CN105907711A - 乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒 - Google Patents

乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乳牙间充质干细胞的制备方法：用生理盐水和75%酒精对乳牙组织表面进行清洗、消毒，乳牙保存液中保存；乳牙中取牙髓，加入牙髓消化液消化；获得单细胞悬液；加入细胞培养液，离心清洗，沉淀细胞加入细胞培养液，放入二氧化碳培养箱中培养；原代细胞达70%融合时，加入细胞洗剂液，晃动培养瓶冲洗细胞，吸弃细胞洗剂液，加入细胞消化液消化，加入细胞培养液终止消化，反复吹打瓶底至细胞完全脱落，加入细胞培养液接种到培养瓶中，放入二氧化碳培养箱内培养，为P1代间充质干细胞；P1代融合达70‑80%时，胰蛋白酶消化，收集消化细胞，离心，接种；3d后再经胰蛋白酶消化，收集消化细胞，离心，计数，接种，后P3代细胞生长到80%时收获细胞冻存。

Description

乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒
技术领域
本发明涉及干细胞培养领域， 尤其涉及乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是成体干细胞的一种，具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，其在一定条件的诱导下，可分化为成骨、软骨、脂肪、成肌等多种中胚层来源的细胞。目前，干细胞在临床上的应用越来越广泛，主要涉及细胞移植治疗、基因治疗、生物组织工程以及免疫治疗。
间充质干细胞主要来源于骨髓、脐带、脐带血、脂肪、牙周等。因为获取骨髓和脂肪均会对供体带来痛苦，甚至可能导致感染、出血和慢性疼痛等；脐带和脐带血的获取时间只能是产妇生产时，错过时间就难以得到自体间充质干细胞；而乳牙的获取则容易无痛，且每个人一生中首先长出来的是20 颗乳牙，乳牙在半岁左右即开始萌出，约2岁半出齐，6-12岁之间乳牙陆续脱落，因此从乳牙牙髓获取间充质干细胞将越来越普遍。
2003年， Miura 等从脱落乳牙的牙髓中分离出具有高度增殖能力和多向分化能力的干细胞-SHED。由于其具有良好的间充质干细胞的生物学特性，组织来源易得且无创伤，被认为是干细胞组织工程技术中进行组织再生修复比较理想的种子细胞。
现代研究发现乳牙间充质干细胞在治疗骨和牙组织再生修复、神经***疾病及肌肉萎缩、免疫***疾病、皮肤外伤、肝脏疾病等方面有广阔的应用前景。因此，开发简单、快速、安全获得大量乳牙间充质干细胞方法成为当务之急，而目前现有技术中还未有用于制备乳牙间充质干细胞的试剂盒，使得相关科研工作进展缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种乳牙间充质干细胞的制备方法及配合使用的试剂盒。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：乳牙间充质干细胞的制备方法，制备方法包括以下步骤：
（1）乳牙保存；乳牙取出后，用生理盐水对乳牙组织表面进行清洗、消毒，用75%酒精浸泡乳牙1min，浸泡消毒结束后用再用生理盐水清洗乳牙；处理后的乳牙放入乳牙保存液中保存；
所述乳牙保存液为含0.3～0.6g/L青霉素、0.5～1g/L链霉素、0.02～0.04g/L甲硝唑、0.015～0.025g/L两性霉素B、5～10g/L羟甲基纤维素、50～100ug/L胰岛素的MEM溶液或DMEM溶液或IPM-1640溶液；
所述乳牙保存液中的胰岛素的MEM可以用DMEM或IPM-1640替代；
（2）从乳牙中拔取牙髓，加入牙髓消化液消化1-3h；获得单细胞悬液；
每1ml所述牙髓消化液包含1-3mg胶原酶、2-4mg DISPASEⅡ酶、余量为PBS缓冲液；
（3）牙髓细胞培养，消化结束后加入5ml细胞培养液，400g离心5min，离心清洗2次，沉淀细胞加入10ml细胞培养液接入T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养；
培养至第5天培养瓶内液体离心后全量换液，之后每2天全量换液一次；
所述细胞培养液为含1～10ug/L PDGF、1～10ug/L氢化可的松、1～5ng/L EGF、1～5ng/L b-FGF、50～200ng/L PTH、1～10ml/L SITE(sigma)、200～400Mm/L 抗坏血酸、1～20Mm/L***的IMDM培养基；
（4）牙髓细胞洗涤，原代细胞达70%融合时吸弃培养瓶内液体，加入细胞洗剂液，晃动培养瓶冲洗细胞，吸弃细胞洗剂液，加入细胞消化液，消化时间为2-5min，然后加入细胞培养液终止消化，反复吹打瓶底至细胞完全脱落，移入50ml离心管内，400g离心8min。根据计数结果，按照5.0×105个/ml加入细胞培养液接种到T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代间充质干细胞；
所述细胞洗剂液为PBS、HBSS、D-Hanks或生理盐水；
所述细胞消化液为含1.25～2.5mg/ml EDTA的生理盐水、PBS或HBSS溶液；
（5）间充质干细胞的冻存，P1代间充质干细胞融合达70-80%时，胰蛋白酶消化2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数后按8000-10000个/cm2的密度接种；3d后P2代细胞达70-80%时再经胰蛋白酶消化，2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数，按照8000-10000个/cm2密度接种，3d后P3代细胞生长到80%时收获细胞冻存；
所述细胞冻存液为含10～20% DMSO的乳牙间充质干细胞培养基。冻存获得的干细胞，使复苏后的干细胞有极高的存活率。
优选的，所述步骤（1）中乳牙保存液的配置方法：取保存液一半量的MEM溶液，加入青霉素、链霉素、甲硝唑、两性霉素B 、羟甲基纤维素、胰岛素，搅拌溶解，加入MEM定容至全量，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，将制得的溶液无菌分装即得。
优选的，制备100ml步骤（2）中所述牙髓消化液的方法：称取0.1-0.3g胶原酶、0.2-0.4g DISPASEⅡ酶溶于100mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，即得。
一种用于乳牙间充质干细胞制备方法配合使用的试剂盒，所述试剂盒内存放有6个试剂瓶，试剂瓶内分别盛装有上述所述的乳牙保存液、牙髓消化液、细胞培养液、细胞洗剂液、细胞消化液和细胞冻存液。
本发明优点：本发明的乳牙间充质干细胞的制备方法可在20天内获得一定量乳牙间充质干细胞（细胞数量可达107 数量级），并且具有使用方便，成本低廉，无血清，减少动物来源的病原体感染风险，更安全等特点，将在干细胞临床试验及其相关研究中发挥重要作用，应用前景极为广泛。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
用于制备乳牙间充质干细胞的试剂盒的制备：
1、溶液配置：
（1）乳牙保存液配置方法：配制1L离体牙齿保存液，取0.5L的MEM溶液，加入青霉素0.5g、链霉素0.8g、甲硝唑0.03g、两性霉素B 0.02g、羟甲基纤维素8g、胰岛素80ug，搅拌溶解，加入MEM至1L定容，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，将制得的溶液无菌分装至已灭菌的采集瓶内，每瓶25ml。
（2）乳牙洗剂液配制方法：医用生理盐水，75%酒精。
（3）牙髓消化液配制方法：按照每1ml牙髓消化液包含1-3mg胶原酶、2-4mgDISPASEⅡ酶、余量为PBS缓冲液的比例称取混合，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，分装2ml/管。
（4）细胞培养液配制方法：基础培养基为IMDM，1L培养基中含有1*浓度的SITE（sigma），抗坏血酸200-400mM，SITE为细胞生长必需的组份，抗坏血酸有助于牙髓干细胞形成细胞外基质，利于牙髓干细胞生长。含有PDGF1-10ug，氢化可的松1-10ug，EGF 1-5ng，b-FGF 1-5ng，PTH 50-200ng *** 1-20mM，人血白蛋白1-10g。
（5）细胞洗剂液配制方法：PBS，配方为NaCl 8.50g、Na2HPO4·12H2O 3.58g、NaH2PO4·2H2O 0.39g，加双蒸水至1000ml，调整pH 至7.2-7.4 之间，高压灭菌即可。
（6）细胞消化液配制方法：0.25%的胰蛋白酶消化液用医用生理盐水稀释至0.05%。
（7）细胞冻存液配制方法：10mlDMSO 缓慢加入到上述配好的90ml细胞培养液中。
2、乳牙间充质干细胞的制备：
用75%酒精消毒拔除的牙齿，置于采集套装中，24小时内4℃运送到实验室，于4℃冰箱保存。
取出乳牙，用生理盐水清洗牙齿表面，除去血污；用75%酒精浸泡乳牙1min，浸泡消毒结束后用生理盐水清洗牙齿。止血钳固定牙齿，用车针破损或切除牙冠，拔髓针取出牙髓组织。牙髓组织适度剪碎，加入2ml牙髓消化液消化1-3h。
消化结束后加入5ml细胞培养液，400g离心5min，离心清洗2次，取沉淀细胞。
沉淀细胞加入10ml细胞培养液接入T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养。培养后第5天培养瓶内液体离心后全量换细胞培养液，之后每2天全量换细胞培养液一次，培养的细胞为原代细胞。
原代细胞达70%融合时吸弃培养瓶内液体，加入细胞洗涤液，晃动培养瓶冲洗细胞，吸弃细胞洗剂液，加入细胞消化液，消化时间为2-5min，然后加入细胞培养液终止消化，反复吹打瓶底至细胞完全脱落，移入50ml离心管内，400g离心8min。根据计数结果，按照5.0×105个/ml加入细胞培养液接种到T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代。
待3d左右，P1代细胞融合达70-80%时，胰蛋白酶消化2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数后按8000-10000个/cm2的密度接种；3d后P2代细胞达70-80%时再经胰蛋白酶消化，2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数，按照8000-10000个/cm2密度接种，3d后P3代细胞生长到80%时收获细胞冻存。

Claims (4)

1.乳牙间充质干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）乳牙保存；乳牙取出后，用生理盐水对乳牙组织表面进行清洗、消毒，用75%酒精浸泡乳牙1min，浸泡消毒结束后用再用生理盐水清洗乳牙；处理后的乳牙放入乳牙保存液中保存；
所述乳牙保存液包含0.3～0.6g/L青霉素、0.5～1g/L链霉素、0.02～0.04g/L甲硝唑、0.015～0.025g/L两性霉素B、5～10g/L羟甲基纤维素、50～100ug/L胰岛素的MEM溶液或DMEM溶液或IPM-1640溶液；
（2）从乳牙中拔取牙髓，加入牙髓消化液消化1-3h；获得单细胞悬液；
每1ml所述牙髓消化液包含1-3mg胶原酶、2-4mg DISPASEⅡ酶、余量为PBS缓冲液；
（3）牙髓细胞培养，消化结束后加入5ml细胞培养液，400g离心5min，离心清洗2次，沉淀细胞加入10ml细胞培养液接入T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱中培养；
培养至第5天，将培养瓶内液体离心后全量换细胞培养液，之后每2天全量换细胞培养液一次；
所述细胞培养液为含1～10ug/L PDGF、1～10ug/L氢化可的松、1～5ng/L EGF、1～5ng/L b-FGF、50～200ng/L PTH、1～10ml/L SITE、200～400Mm/L 抗坏血酸、1～20Mm/L***的IMDM培养液；
（4）牙髓细胞洗涤，原代细胞达70%融合时吸弃培养瓶内液体，加入细胞洗涤液，晃动培养瓶冲洗细胞，吸弃细胞洗剂液，加入细胞消化液，消化时间为2-5min，然后加入细胞培养液终止消化，反复吹打瓶底至细胞完全脱落，移入50ml离心管内，400g离心8min；根据计数结果，按照5.0×105个/ml加入细胞培养液接种到T75培养瓶中，放入二氧化碳培养箱内培养，计为P1代间充质干细胞；
其中细胞洗涤液为PBS、HBSS、D-Hanks或生理盐水；
其中细胞消化液为含1.25～2.5mg/ml EDTA的生理盐水、PBS或HBSS溶液；
（5）间充质干细胞的冻存，P1代间充质干细胞融合达70-80%时，胰蛋白酶消化2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数后按8000-10000个/cm2的密度接种；3d后P2代细胞达70-80%时再经胰蛋白酶消化2-5min，收集消化细胞，400g离心8min，计数，按照8000-10000个/cm2密度接种，3d后P3代细胞生长到80%时收获细胞冻存；
所述细胞冻存液为含10～20% DMSO的乳牙间充质干细胞培养液。
2.根据权利要求1所述的乳牙间充质干细胞的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述乳牙保存液的配置方法：取保存液一半量的MEM溶液，加入青霉素、链霉素、甲硝唑、两性霉素B 、羟甲基纤维素、胰岛素，搅拌溶解，加入MEM定容至全量，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，将制得的溶液无菌分装即得。
3.据权利要求1所述的乳牙间充质干细胞的制备方法，其特征在于，制备100ml步骤（2）中所述牙髓消化液的方法：称取0.1-0.3g胶原酶、0.2-0.4g DISPASEⅡ酶溶于100mlPBS缓冲液中，搅拌均匀，用0.22um 滤膜过滤除菌，即得。
4.用于乳牙间充质干细胞制备方法配合使用的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内存放有6个试剂瓶，试剂瓶内分别盛装有如权利要求1至3中任一项中所述的乳牙保存液、牙髓消化液、细胞培养液、细胞洗剂液、细胞消化液和细胞冻存液。
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