CN102807967A - 乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种乳牙牙髓在制备间充质干细胞的应用及乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，步骤如下：将乳牙经过原代培养获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液，再将乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液经传代培养即获得乳牙牙髓间充质干细胞。本发明采用了乳牙牙髓作为制备间充质干细胞的组织材料，这与骨髓、脐带血、胎盘不同，采集的方式为自然脱落或手术拔除的儿童完整乳牙。由于儿童有20颗乳牙，以上下颚各6颗乳牙培养出之乳牙干细胞最好，由于不必一出生就取样，而且还有20次采集的机会，所以即使错过胎盘和脐带组织采集机会的人，和目前已曾掉落来不及收集的儿童，20颗中的任何一颗乳牙，皆有机会获得乳牙间充质干细胞。

Description

乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种乳牙牙髓组织间充质干细胞，尤其是一种乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法。

背景技术

干细胞是一种未分化的细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞（totipotent stem cell）即可以分类为功能一致的全能细胞，可以发育为胎儿；第二类是多潜能干细胞（pturipotent stem cell)，它能够分化为身体中的每种细胞类型，但是不能形成胎盘或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜能干细胞进一步特化为多能（multiPotent）干细胞，其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞。多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚胎干细胞（Embryonic stem cell）具有广泛的潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞（aduit stem cell）是一种将拥有终生自我复制（identical copies）和自我更新（self-renewal）能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的资质细胞。干细胞的分类，主要分为造血干细胞及非造血干细胞。造血干细胞主导血液、免疫方面的疾病，来源例如脐带血；非造血干细胞则以细胞分化与修复为主，可应用于中风、糖尿病、老年痴呆等再生医学，来源有脐带、乳牙等。

间充质干细胞（mesenchymal stem cell MSC）是可形成多种细胞类型的多能干细胞。MSC最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。随着间充质干细胞及其相关技术的日益成熟，临床研究已经在许多国家开展。作为种子细胞，临床上主要用于治疗机体无法自然修复的组织细胞和器官损伤的多种难治性疾病；作为免疫调节细胞，治疗免疫排斥和自身免疫性疾病。

目前，已经能够从骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中分离和制备间充质干细胞，用得最多的是骨髓来源的间充质干细胞。但骨髓来源的间充质干细胞存在以下问题：随着年龄的老化，干细胞数目显著降低、增殖分化能力大幅度衰退；制备过程不容易质控；移植异体可能引起免疫反应；取材时对患者有损伤，患者有骨髓疾病时不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。这都限制了骨髓间充质干细胞临床应用，使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。

胎盘和脐带组织中分离出的间充质干细胞，不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且具有细胞更原始，有更强的增殖分化能力；免疫细胞较为幼稚，功能活性低，不会触发免疫反应及引起移植物抗宿主病；干细胞易于分离，纯度高，便于质控；采集时对产妇及新生儿无任何危害及损伤，伦理学争议少等优点。虽然胎盘或脐带含有非常丰富的干细胞，但是其问题是：组织材料的收集只能一次完成，局限于生产时的一瞬间做收集，错过时机将不能再次得到。

脐带血、骨髓、牙髓干细胞功能各有不同，脐带血主要针对血液性疾病、骨髓则在器官的修补。

乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduousteeth，SHED）属于多功能的成体干细胞，利用生物晶片技术分析后，显示乳牙及牙龈干细胞可大量表现各种生长因子。其作用包括：①可运用于组织修复的再生医疗，这些细胞经由特别处理后，可分化为造骨细胞、造软骨细胞、神经细胞、血管细胞、脂肪细胞、造象牙质细胞等，未来可以运用于各种间质组织修复的再生医疗。②用于医学美容，目前医学美容常用的肉毒杆菌及玻尿酸，只能维持6至12个月的功效，若以牙龈自体干细胞治疗皮肤皱纹与法令纹等，则可以达到3年之久，且无排斥性。③对治疗神经退化性疾病如阿兹海默症乃至于抗老化、皮肤及骨质再生、器官及血管修补、象牙质、牙髓组织、严重牙周病修复，甚至巴金森氏症、糖尿病的改善及软骨再生方面均具有很大的应用潜力。④能及时对病变部位和外伤受损处进行再生性治疗。目前干细胞储存以脐带血及骨髓最热门，但相较之下，SHED在未来细胞治疗应用上，具有相当大的优势和不可替代的作用。乳牙干细胞的增殖再生力强、组织相容性高、储存方便，提供现代人第2次机会储存干细胞（第1次是脐带血、脐带和胎盘）。若能将干细胞储存起来，未来可望造福到自己、父母甚至祖父母。

现有的培养人干细胞的方法需要使用饲养层、饲养条件培养基（feeder conditionedmedia）或在培养基中供应人或动物细胞提取物以扩增干细胞和防止自发分化。另外，在现有的方法中，如果将所产生的人干细胞用于临床治疗，培养条件可能需要源自动物的产品，而这样的产品有传输疾病的风险。因此，如果将培养的干细胞用于人类治疗，该方法是不适合的。人干细胞的临床应用需要在标准化的、受良好控制的无动物产品的环境（称为“无外源物”的培养环境），其降低传输疾病的风险中培养细胞的方法。此外，需要在不存在饲养层或支持细胞的情况下培养人干细胞的方法以降低饲养细胞或源自饲养细胞的污染物污染干细胞治疗产品的风险。

世界卫生组织对疾病康复、抗衰老的新定义为：“治愈疾病、抗衰老最根本的途径是修复细胞、改善细胞代谢、激活衰老细胞的功能”。只有及时对受损细胞、衰老细胞进行有效治疗，使受损细胞得到康复，衰老细胞得到激活，器官组织和生理功能才能完全恢复正常，人体才能从真正意义上保持健康、保持年轻态。干细胞治疗即是把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞疗法就像给机体注入新的活力，激活人体自身的“自愈功能”，对病变的细胞进行补充与调控，激活细胞功能，增加正常细胞的数量，提高细胞的活性，改善细胞的质量，防止和延缓细胞的病变，恢复细胞的正常生理功能，从而达到疾病康复、对抗衰老的目的。

应用干细胞治疗疾病与传统治疗方法比较具有很多优点：低毒性或无毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；不存在传播疾病的风险；还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。美国国家食品药品监督管理局（FDA）在2004～2009年间相继批准了细胞治疗心肌疾病、细胞治疗神经***疾病等治疗技术，推动全世界细胞治疗的开展，在全美有四十多家医院相继开展了用细胞治疗心肌疾病和细胞治疗神经***疾病等治疗技术。与之同时，美国、英国、日本等发达国家相继立法，使细胞治疗合法化。在我国目前也有多家医院开展了细胞治疗，每年数以万计患者因之受益。

通过检索，发现与本发明专利申请相关的如下专利公开文献：

利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生的技术（CN200410071721.8），本发明属于器官再生技术，具体说，本发明涉及利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生的技术。本发明的技术方案：从臼牙中取出牙髓组织，经消化酶消化后，转入培养液中培养；培养24h后，用PBS洗涤三次，去除未贴壁细胞，贴壁生长的细胞继续培养至14～16天时，进行传代培养；牙髓干细胞经生长因子BMP4和FGF10诱导24h后将体外培养的角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行重组，形成重组团块；将重组团块置于37℃、5％ CO₂培养箱中培养24h，再移植到口腔内，经培养10～12周后，在口腔内形成牙齿。本发明的优点在于利用角朊细胞干细胞和牙髓干细胞进行牙齿再生，角朊细胞干细胞和牙髓干细胞可根据公开的技术手段通过体外大量培养得到，大大扩大了材料的来源，方便推广使用。

通过对比，本发明专利申请与上述的专利公开文献存在本质的不同。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用和乳牙牙髓间充质干细胞的培养方法，该培养方法中所采用的乳牙牙髓组织采集方便、在培养过程中不需要特殊的滋养层细胞的制备，特别是不需要添加任何动物血清和其它任何动物源成分，采用无外源动物血清的细胞培养技术，并且使用高度纯化的动物源性的胰蛋白酶代用品进行细胞的消化，方法简单易行。

本发明实现目的的技术方案是：

乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用。

一种乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，步骤如下：将乳牙经过原代培养获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液，再将乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液经传代培养即获得乳牙牙髓间充质干细胞。

而且，所述原代培养方法为：

⑴将乳牙经过无菌处理、物理切割成组织碎块，加入间充质干细胞完全培养液即获得牙髓组织混合液；

⑵将步骤⑴中的牙髓组织混合液置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养；

⑶培养10～15天即获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液。

而且，所述的传代培养的方法为：

⑴吸出乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液中上清液得贴壁细胞，向贴壁细胞中加入胰酶替代物消化液至浸没贴壁细胞，再将其置于CO₂孵育箱中，36～38℃保温5分钟进行消化；

⑵消化结束后将消化液吸出，加入间充质干细胞完全培养液冲洗，离心；离心结束后，吸出上清得沉淀；

⑶向步骤⑵的沉淀中加入间充质干细胞完全培养液至浸没沉淀，置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养，培养5～7天，即获得乳牙牙髓间充质干细胞。

而且，所述的胰酶替代物消化液的成分为：质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液。

一种乳牙牙髓间充质干细胞的保存方法，步骤如下：

⑴冻存细胞的收集

收集如权利要求2所述的培养方法所制备的乳牙牙髓间充质干细胞，加入胰酶替代物消化液，加入量为浸没乳牙牙髓间充质干细胞，进行消化得细胞液，将细胞液离心得细胞沉淀，再将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬得细胞悬液，并进行细胞计数；

⑵细胞冻存悬液配制

按照细胞悬液中细胞数为1-5×10⁶时，细胞悬液与DMSO的配制体积比例为3-5:1向细胞悬液中加入DMSO，混匀，然后分装得细胞冻存悬液；

⑶细胞冻存

将步骤⑵中的细胞冻存悬液以1℃.min^-1的降温速度降温至-85℃，然后置于-196℃液氮中即可对乳牙牙髓间充质干细胞进行保存。

一种乳牙牙髓组织间充质干细胞的复苏方法，步骤如下：

⑴取出如权利要求7所述保存的乳牙牙髓间充质干细胞，立即放入36-38℃水浴中融化得细胞悬液；

⑵将细胞悬液用间充质干细胞完全培养液进行洗涤离心得细胞沉淀；

⑶将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬，然后置于37℃、体积分数为4～6%的CO2孵育箱中培养5～7天即复苏获得乳牙牙髓组织间充质干细胞。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明采用了乳牙牙髓作为制备间充质干细胞的组织材料，这与骨髓、脐带血、胎盘不同，采集的方式为自然脱落或手术拔除的儿童完整乳牙。它具有同胎盘和脐带组织中分离出的间充质干细胞相同的优点，同时，由于儿童有20颗乳牙，以上下颚各6颗乳牙培养出之乳牙干细胞最好，由于不必一出生就取样，而且还有20次采集的机会，所以即使错过胎盘和脐带组织采集机会的人，和目前已曾掉落来不及收集的儿童，20颗中的任何一颗乳牙，皆有机会获得乳牙间充质干细胞。

2、本发明制备乳牙间充质干细胞的条件培养基名称为

MSC SFM XenoFree，货号：A10675-01，为美国GIBCO公司生产的商品化培养基，其组成包括：

MSC SFMBasal Medium（500mL），货号：A13829-01；

MSC SFM XenoFree Supplement（5mL），

货号：A11577-01。其不含任何动物成分，以无热源水配制，经除菌过滤后分装，无抗生素添加，该试剂使用时不需要添加动物血清和其它任何动物源成分，可以最大限度的减少非人源因素的影响，使生产的间充质干细胞适用于临床医疗。

3、本发明的乳牙间充质干细胞传代培养方法中使用的胰酶替代物名称为TrypLE^TMSelect，商品号12563-029，为美国GIBCO公司生产的商品化细胞消化液，使用其对贴壁细胞进行消化处理，以便对细胞进行扩增培养。该胰酶替代物为重组酶，是高度纯化的动物源性的胰蛋白酶代用品，无细胞分解酶，使用其进行贴壁依赖性细胞的消化，细胞生长扩增状态良好，并可进行多次传代，与用传统方法获得的水平无明显差别。适用于任何含血清和无血清的培养条件，使用时不需要胰蛋白酶抑制剂，该试剂在各种温度条件下保持性状稳定，容易储存和使用。

4、本发明乳牙间充质干细胞保存方法，该方法可以使细胞暂时脱离生长状态而使其细胞特性得以保存，需要时再复苏细胞进行扩增。细胞冻存时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），DMSO是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下200度）保存细胞的过程中，可以防止细胞内冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。冻存后的干细胞增殖率、凋亡率和多向分化能力与新鲜培养SHED的差别无统计学意义。

5、本发明致力于开发适于大规模生产的维持和扩增干细胞的方法以为临床应用提供足够数量的干细胞或其分化衍生物。通过使用本发明的方法培养SHED的条件消除了对饲养细胞支持的需求，可以在不存在饲养细胞的情况下在多至150天的时间内维持未分化。本发明的方法则是开发改良间充质细胞的培养方法以用于扩增和在需要时进一步分化干细胞，使其适于为治疗应用标准化、调控和扩大SHED的生产。

附图说明

图1为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞原代培养细胞图，即牙髓组织块周围生长细胞图；

图2为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞的散在单个细胞图；

图3为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞的细胞生长密度80%以上的传代培养细胞图，；

图4为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞逐日生长状态图；

其中，图4-1为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞的1天生长状态图；图4-2为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞的3天生长状态图；图4-3为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞的5天生长状态图；图4-4为本发明的乳牙牙髓间充质干细胞传代培养细胞的7天生长状态图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；本发明中所使用的试剂，如无特殊说明，均为常规试剂。

本发明中所使用的胰酶替代物消化液为TrypLE^TM Select，商品号12563-029，美国GIBCO公司生产；其成分为：重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液，重组动物胰蛋白酶的质量百分数为0.25%。

本发明专利申请中间充质干细胞完全培养液及其配制方法如下：

1、间充质干细胞培养液组成：美国GIBCO公司生产的商品化间充质干细胞培养基MSC SFM XenoFree共2瓶，包括：基础培养基

MSC SFM Basal Medium（500mL），添加剂

MSC SFM XenoFree Supplement（5mL）；

其成分包括：人源胶原蛋白（由细胞自体分泌产生）、转铁蛋白、重组人血小板源生长因子、重组人表皮生长因子、ɑ-MEM。

2、配制方法：取添加剂1瓶5ml，无菌操作加入到500ml基础培养基中，使成间充质干细胞完全培养液

MSC SFM XenoFree，37℃保温备用。

一、一种乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，每一颗乳牙分别处理的具体步骤如下:

（一）乳牙牙髓间充质干细胞的原代培养

1、乳牙组织材料采集的条件及标准

⑴收集乳牙的基本条件为：采集乳牙的儿童年龄为处于换牙阶段的5～10岁儿童，共20颗，优选上下颚各6颗乳牙。

⑵乳牙采集的方式为：自然脱落或手术拔除的儿童完整乳牙。

⑶收集乳牙的标准为：新鲜拔除或自然脱落的乳牙，选择牙体和牙髓健康、无龋齿、无牙髓炎症和牙髓坏死等症状的清洁无附着物的乳牙。这是成功获取SHED的前提。

⑷采集乳牙的保存条件：自然脱落或新鲜拔除的每一颗乳牙应于4小时内放入含有10ml乳牙保存液的转移管中，2～8℃低温保存运送至实验室，且从收集乳牙到处理牙髓的时间不应超过40～120小时。

2、乳牙保存液的配制

⑴乳牙保存液的组成成分：

DMEM/F12液体培养液

Penicillin（青霉素）100IU/ml

Streptomycin（链霉素）100IU/ml

⑵配制方法：500ml DMEM/F12液体培养液中加入青链霉素混合液（含Penicillin10000IU/ml、Streptomycin 10000IU/ml）10ml。

⑶乳牙保存液保存条件：2～8℃。

3、乳牙牙髓材料的处理方法

⑴配制抗菌剂溶液

①成分：青霉素80万单位/支链霉素100万单位/支；

②配制方法：生理盐水注射液中加入青霉素100IU/ml、链霉素100IU/ml，混合均匀。

⑵乳牙牙髓材料的无菌处理

①在无菌环境下，用镊子从乳牙保存液中取出牙齿，放入抗菌剂中反复冲洗，并浸洗10分钟；

②劈开牙冠或用牙科裂钻钻开牙冠，取出冠根部牙髓，放入新的抗菌剂15ml中浸洗10分钟，用眼科弯剪将牙髓组织剪成碎块；

③将含有牙髓组织的抗菌剂放入50ml离心管中，200g离心10分钟；

④离心后，用巴氏吸管吸出上清，将含有牙髓组织碎块的沉淀用3ml间充质干细胞完全培养液重悬成牙髓组织悬液。

4、乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞的培养

⑴配制间充质干细胞完全培养液：

①间充质干细胞培养液组成：美国GIBCO公司生产的商品化间充质干细胞培养基

MSC SFM XenoFree共2瓶，包括：基础培养基

MSC SFM Basal Medium（500mL），添加剂

MSC SFM XenoFree Supplement（25mL）。

②配制方法：取添加剂1瓶25ml，无菌操作加入到500ml基础培养基中，使成间充质干细胞完全培养液MSC SFM XenoFree，37℃保温备用。

⑵将前述的悬浮有牙髓组织碎块的牙髓组织悬液3ml（在培养液中有2、3颗肉眼可见的剪断的牙髓，牙髓的重量为10ug）转移至25cm²的细胞培养瓶中，另取2ml间充质干细胞完全培养液冲洗离心管，并全部加入上述细胞培养瓶中，充分混匀，旋紧瓶盖，将培养瓶置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养。

⑶培养约10～15天后，从牙髓组织块边缘生长出贴壁的成纤维样细胞，此时对细胞进行换液，即用无菌移液器吸取培养的细胞悬液3ml弃之，加入新鲜的间充质干细胞完全培养液3ml至培养瓶中，将培养瓶置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中继续培养。

⑷继续培养约10天左右，贴壁细胞逐渐增殖成较大的细胞集落，细胞培养瓶壁形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛，即获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液，再经离心即可获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞。此时应进行细胞传代。

（二）乳牙牙髓间充质干细胞的传代培养

1、取TrypLE^TM Select 1瓶，商品号12563-029，此为细胞消化用胰酶替代物，美国GIBCO公司生产，室温放置保存；

2、用无菌移液器将25cm²细胞瓶中的组织块和培养液全部吸出，吸取3ml消化液加入培养瓶中，盖紧瓶盖，轻轻摇动培养瓶，致使消化液铺满瓶底；

3、将加入消化液的培养瓶放入CO₂孵育箱中，37℃保温5分钟；

4、保温结束后，取出培养瓶，轻轻拍打瓶体，镜下观察，贴壁细胞圆缩，部分细胞已经脱离瓶底后，即可用移液器将消化液吸出，加入间充质干细胞完全培养液冲洗瓶底细胞，并将全部细胞悬液移入50ml离心管中，100g～200g室温离心5分钟；

5、离心结束，吸出上清，吸取少量间充质干细胞完全培养液，以每秒钟3～5滴的速度，边加边轻轻旋转离心管，将培养液加入到细胞沉淀中，轻轻吹打混匀；

6、吸取上述细胞悬液，加入到1只175cm²细胞培养瓶中，补足培养液到35～40ml；

7、将培养瓶置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养；

8、当细胞传代培养至5～7天后，贴壁细胞有70～90%长满单层后，即得乳牙牙髓间充质干细胞传代细胞，该细胞可进行继代传代。

二、乳牙牙髓间充质干细胞传代细胞的保存方法

1、细胞冻存用保护液

成分：二甲基亚砜（DMSO）

2、冻存细胞悬液的配制方法

⑴冻存细胞的收集

当传代后培养瓶中的细胞贴壁密度达到60～90%时，先将细胞液全部吸出，加入10mlGIBCO TrypLE^TM Select消化液，37℃保温5分钟，待镜下观察细胞圆缩时将消化液吸出，用间充质干细胞完全培养液反复冲洗培养瓶内细胞，并将细胞悬液全部收集至离心管中，100～200g离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬。

⑵细胞计数

取重悬并混合均匀的细胞悬液，用无菌水适当稀释，取10ul细胞稀释液加入到细胞计数板盖玻片下边缘中，此时细胞悬液即可利用液体的表面张力充满计数区，静置30秒，将计数板置于显微镜载物台上，找到计数区后，对四角大方格（每个大方格又分16个小方格）进行合计计数，对压线细胞采取记上限细胞不计下限细胞、计左限细胞不计右限细胞。然后按照公式计算出每ml细胞悬液所含细胞数量。

细胞计算公式：细胞数/ml=（4个大方格合计数/4）×10000×稀释倍数

⑶细胞冻存悬液配制

细胞悬液与冻存保护液DMSO的配制体积比ml:ml比例为4:1，即以一支冻存管中装量为2ml为标准，加入细胞悬液的量为1.6ml，加入DMSO的量为0.4ml。按照每支冻存管中的冻存细胞数量，取已经计数的细胞悬液若干，按比例将其与DMSO溶液混合均匀，加入到细胞冻存管中。用于复苏传代用的冻存细胞数应为2×10⁶/管。

3、细胞冻存方法

将细胞冻存管以1℃.min^-1的降温速度降温至-85℃。然后将降温至-85℃的细胞冻存管放入液氮中（-196℃）保存，即可对乳牙牙髓间充质干细胞进行保存。

三、乳牙牙髓间充质干细胞冻存细胞的复苏方法

1、冻存细胞的融化

从液氮中取出准备复苏的细胞冻存管，立即放入37℃水浴中迅速融化；

2、冻存细胞的培养

⑴用无菌移液器吸出冻存管中的细胞液放入含有间充质干细胞完全培养液的离心管中，吹打混匀；

⑵将离心管用200g离心8分钟进行离心洗涤，弃上清液，将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬；

⑶将重悬的细胞液分别加入到2只175cm²细胞培养瓶中，然后按照每瓶35～40ml液体量补足间充质干细胞完全培养液；

⑷将培养瓶置于37℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养。

⑸当细胞传代培养至5～7天后，贴壁细胞有70～90%长满单层后，即复苏获得乳牙牙髓组织间充质干细胞。

四、乳牙牙髓可应用在间充质干细胞的制备中

乳牙牙髓干细胞（stem cells from human exfoliated deciduousteeth，SHED）属于多功能的成体干细胞，利用生物晶片技术分析后，显示乳牙及牙龈干细胞可大量表现各种生长因子。目前干细胞储存以脐带血及骨髓最热门，但相较之下，SHED在未来细胞治疗应用上，具有相当大的优势和不可替代的作用。乳牙干细胞的增殖再生力强、组织相容性高、储存方便，提供现代人第2次机会储存干细胞（第1次是脐带血、脐带和胎盘）。若能将干细胞储存起来，未来可望造福到自己、父母甚至祖父母。

将乳牙牙髓作为制备间充质干细胞的组织材料，这与骨髓、脐带血、胎盘不同，采集的方式为自然脱落或手术拔除的儿童完整乳牙。它具有同胎盘和脐带组织中分离出的间充质干细胞相同的优点，同时，由于儿童有20颗乳牙，以上下颚各6颗乳牙培养出之乳牙干细胞最好，由于不必一出生就取样，而且还有20次采集的机会，所以即使错过胎盘和脐带组织采集机会的人，和目前已曾掉落来不及收集的儿童，20颗中的任何一颗乳牙，皆有机会获得乳牙间充质干细胞。因此，乳牙牙髓可应用在间充质干细胞的制备中。

本发明专利申请中制备乳牙间充质干细胞所使用的条件培养基名称为

MSCSFM XenoFree，货号：A10675-01，为美国GIBCO公司生产的商品化培养基，其组成包括：MSC SFM Basal Medium（500mL），货号：A13829-01；

MSC SFM XenoFreeSupplement（5mL），货号：A11577-01。其不含任何动物源成分，以无热源水配制，经除菌过滤后分装，无抗生素添加。物理性状为无色、澄清透明的液体，pH7.2～7.6。该试剂使用时不需要添加动物血清和其它任何动物源成分，可以最大限度的减少非人源因素的影响，使生产的间充质干细胞适用于临床医疗。

本发明专利申请中乳牙间充质干细胞传代培养方法中使用胰酶替代物为TrypLE^TMSelect，商品号12563-029，为美国GIBCO公司生产的商品化细胞消化液，用于对贴壁细胞进行消化处理，以便对细胞进行扩增培养。该胰酶替代物为重组酶，是高度纯化的动物源性的胰蛋白酶代用品，无细胞分解酶，使用其进行贴壁依赖性细胞的消化，细胞生长扩增状态良好，并可进行多次传代，与用传统方法获得的水平无明显差别。适用于任何含血清和无血清的培养条件，使用时不需要胰蛋白酶抑制剂，该试剂在各种温度条件下保持性状稳定，容易储存和使用。

本发明专利申请中乳牙间充质干细胞保存方法，该方法可以使细胞暂时脱离生长状态而使其细胞特性得以保存，需要时再复苏细胞进行扩增。细胞冻存时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），DMSO是一种重要的渗透型细胞保护剂。在深低温（零下200度）保存细胞的过程中，可以防止细胞内液冰晶形成、渗透压改变、细胞结构紊乱等导致的损伤。DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤。冻存后的干细胞增殖率、凋亡率和多向分化能力与新鲜培养SHED的差别无统计学意义。细胞冻存数量为以每2mL的细胞冻存液含有（1~2）×10⁶个细胞为宜，密度太高或太低均会导致细胞复苏率的下降；干细胞冻存的温度为-196℃，保存于液氮内，以最大限度保存干细胞的活性。冻存方法为：将细胞冻存管以1℃.min^-1的降温速度降温至-85℃，随后放于液氮中进行长期储存。

本发明专利申请中乳牙间充质干细胞冻存细胞的复苏方法，即将液氮中取出的准备复苏的细胞冻存管立即放入37℃水浴中迅速融化，然后立即用培养液进行洗涤离心，以除去冻存保护剂DMSO，因冻存细胞时加入的DMSO对细胞的毒性很大，因此复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，以免造成对细胞的严重毒性。

结果：

1、本发明乳牙间充质干细胞培养方法所分离培养的牙髓间充质干细胞经多次传代仍能保持多向分化潜能，且纯度可达到90%以上。所获得的乳牙间充质干细胞为贴壁依赖性细胞，其生长性状为长梭型或不规则型，传代培养后5～7天可贴壁长满单层。

2、本发明所培养的乳牙间充质干细胞的形态为贴壁依赖性细胞，具有成纤维细胞样的形状，长梭型或不规则型，有长短不一的突起，胞核卵圆形。其生长特性为，原代细胞生长较慢，约10～15天后细胞呈克隆样生长，形成大小不一的集落，2周左右集落密集生长；传代后细胞呈均匀分布生长，倍增时间二到三天。

Claims (7)

1.乳牙牙髓在制备间充质干细胞中的应用。

2.一种乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：步骤如下：将乳牙经过原代培养获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液，再将乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液经传代培养即获得乳牙牙髓间充质干细胞。

3.根据权利要求2所述的乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述原代培养方法为：

⑴将乳牙经过无菌处理、物理切割成组织碎块，加入间充质干细胞完全培养液即获得牙髓组织混合液；

⑵将步骤⑴中的牙髓组织混合液置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养；

⑶培养10～15天即获得乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液。

4.根据权利要求2所述的乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述的传代培养的方法为：

⑴吸出乳牙牙髓间充质干细胞原代细胞混合液中上清液得贴壁细胞，向贴壁细胞中加入胰酶替代物消化液至浸没贴壁细胞，再将其置于CO₂孵育箱中，36～38℃保温5分钟进行消化；

⑵消化结束后将消化液吸出，加入间充质干细胞完全培养液冲洗，离心；离心结束后，吸出上清得沉淀；

⑶向步骤⑵的沉淀中加入间充质干细胞完全培养液至浸没沉淀，置于36～38℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养，培养5～7天，即获得乳牙牙髓间充质干细胞。

5.根据权利要求4所述的乳牙牙髓间充质干细胞培养方法，其特征在于：所述的胰酶替代物消化液的成分为：质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液。

6.一种乳牙牙髓间充质干细胞的保存方法，其特征在于：步骤如下：

⑴冻存细胞的收集

收集如权利要求2所述的培养方法所制备的乳牙牙髓间充质干细胞，加入胰酶替代物消化液，加入量为浸没乳牙牙髓间充质干细胞，进行消化得细胞液，将细胞液离心得细胞沉淀，再将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬得细胞悬液，并进行细胞计数；

⑵细胞冻存悬液配制

按照细胞悬液中细胞数为1-5×10⁶时，细胞悬液与DMSO的配制体积比例为3-5:1向细胞悬液中加入DMSO，混匀，然后分装得细胞冻存悬液；

⑶细胞冻存

将步骤⑵中的细胞冻存悬液以1℃·min^-1的降温速度降温至-85℃，然后置于-196℃液氮中即可对乳牙牙髓间充质干细胞进行保存。

7.一种乳牙牙髓组织间充质干细胞的复苏方法，其特征在于：步骤如下：

⑴取出如权利要求7所述保存的乳牙牙髓间充质干细胞，立即放入36-38℃水浴中融化得细胞悬液；

⑵将细胞悬液用间充质干细胞完全培养液进行洗涤离心得细胞沉淀；

⑶将细胞沉淀用间充质干细胞完全培养液重悬，然后置于37℃、体积分数为4～6%的CO₂孵育箱中培养5～7天即复苏获得乳牙牙髓组织间充质干细胞。

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