CN104450603A - 诱导乳腺干细胞自我更新的方法 - Google Patents
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Abstract
诱导乳腺干细胞自我更新的方法。本发明公开了一种microRNA31的新用途。本发明的实验证明,microRNA31过表达使乳腺干细胞的比例明显上调,克隆形成能力增强,从而促进乳腺干细胞的自我更新。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子RNA,尤其涉及一种小分子RNA——miR-31在促进乳腺干细胞自我更新上的应用。
背景技术
转基因技术是将外源基因导入原核细胞或真核细胞来研究基因的表达调控与基因的功能。但基因在离体单个细胞中的功能并不一定能代表基因在整体中的功能。从60年代开始,生命科学研究人员就试图找到一种恰当的方法,将特定的基因导入发育中的哺乳动物体内,以便研究基因的功能及调控规律。转基因动物是指用实验的方法将外源基因导入早期胚胎细胞,使之整合于细胞基因组中而建立的动物品系。最早建立成功的转基因动物是转基因小鼠(transgenic mice)。由于转基因小鼠的建立比其它大型转基因哺乳动物的建立要省时、省力,因此转基因小鼠作为生命科学研究的一个新体系已经得到越来越广泛的应用。
1993年,Gu等应用Cre/loxP重组酶***实现了外源基因的时间特异性表达。现在已经能够从时间和空间的角度控制外源基因的表达并观察其功能,实现导入的外源基因在动物发育阶段上的可控表达。Tet-off/Tet-on基因表达***是新近发展起来的高效,无毒,具有严密开/关功能的基因表达***。自推出以来,在很多方面得到了广泛的应用,尤其是在基因的表达调控及基因治疗上。
MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。1993年,研究人员在线虫中发现第一个microRNA,lin-4。2005年,发现miR-122与Hepatitis C的生长与增殖有关,第一次把microRNA与疾病联系起来。接着,人们发现microRNA调控许多生物学事件,如发育和癌症发生等。因此,microRNA的研究具有重要的理论和应用价值。
乳腺是雌性哺乳动物的重要器官,其产生的乳汁不仅有丰富的营养,而且有免疫保护功能。许多信号通路控制着乳腺上皮细胞增殖、细胞移动、上皮细胞向基质细胞的侵入和上皮细胞与基质细胞的相互作用等过程。研究发现乳腺干细胞在小鼠乳腺发育、繁殖周期和乳腺再生过程中可能起着必不可少的作用。StefanieAvril-Sassen等人利用小鼠乳腺组织的microRNA芯片***地研究了microRNA在不同发育阶段的表达谱。他们检测到有102个microRNA在乳腺发育的不同时期具有不同的表达水平,意味着microRNA对乳腺发育可能具有调控作用。随后Gregory J.Hannon等研究小组又进一步分选了乳腺祖细胞和非乳腺祖细胞,然后分析在两种细胞中microRNA的表达谱,发现miR-31在乳腺干细胞表达水平较高。miR-31不仅在乳腺干细胞中富集,在人类乳腺癌以及小鼠Her2肿瘤组织中表达水平被上调,暗示其可能在乳腺癌发生过程中扮演着一定的角色。Scott Valastyan等人发现miR-31通过靶向RDX、RhoA表达,从而抑制乳腺癌细胞迁移,但是,目前miR-31在乳腺正常发育过程中的作用还一无所知。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是揭示microRNA31(miR-31)促进乳腺干细胞自我更新的分子机制及作用。
为了实现本发明目的,本发明提供miR-31在促进乳腺干细胞自我更新中的应用。该发明可以用于保持和促进奶牛乳腺健康持续分泌乳汁,从而提高中国奶牛产业的产量。
具体地,其是通过在乳腺肌上皮中特异性过表达miR-31,来促进乳腺干细胞自我更新。
作为优选,可在DOX诱导下,促进miR-31在乳腺肌上皮中进行特异性过表达。
体内诱导为通过Tet-on基因表达***诱导miR-31在C57BL/6遗传背景下的小鼠中过表达;
具体步骤为:采用K5rtTA转基因小鼠和pTRE-miR-31转基因小鼠进行杂交,对经PCR鉴定的双阳鼠从出生之日起进行浓度为2mg/mL的DOX诱导,使miR-31在乳腺肌上皮中进行特异性过表达。
体外诱导为利用培养***对乳腺干细胞进行DOX诱导,microRNA31过表达使乳腺干细胞的比例明显上调,克隆形成能力增强;
具体步骤为:
1)采用胶原酶/透明质酸酶对乳腺组织进行消化,分离乳腺单个上皮细胞,并用CD24、CD29、CD31、CD45以及TER119等细胞表面标记物对乳腺干细胞进行流式分选;
2)利用培养***对分选的乳腺干细胞进行体外DOX诱导下克隆形成能力分析;
3)利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠来标记乳腺干细胞的方法来分析miR-31促进干细胞更新的能力。
本发明还提供了采用细胞表面标记物和报告基因检测miR-31过表达促进乳腺干细胞自我更新的方法,采用的细胞表面标记物是CD24和CD29;报告基因是EGFP。
本发明的有益效果在于:
本发明首次提供了miR-31在促进乳腺干细胞自我更新中的新用途。同时,首次提供了体内过表达miR-31促进乳腺干细胞自我更新的方法,通过该方法使乳腺干细胞的比例明显上调,克隆形成能力增强。一方面提供了一种促进乳腺干细胞自我更新的方法。另一方面,miR-31有可能成为治疗乳腺癌药物设计的靶标。
附图说明
图1为本发明real-time PCR结果。
图2为本发明miR-31过表达增加乳腺干细胞数量。
图3为本发明miR-31增强乳腺干细胞的克隆形成能力。
图4为本发明miR-31过表达促进Lgr5阳性的乳腺干细胞扩增效果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1乳腺干细胞分离
1.取小鼠新鲜乳腺组织,去掉***,放入10cm细胞培养皿中,置于冰上,用手术刀和镊子将乳腺组织尽可能的剪碎。
2.将上述乳腺组织放入15mL离心管中,向其中加入适量胶原酶/透明质酸酶消化液,置于37℃杂交炉中旋转,消化6-8小时。
3.待乳腺组织消化完全后,350xg离心5-10min,小心弃去上清液。
4.在上述乳腺组织碎块中加入2-3mL氯化铵溶液,以达到破坏乳腺组织中的红细胞。350xg离心5min,弃上清。
5.添加1-2mL胰蛋白酶,用移液器上下混匀1-3min。随即再向其中加入10mL预冷的HBSS缓冲液,用以终止胰蛋白酶消化,350xg离心5min,尽可能的弃去上清,但是不要将其中的粘稠的漂浮组织样倒出。
6.向上述离心管中加入2mL经预热的5mg/mL分散酶以及200μL1mg/mL DNase I,使用移液器充分混匀,直到上述粘稠的细胞团块分散,并且溶液变得均匀浑浊,如果不然,可以补充加入100μL DNase I。
7.随即加入10mL事先预冷的HBSS缓冲液,充分混匀后,过40μm细胞筛,将细胞制成单细胞悬液,随后350xg离心5min,弃去上清后,如果发现离心管底细胞团块中仍然有红细胞,可向其中再次加入1-2mL氯化铵,破环红细胞,350xg离心5min,弃上清,此时的细胞可用于下游流式细胞仪分选。
8.将上述分离制成的单细胞悬液转移至1.5mL离心管中,向其中加入适量乳腺干细胞染色缓冲液(用于流式细胞仪分选),并添加相应的标记抗体,如CD24、CD29、CD31、CD45以及TER119,置于4℃,避光20-30min。抗体来源:CD24-rphycoerythrin-Cy7(PE-Cy7,BD),CD29-fluorescein isothiocyanate(FITC,BD),annexin-V-APC(APC,BD),anti-mouse CD45-allophycocyanin(APC,BD),anti-mouseCD31-APC(APC,BD),anti-mouse TER-119APC(APC,BD).
9.待上述染色结束后,350xg离心5min,弃上清,使用PBS漂洗2次,每次5min。随后350xg离心5min,弃上清,再使用染色缓冲液或者PBS重悬细胞,混合均匀,立即用于流式细胞仪分选,或者置于4℃避光,等待流式细胞仪分选。CD31-CD45-TER119-CD24+-CD29high的细胞是富含乳腺干细胞的细胞群。
实施例2Dox在K5rt-TA/TRE-miR-31转基因小鼠乳腺组织中诱导miR-31表达和miR-31的检测
1.利用含有2克/升Dox的水去饲喂3周龄的K5rt-TA/TRE-miR-31双阳小鼠,同时饲喂K5rt-TA或TRE-miR-31单阳小鼠作对照。在12周时杀死小鼠取样。
2.采用脱臼法处死小鼠后,用去RNase酶的手术剪刀以及手术镊将***去除后,取乳腺组织放于经DEPC处理的1.5mL离心管中,向其中加入1mL Lysis Binding Buffer,放入匀浆仪匀浆10-15min,直到组织完全裂解后,再向上述匀浆液中添加100μLHomegenateAdditive,轻轻振荡几次,置于冰上10min。
3.向上述混合液中添加1mL酚仿抽提液,轻轻振荡1min,10,000g离心5min,直到分层。
4.将上清液转移至2mL离心管中,向其中添加1.25倍体积的无水乙醇,充分混匀后,室温放置。
5.将上述混合液加入到柱子中(每个柱子每次最多只能加入700μL),10000g离心15s,弃滤液,重复本次操作,直到滤过所有上述混合液。
6.向柱子中添加700μL miRNA Wash Solution I,离心15s(10,000g),弃去滤出液,并再次向其中加入500μL Wash Solution2/3,10000g离心15s,重复该操作一次后,空柱再次离心一次,去除残留液体。
7.将柱子转移到2mL Collection Tube中,向其中加入50-100μL经95℃预热的Elution Solution,10,000离心30s,弃去柱子。使用Nanodrop测离心管底部溶液浓度和纯度,-80℃保存待用。
8.反转录miR-31,按下列反应体系加样(15μL),包括:引物,3.0μL;dNTP,0.15μL;Mautiscribe RT enzyme,1.0μL;10x RT Buffer1.5μL;RNase inhibitor,0.19μL;RNA样品,5.0μL(1-10ng);DEPC水,4.16μL.反应条件:16℃,30min;42℃,30min;85℃,5min;最后保持在4℃。
9.miR-31定量PCR,按照下列反应体系加样(20μL),包括:TaqManSmall RNA Assay,1.0μL;Product from RT Reaction,1.33μL;TaqManUniversal PCR Master Mix,10.0μL;DEPC水,7.67μL.反应条件如下:第一步,95℃,10min;第二步,95℃,15s;60℃,1min;重复40次。第三步,4℃,30min。
real-time PCR结果如图1所示,图1显示Dox诱导miR-31在K5-rtTA和TRE-miR-31双阳小鼠的乳腺上皮的CD24+CD29high细胞显著上调。
miR-31过表达增加乳腺干细胞数量如图2所示,(A)流式细胞结果显示CD24+CD29high细胞在K5-rtTA和TRE-miR-31双阳小鼠比TRE-miR-31或K5-rtTA单阳小鼠相比显著增加。(B)4次独立实验的统计结果显示CD24+CD29high细胞在K5-rtTA和TRE-miR-31双阳小鼠中增加4倍。
实施例3miR-31对乳腺干细胞体外克隆形成能力的影响
1.按实施例一中的方法分选得到的Lin-CD24+CD29high细胞群均等分成3份,每份含有105细胞。
2.使用电转的方法使其中2份细胞电转入4μg Scramble RNA,另外1份细胞电转入4μg miR-31抑制剂(5’-CAGCUAUGCCAGCAUCUUGCCU-3’;Shanghai GenePharma Co.,Ltd)。
3.将这些细胞用EpiCult-B培养液重悬后,放入细胞培养支架上(Millipore Cor.,Billerica,USA)培养。培养液是EpiCult-B培养液加入生长促进因子,包含10ng/mL recombinant human Epidermal GrowthFactor(rhEGF;Catalog#02633,Stem Cell Technologies),10ng/mLrecombinant human Basic Fibroblast Growth Factor(rh-bFGF;Catalog#02634,Stem Cell Technologies),4μg/mL(0.0004%)Heparin(Catalog#07980,Stem Cell Technologies),100U/mL Penicillin and100μg/mL of Streptomycin(Sigma),and10%FCS(Hyclone)。每隔24h,换新鲜培养液一次。
4.2份miR-31Scramble RNA处理的细胞中,一份加入200ng/mLDox诱导miR-31表达作为miR过表达的实验组,另一份则不加入Dox作为阴性对照。
5.培养8天后,对形成的克隆数量和大小进行统计。
6.使用0.25%胰蛋白酶-EDTA在37℃培养箱中完全消化3-5min后,经离心、重悬后得到单个细胞。
7.miR-31抑制剂处理的细胞再次电转4μg miR-31抑制剂,其他两分再次电转4μg scramble RNA。
8.重新将这些细胞放回新一个培养支架中培养,那Dox处理的细胞再次加入200ng/mL Dox,对照的细胞不用加入。
9.继续培养8天后,再次测量和统计克隆的数量和大小。接下来3-6代培养重复以上程序。
miR-31增强乳腺干细胞的克隆形成能力如图3所示,图3中,左边图片显示Dox可以增加体外乳腺干细胞培养的克隆数量。相反,anti-miR-31可以抑制乳腺干细胞的克隆形成能力。右边图表显示在乳腺干细胞连续6代的培养过程中,Dox可以促进乳腺干细胞的自我更新。相反,miR-31抑制剂可以抑制乳腺干细胞的自我更新。通过体外培养技术评估miR-31对细胞克隆形成能力的影响,发现DOX诱导下乳腺干细胞克隆形成的数量也显著增加,说明过表达miR-31可以显著促进乳腺干细胞的自我更新能力。
实施例4利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠来标记乳腺干细胞的方法检测miR-31对乳腺干细胞的自我更新的影响
1.将Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠与K5-rtTA和TRE-miR-31转基因小鼠杂交得到Lgr5-EGFP-CreERT,K5-rtTA和TRE-miR-31三阳性小鼠。用K5-rtTA和Lgr5-EGFP-CreERT双阳鼠和野生型作对照。
2.在小鼠出生3周后开始喂含有2mg/ml Dox的水,用于诱导miR-31表达。
3.在12周时,取乳腺组织,固定在zinc-formalin里。
4.利用GFP的抗体(Abcam)进行常规的免疫荧光染色。GFP阳性的细胞是乳腺干细胞。
miR-31过表达促进Lgr5阳性的乳腺干细胞扩增如图4所示,Lgr5阳性乳腺上皮细胞已经被鉴定为乳腺干细胞。通过Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠来检测miR-31对乳腺干细胞中的影响的检测中,显示Lgr5阳性细胞在miR-31过表达的小鼠中显著增加。
综上所述,利用我们的方法,Dox可以显著在K5-rtTA/TRE-miR-31双阳小鼠和乳腺干细胞中诱导miR-31过表达。
利用以上的方法分别对K5-rtTA/TRE-miR-31双阳小鼠和K5-rtTA,RE-miR-31单阳小鼠中Lin-CD24+CD29high乳腺干细胞群细胞数量的比例进行分析。经Dox诱导后,K5-rtTA/TRE-miR-31双阳小鼠Lin-CD24+CD29high乳腺干细胞群细胞的比例比K5-rtTA和TRE-miR-31单阳小鼠上调4倍。显示miR-31可以促进乳腺干细胞的自我更新。
通过体外培养技术评估miR-31对细胞克隆形成能力的影响,发现DOX诱导下乳腺干细胞克隆形成的数量也显著增加,说明过表达miR-31可以显著促进乳腺干细胞的自我更新能力。
Lgr5阳性乳腺上皮细胞已经被鉴定为乳腺干细胞。通过Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠来检测miR-31对乳腺干细胞中的影响的检测中,显示Lgr5阳性细胞在miR-31过表达的小鼠中显著增加。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.microRNA31在促进乳腺干细胞自我更新中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,其是通过在乳腺肌上皮中特异性过表达microRNA31,来促进乳腺干细胞自我更新。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,在DOX诱导下,使microRNA31在乳腺肌上皮中进行特异性过表达,促进乳腺干细胞自我更新。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,Tet-on基因表达***诱导microRNA31在C57BL/6遗传背景下的小鼠中过表达;
具体步骤为:采用K5rtTA转基因小鼠和pTRE-miR-31转基因小鼠进行杂交,对经PCR鉴定的双阳鼠从出生3周龄起进行浓度为2mg/mL的DOX诱导,使microRNA31在乳腺肌上皮中进行特异性过表达。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,利用培养***对乳腺干细胞进行DOX诱导,microRNA31过表达使乳腺干细胞的比例明显上调,克隆形成能力增强;
具体步骤为:
1)采用胶原酶/透明质酸酶对乳腺组织进行消化,分离乳腺单个上皮细胞,并用CD24、CD29、CD31、CD45以及TER119等细胞表面标记物对乳腺干细胞进行流式分选;
2)利用培养***对分选的乳腺干细胞进行体外DOX诱导下克隆形成能力分析;
3)利用Lgr5-EGFP-CreERT的基因敲入小鼠来标记乳腺干细胞的方法来分析miR-31促进干细胞更新的能力。
6.一种microRNA31过表达的检测方法,其特征在于,采用细胞表面标记物和报告基因检测,所述细胞表面标记物是CD24和CD29;所述报告基因是EGFP。
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