内的液体移入250mL分液漏斗中，往其中加入一定量的饱和NaCl溶液，轻轻上下颠倒数次后，静置分层。从分液漏斗的上层溶液中取出约1mL 转移到磨口试管中，并加入适量的无水硫酸钠，以去除痕量的水分，得到的此甲酯化样品以备气相色谱分析用。
脂肪酸成分气相色谱分析：采用HP-5气相色谱柱(30m×0.32 mm,0.25μm)，柱子升温程序：初始柱温140℃，保温5min，然后以 4℃/min的速率升至240℃，保温15min；载气为氮气；检测器为FID (hydrogen Flame Ionization Detector)检测器；检测温度为260℃；进样量为1μL；分流比为20:1；进样温度为260℃。对比脂肪酸混标，根据各脂肪酸的出峰时间对其进行定性分析，根据各峰的峰面积对其进行定量分析，由各峰面积占总面积的百分比可确定其所对应的脂肪酸占总脂肪酸的百分比。
实施例3.黑曲霉E1菌株发酵培养条件和培养基的优化
1、培养时间优化
首先进行液体种子培养，再进行摇瓶发酵培养，具体过程参见实施例1。在此，采用基础限氮产脂培养基进行发酵培养，该发酵培养在 28℃持续9天，转速为160rpm。对发酵培养1、2、3、4、5、6、7、8、 9天的各菌液检测生物量、油脂含量以及油脂产量，结果示于图1中。
从图1中可以看出，黑曲霉E1菌株在发酵培养至第7天时，生物量达到最大值12.70g/L，而此时其油脂含量没有达到最大值。相反，黑曲霉E1菌株在发酵培养至第5天时，油脂含量达到最大值29.44％，此时油脂产量达到最大值3.56g/L。因此选取第5天作为最佳发酵时间。
2、培养基氮源优化
在基础限氮培养基中，分别以1.8g/L蛋白胨、1.23g/L硫酸铵、 1.00g/L氯化铵、或0.56g/L尿素作为氮源(其含氮量一致，均为2.22×10-2 mol/L)，其他条件一致。发酵培养5天(120小时)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表1所示。由表1可知，当使用蛋白胨作为氮源时，菌株的生物量和油脂产量都最高，且其油脂产量达到最大值，即3.6g/L，因此选择蛋白胨作为氮源。
表1.不同的氮源对菌株油脂产量的影响
3、培养基碳源优化
在基础限氮培养基中，分别以70g/L葡萄糖、70g/L一水合麦芽糖、66.50g/L蔗糖、70g/L一水合乳糖、70g/L果糖作为碳源(含碳量一致，为2.138mol/L)，其他培养条件一致。发酵培养5天(120小时)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表2所示。由表2可知，当使用葡萄糖作为碳源时，菌株的油脂产量最高，因此选择葡萄糖作为碳源。
表2.不同碳源对菌株油脂产量的影响
4、培养基C/N比优化
在基础限氮产脂培养基中，以蛋白胨作为氮源，以葡萄糖作为碳源。固定氮源的量，改变碳源的加入量，调整碳氮比为76、91、106、 121、136、151、166、181，其他条件保持一致。发酵培养5天(120 小时)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表3所示。由表3可知，当调整碳氮比为136时，生物量达到最大，为13.55g/L，此时的最终油脂产量最大，为3.80g/L。因此选取136作为C/N比，即葡萄糖含量为90g/L，蛋白胨含量为1.8g/L。
表3.不同C/N比对菌株油脂产量的影响
5、培养基硫酸铜含量优化
在基础限氮产脂培养基中分别添加浓度为0、0.0001、0.0002、 0.0003、0.0004g/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)，其他条件保持一致，发酵培养5天(120天)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表4所示。由表4可知，当硫酸铜浓度为0.0001g/L时，最终油脂产量最大，为4.25g/L。因此选取硫酸铜浓度为0.0001g/L。
表4.不同硫酸铜浓度对菌株油脂产量的影响
6、培养基硫酸镁含量优化
在基础限氮产脂培养基中分别添加浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8g/L 的硫酸镁(MgSO4·7H2O)，并保持其他条件一致，发酵培养5天(120 天)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表5所示。由表5可知，未添加硫酸镁的培养基中，油脂产量最高，为3.94g/L。由于人工海水中含有少量的硫酸镁，因此无需额外再提高硫酸镁的含量，过高的镁离子浓度反而会抑制油脂的积累。
表5.不同硫酸镁浓度对菌株油脂产量的影响
7、培养基硫酸锰含量优化
在基础限氮培养基中分别添加浓度为0.002、0.003、0.004、0.005、 0.006g/L的硫酸锰(MnSO4·H2O)，保持其他培养条件一致，发酵培养 5天(120天)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表6 所示。由表6可知，当添加0.003g/L硫酸锰时，菌株的油脂含量达到最大值，其油脂产量也达到最高，为3.42g/L。因此，硫酸锰的最适添加量为0.003g/L。
表6.不同硫酸锰浓度对油脂产量的影响
8、培养基初始pH值优化
使用基础限氮培养基并分别调节初始pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、 7.0进行发酵，其他培养条件保持一致，发酵培养5天(120天)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表7所示。由表7可知，菌株在初始pH值为5.0时，其生物量和产油率均达到最大，其油脂产量达到4.28g/L。因此培养基的最适初始pH值应为5.0。
表7.不同pH值对油脂产量的影响
9、培养温度优化
使用基础限氮培养基，分别以20℃、25℃、28℃、30℃以及35℃进行培养，并保持其他条件一致，发酵培养5天(120天)，之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果如表8所示。由表8可知，菌株在28℃时，其生物量和产油量均最高，其油脂产量达到4.78g/L。说明菌株的最适生长温度为28℃。
表8.不同温度对油脂产量的影响
结果：通过以上优化过程可以得知，用于本发明黑曲霉E1菌株的优化发酵培养基组成如下：葡萄糖90g、蛋白胨1.8g、酵母粉0.5g、 KH2PO4 2.0g、CuSO4·5H2O 0.0001g、MnSO4·H2O 0.003g。将以上组分用人工海水(见实施例1)配制，调节pH至5.0并定容至1L，121℃高压灭菌20min，备用。将本发明的黑曲霉E1菌株用上述经优化的培养基于28℃培养5天，可以获得最佳的油脂产量。
实施例4.黑曲霉E1菌株的最佳优化结果验证
采用实施例1的基础限氮产脂培养基(优化前)和实施例3中获得的优化发酵培养基(优化后)来对本发明的黑曲霉E1菌株在28℃进行为期五天的发酵培养，发酵培养结束之后测定生物量、油脂含量以及油脂产量，结果示于表9。
由表9可知，使用实施例3中获得的优化发酵培养基进行发酵培养时，黑曲霉菌株E1的菌体生物量达到10.49g/L，油脂产量达到4.59 g/L，油脂系数达到5.10％，与使用基础限氮产脂培养基进行发酵培养时相比，以上各指标分别提高了14.39％、85.08％和44.07％。另外，该黑曲霉菌株E1的油脂含量也从优化前的27.00％提高至优化后的43.67％。
表9.培养基优化前后黑曲霉菌株E1产油脂的比较
在分别将菌株培养基优化前后发酵培养获得的油脂如实施例2所述那样经甲酯化处理后，采用气相色谱法测定其脂肪酸甲酯组成，并与 37种FAME混合标样的色谱图进行对比。根据出峰时间对脂肪酸进行定性分析，并根据峰面积进行定量分析，由各峰面积占总面积的百分比确定其对应的脂肪酸占总脂肪酸的百分比。
图2示出了黑曲霉E1菌株发酵优化前的脂肪酸甲酯分析气相色谱图，图3示出了黑曲霉E1菌株发酵优化后的脂肪酸甲酯分析气相色谱图，图4示出了37种脂肪酸甲酯混合标样的气相色谱图，表10示出了发酵前后脂肪酸组成及相对含量(％)。由表10可知，在发酵优化前后，本发明微生物油脂的脂肪酸组成无明显变化，主要由油酸、α- 亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸组成。经培养基优化后的油酸含量为 25.57％，α-亚麻酸的含量为44.73％，与优化前的组成和含量没有显著差异。
表10.发酵前后脂肪酸组成及相对含量(％)
上文已经通过一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对其做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所
中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）
<120> 一种生产生物油脂的丝状真菌黑曲霉菌株及其应用
<130> CF190048S
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 547
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 2
tggaagaatg gttggaaaac gtcggcaggc gccggccaat cctacagagc atgtgacaaa 60
gccccatacg ctcgaggatc ggacgcggtg ccgccgctgc ctttcgggcc cgtccccccg 120
gagaggggga cggcgaccca acacacaagc cgggcttgag ggcagcaatg acgctcggac 180
aggcatgccc cccggaatac cagggggcgc aatgtgcgtt caaagactcg atgattcact 240
gaattctgca attcacatta gttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgccggaacc 300
aagagatcca ttgttgaaag ttttaactga ttgcattcaa tcaactcaga ctgcacgctt 360
tcagacagtg ttcgtgttgg ggtctccggc gggcacgggc ccggggggca gaggcgcccc 420
cccggcggcc gacaagcggc gggcccgccg aagcaacagg gtacaataga cacggatggg 480
aggttgggcc caaaggaccc gcactcggta atgatccttc cgcaggttca cctacggaaa 540
ccttgtt 547

Claims (10)

1.一种黑曲霉(Aspergillus niger)菌株E1，于2019年3月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019130。
2.一种黑曲霉菌株E1，其ITS序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种培养基，用于培养权利要求1或2所述的黑曲霉菌株E1，所述培养基包括以下成分：葡萄糖90g/L，蛋白胨1.8g/L，酵母粉0.5g/L，KH2PO4 2.0g/L，CuSO4·5H2O 0.0001g/L或对应量的CuSO4，MnSO4·H2O 0.003g/L或对应量的MnSO4，pH 5.0。
4.一种微生物油脂，所述微生物油脂是通过培养权利要求1或2所述的黑曲霉菌株E1获得的。
5.一种生物柴油，所述生物柴油是利用通过培养权利要求1或2所述的黑曲霉菌株E1获得的微生物油脂为原料获得的。
6.权利要求1或2所述的黑曲霉菌株E1在生产微生物油脂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中在生产微生物油脂中采用权利要求3所述的培养基来培养所述黑曲霉菌株E1；优选地，所述黑曲霉菌株E1在25-30℃(例如28℃)振荡(例如120-200rpm)培养3-10天(例如5天)。
8.根据权利要求6-7任一项所述的应用，其中构成所述微生物油脂的脂肪酸包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸、二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种。
9.权利要求1或2所述的黑曲霉菌株E1在生产生物柴油中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述生物柴油包括油酸、α-亚麻酸、二十一烷酸和二十烷酸中的一种或者多种如两种、三种或四种的一元酯如甲酯或乙酯。
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