CN102786414B - 一类用于治疗和/或预防神经退行性相关疾病的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类水杨酸类化合物及其药学上可接受的盐的药物组合物。本发明的化合物可加入药剂学允许的赋形剂制成药学上可接受的各种药物制剂。本发明所公开的化合物经研究证实，对过氧化氢诱导的体外培养神经细胞损伤具有保护作用，可剂量依赖性改善老年痴呆及血管性痴呆的学习记忆能力及神经病理学改变，能有效用于治疗和/或预防神经退行性相关疾病。

Description

一类用于治疗和/或预防神经退行性相关疾病的化合物

技术领域

本发明属医药领域，涉及一类水杨酸类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防神经退行性相关疾病的药物中的用途，包括但不限于血管性痴呆、阿尔茨海默氏病（早老性痴呆）、帕金森症、亨廷顿症、HIV相关痴呆症、多发性硬化症、进行性脊髓侧索硬化症、神经性疼痛、青光眼等神经退行性疾病。

背景技术

血管性痴呆（Vascular Dementia，VD）是由各种类型的脑血管疾病（包括缺血性脑血管病、出血性脑血管疾病、急性和慢性缺氧性脑血管疾病等）所致的智能及认知功能障碍的临床综合征，其主要临床表现包括：认知能力、记忆力和社会生活能力的减退以及情感、性格的改变，是一种慢性进行性疾病。在中国、日本等亚洲国家血管性痴呆是老年期痴呆的第一位原因；随着世界人口向老龄化的不断推进，脑血管病日益增多，血管性痴呆发病率有逐渐上升的趋势，严重影响老年人的工作和生活质量，并给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。因此，VD已成为当今老年医学与精神医学领域中一个重要的研究热点。血管性痴呆由于发病机制复杂，尚无能够阻断疾病发展的药物，目前临床治疗以改善脑部血液循环和脑代谢，加强脑部营养为主。

阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD，老年痴呆症）是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经***退行性疾病，其发病率呈逐年上升趋势，成为仅次于心血管病和癌症的高发性疾病，在欧美等发达国家已上升为死亡原因的第四位。据世界卫生组织报告，全球65岁以上老人有10%智力障碍，其中二分之一发生痴呆，八十五岁以上发病率近50%。目前，我国AD患病人数已超过500万，这种疾病目前尚无有效治疗手段，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大。由于AD临床表现为记忆能力、定向能力、思维和判断能力减退，以及日常生活能力降低，甚至出现异常精神行为症状等，使患者护理难度较大，给社会及家庭带来沉重压力，因而，研究开发新型老年痴呆治疗药物意义重大。从市场需求来看，世界市场研究和战略顾问公司新近完成的“老年痴呆症报告”预测，到2015年老年痴呆症治疗药物的全球销售额将达100亿美元；在我国，随着老年痴呆症发病率的迅速上升，这类药物的市场也开始膨胀。然而目前用于治疗该疾病的药物存在种类较少、作用靶点单一、毒副作用较多、长期疗效欠佳等问题。因此，研究开发具有新型作用机制、高效、低毒副作用AD治疗药物不仅符合社会老龄化进程的迫切需求，而且具有良好的市场前景。寻找和发现具有新型作用特点的AD治疗药物，对于开发具有自主知识产权的新药也有着非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于公开一类水杨酸类化合物及其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防神经退行性相关疾病的药物中的用途，包括但不限于血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森症、亨廷顿症、HIV相关痴呆症、多发性硬化症、进行性脊髓侧索硬化症、神经性疼痛、青光眼等神经退行性疾病。

本发明的另一目的在于公开包含此类水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。

本发明所公开的水杨酸类化合物选自如下1-17所示的化合物：

所述药学上可接受的盐是指其羧基与相应的碱反应所形成的盐，这些盐选自：钾盐、钠盐、锂盐、钙盐、镁盐，其具体制备方法为本领域技术人员所公知的常规方法。

本发明所公开的药物组合物包括治疗有效量的一种或多种如上所示的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐，该药物组合物可进一步含有一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。所述“治疗有效量”是指引起研究者或医生所针对的组织、***或动物的生物或医药反应的药物或药剂的量；所述“组合物”是指通过将一种以上物质或组份混和而成的产品；所述“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的物质、组合物或载体，如：液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包囊物质，它们携带或转运某种化学物质。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1. 化合物 1对老龄SAMP8小鼠学习记忆功能障碍的影响（跳台实验）。结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图2. 化合物 1对老龄SAMP8小鼠学习记忆功能障碍的影响（迷宫实验）。结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图3. 化合物 1对老龄SAMP8小鼠脑组织中丙二醛（MDA）的影响。结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图4. 化合物 1对老龄SAMP8小鼠脑组织中抗氧化酶SOD活性的影响。结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图5. 化合物 1对老龄SAMP8小鼠大脑组织中Aβ₄₂含量的影响。结果表示为均数±标准差（n =12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图6. 化合物 1对血管性痴呆大鼠认知功能障碍的影响（隐匿平台实验与新平台实验）。每组动物潜伏期表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图7. 化合物 1对血管性痴呆大鼠认知功能障碍的影响（探索平台实验）。每组动物在平台所在象限停留时间表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图8. 化合物 1对血管性痴呆大鼠大脑神经元的保护作用。结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

图9. 化合物 1抑制血管性痴呆大鼠大脑皮层胶质细胞的激活。小胶质细胞OX-42及星形胶质细胞GFPA的表达水平分别经定量图像分析，结果表示为均数±标准差（n = 12）。与模型组比较，* P <0.05，** P <0.01。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1 药物对神经细胞的保护作用

采用MTT法筛选本发明所公开的化合物对过氧化氢诱导的PC12神经细胞损伤的保护作用。PC12神经细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，用含10%FBS的DMEM培养基、在37℃的含5% CO₂饱和湿度的细胞培养箱中常规培养。取对数生长期状态良好的细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，计数为5×10⁴个/mL，细胞接种体积为100 μL/孔，置于培养箱内培养。24小时后，加入不同浓度的本发明所公开的化合物溶液（终浓度为1、10 μM），每组6个复孔。预孵育2小时后，模型组与给药组分别加入100 μM过氧化氢，30分钟后，将各组的培养液均换成无血清培养液继续常规培养24小时后，每孔加入5 mg/mL 的MTT 溶液10 μL/孔，进行活细胞染色。37℃下孵育4小时，小心吸去孔内上清，然后每孔加入100 μL DMSO，充分溶解混合，酶标仪490 nm波长测各孔光吸收值（OD值）。各组数值表示为均数±标准差，实验重复3次。用Duncan’s test方法统计，以对照组为100%，模型组与给药组的OD值以对照组的百分比表示。结果见表1。

结果表明，本发明公开的化合物对过氧化氢所致的神经细胞损伤均有不同程度的保护作用。

表1. 本发明公开化合物对过氧化氢诱导神经细胞损伤的保护作用

注：化合物编号与上述“发明内容”中的化学结构式编号对应。

实施例2 药物对老年痴呆模型SAMP8小鼠的神经保护作用

1. 实验材料

清洁级39周龄雄性SAMP8老年痴呆小鼠36只，体重30g ± 2g；同龄SAMR1抗老化小鼠12只，均由天津中医药大学第一附属医院提供（动物合格证号：W - J津实动质M准字第006号）。常规饲养于四川大学华西药学院动物房。

试剂和药品：本发明公开化合物 1，纯度>99%，临用前配制所需浓度使用。其余试剂均为市售分析纯。

2. 方法与结果

2.1 动物分组及给药

所有小鼠给药前适应实验环境7天，随机分为模型组、药物低剂量组、药物高剂量组，以同龄SAMR1小鼠作为正常对照组，每组12只。药物治疗组分别灌胃给予60 mg/kg或20 mg/kg，1天1次，连续给药8周。模型组与正常组同法给予等量空白溶媒。实验结束时，进行小鼠行为学测试。行为学测试完毕后，小鼠脱臼处死，快速分离大脑，用于测定老年痴呆相关指标。实验数据均以均数±标准差表示，实验结果采用SPSS16软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析LSD法，以P＜0.05为显著性差异。

2.2 行为学测试

① 跳台实验：采用跳台仪（中国科学院药物研究所）盲法测定动物学***台，多数小鼠可能再次跳回铜栅，受电击后又跳上平台。记录小鼠第1次跳下的潜伏期（即将小鼠放于平台上起，至小鼠第1 次双足接触铜栅的时间间隔）和接下来5分钟内小鼠双足同时接触铜栅即受电击的次数，记为错误次数，以此作为学习能力测试成绩。24小时后重复实验，并将该次错误次数作为记忆能力测试成绩。结果见图1。

由图1可见，在跳台实验学习记忆能力测试中，与SMAR1正常组相比，SMAP8模型组小鼠错误次数明显低于正常组（P<0.01）；与模型组比较，药物高剂组错误次数显著降低（P<0.01），而药物低剂组错误次数有一定降低趋势但无显著性差异（P>0.05）。

② Y型迷宫测试：采用Y型迷宫刺激器（江苏青松生物医学仪器厂）盲法测定动物记忆能力。实验装置为1 个由不透明塑料板制成的Y 型迷路箱，将其与可调变压器相连,电压为36 V。通过电击控制器,可使由3条支臂末端长18 cm 段相互围成的区域,交替作为起步区或安全区，且安全区末端会亮灯作为给予小鼠的正确方向刺激信号。测试时将小鼠放入起步区，操纵电击控制器，小鼠遭到电击后，若直接逃至安全区为正确反应，否则为错误反应。第一天测试小鼠10次，记录10次中正确反应次数作为学习能力测试成绩，于24小时后进行相同测试，记录正确反应次数作为记忆能力测试成绩。结果见图2。

由图2可见，在Y型迷宫实验记忆能力测试中，与SMAR1正常组相比，SMAP8模型组小鼠正确次数明显低于正常组（P<0.01）；与模型组比较，药物高剂组的正确次数显著增加（P<0.01），而药物低剂组的正确次数有一定增加趋势但无显著性差异（P>0.05）。

2.3 氧化损伤评价

取新鲜大脑组织，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书检测脂质氧化损伤指标丙二醛（MDA）含量。结果见图3。

由图3可见，与正常组相比，模型组小鼠脑组织MDA水平显著升高（P<0.01）；与模型组相比，药物有剂量依赖性降低MDA含量作用，其中高剂量组有非常显著的统计学差异（P<0.01）。

2.4 抗氧化酶活性检测

取动物脑组织，用冰生理盐水制成10%的组织匀浆，按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书检测脑组织超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果见图4。

由图4可见，与正常组相比，模型组小鼠脑组织SOD活性显著降低（P<0.01）；与模型组相比，药物有剂量依赖性升高SOD活性的作用（P<0.05或P<0.01）。

2.5 Aβ₄₂含量的检测

采用ELISA方法测定药物对AD小鼠脑内Aβ₄₂含量的影响。取新鲜大脑组织，加入四倍体积的冰PBS（添加蛋白酶抑制剂混合物）制备组织匀浆，加入82 mM Tris-HCl溶液（pH 8.0）。脑内Aβ₄₂含量通过小鼠Aβ₄₂ELISA试剂盒（Invitrogen公司）测定，操作按照试剂盒说明书进行：每孔分别加入标准品或样品100 μl，室温孵育2小时，弃上清，清洗4次；加入检测抗体100 μl，室温孵育1小时，弃上清，清洗4次；加酶标抗体50 μl，室温孵育30分钟，弃上清，洗液清洗4次；加入底物100 μl，室温孵育30分钟后，加100 μl终止液，酶标液450 nm波长测OD值，按照标准曲线计算Aβ₄₂含量。结果见图5。

由图5可见，与正常组相比，AD模型组小鼠脑内Aβ₄₂含量显著升高（P<0.01）；与模型组相比，药物有剂量依赖性降低Aβ₄₂水平的作用，其中高剂量组有非常显著的统计学差异（P<0.01）。

实施例3  药物对血管性痴呆大鼠的神经保护作用

1. 实验材料

雄性Wistar大鼠，体重280~300 g，购自四川大学动物实验中心。常规饲养于四川大学华西药学院动物房。

试剂和药品：本发明公开化合物1，纯度>99%，临用前配制所需浓度使用。其余试剂均为市售分析纯。

2. 方法与结果

2.1 动物造模、分组及给药

大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉（350 mg/kg），分离两侧颈总动脉、结扎，假手术正常组不结扎双侧颈总动脉。术后7天，行5天水迷宫测试的隐匿平台筛选实验，以动物第五天的潜伏期作为筛选指标：

SR=（手术组平均潜伏期－正常组平均潜伏期）/正常组动物的均潜伏期。

以SR<0.2筛选神经行为功能障碍的模型成功动物，随机分为正常组、模型组、药物高剂量组（45 mg/kg）和低剂量组（15 mg/kg），每组12只。术后第13天开始灌服给药，正常组和模型组给予等体积溶媒；连续给药3周后，行水7天迷宫测试实验以评价药物对血管性痴呆大鼠神经行为功能的影响。行为学测试完毕后，动物麻醉后，依序用PBS（pH 7.4）及4%多聚甲醛溶液经心脏快速灌流，迅速开颅取脑，10%中性甲醛固定24 小时，石蜡包埋，制作厚度约5 μm的脑部冠状切片，用于神经病理组织学检查。实验数据均以均数 ± 标准差表示，实验结果采用SPSS16软件进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析LSD法，以P < 0.05为显著性差异。

2.2 神经行为功能测定

采用Morris水迷宫测试方法评价药物对血管性痴呆大鼠空间学***台，平台与圆心和池壁等距，平台为白色圆形，直径10 cm，高20 cm，平台位于水面下2 cm。池水温度保持在25 ± 2℃，水内加入适量食品添加剂白色素，使池水呈不透明的乳白色，动物不能通过视觉到达平台，以便检测动物对空间位置的敏锐性。水池正上方有一个摄像头，摄像头与电脑相连，通过电脑记录池内动物活动情况。给药后水迷宫实验连续进行7天，第1-2天为隐匿平台实验，记录大鼠找到平台的时间（潜伏期）；第3天为探索平台实验（即移去平台），大鼠入水点位置不变，记录大鼠在原平台位置所在象限的停留时间及穿越次数；第4-6天为新平台实验（即平台位置改变），大鼠入水点位置不变，记录大鼠找到平台的时间（潜伏期）；第7天为可见平台实验，大鼠入水点位置不变，记录大鼠找到平台的时间（潜伏期）。结果见图6~7。

Morris水迷宫是一种依赖海马区记忆功能的实验，主要用于脑缺血性损伤所致认知功能障碍的评价。认知功能一般包括三个阶段：获得、巩固和记忆。在我们的实验中，隐匿平台实验检测获得功能，新平台实验检测学***台实验检测记忆功能。由图6~7可见，与模型组比较，药物治疗组大鼠在隐匿平台和新平台的潜伏期明显缩短，而在探索平台实验中，动物在原平台象限的停留时间及穿越次数明显延长。实验结果证实了药物治疗能剂量依赖性地明显改善由大脑长期低灌注导致的血管性痴呆的认知功能障碍。此外，可见平台实验结果表明，各组间平台潜伏期无明显差异，从而排除手术对动物视觉及运动能力的影响，进一步证实了药物对血管性痴呆的治疗效果。

2.3 神经元损伤的检测

通过免疫组化方法检测VD动物大脑皮层与海马区的神经元核抗原(NeuN)表达水平，评价药物对VD动物大脑神经元损伤的影响。取每只动物大脑冠状石蜡切片，二甲苯脱蜡，3%的H₂O₂灭活内源性过氧化物酶后，滴加5%BSA封闭液，37℃孵箱孵育1 小时后，分别加入NeuN 多克隆抗体 (1:200，北京博奥森生物技术有限公司)，37℃孵育2 小时后移置于4℃冰箱过夜。加入生物素化羊抗小鼠二抗、 37℃孵育1 小时，再加入SABC、37℃孵育1 小时后，DAB显色、苏木素复染。常规脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在400倍光学显微镜下，盲法观察并记录皮层及海马区3个不重叠的区域阳性细胞数，计算每张切片平均值，以对照组为100%，模型组与给药组的阳性细胞数以对照组的百分比表示。结果见图8。

由图8可见，与正常组比较，模型组的皮层及海马区的NeuN免疫阳性的神经元细胞数量显著降低（P<0.01）；与模型组相比，药物可剂量依赖性增加神经元细胞数量（P<0.05或P<0.01）。本实验结果表明，药物可抑制血管性痴呆大鼠大脑神经元细胞的损伤，这与药物可改善Morris水迷宫实验中血管性痴呆大鼠认知功能的结果相符。我们发现药物可改善血管性痴呆的神经病理学改变与认知功能障碍。

2.4 胶质细胞激活的检测

取每只动物大脑冠状石蜡切片，二甲苯脱蜡，3%的H2O2灭活内源性过氧化物酶后，滴加5%BSA封闭液，37℃孵箱孵育1小时后，分别加入OX-42多克隆抗体 (1:200，Millipore公司，USA) 或GFAP多克隆抗体（1:100，武汉博士德生物工程有限公司），37℃孵育2小时后移置于4℃冰箱过夜。加入生物素化羊抗小鼠二抗、37℃孵育1小时，再加入SABC、37℃孵育1 小时后，DAB显色、苏木素复染。常规脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。免疫组化染色用Axiovert 40 CFL显微镜采图：在400倍光学显微镜下，每张切片在大脑皮层固定位置选取3个不同区域采图，用Image Pro-plus5.0软件分析免疫反应阳性细胞的累积光密度值(IOD)，计算每张切片IOD平均值，每组结果以均数±标准差表示。结果见图9。

由图9可见，与正常组比较，模型组皮层的OX-42与GFAP的表达水平均显著增加（P<0.01）；与模型组相比，药物可剂量依赖性降低OX-42与GFAP的表达，其中高剂量组有显著的统计学差异（P<0.01）。本实验结果表明，药物可抑制血管性痴呆大鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的活化，通过抑制神经炎症反应对血管性痴呆发挥预防与治疗作用。

Claims (2)

1.一类水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐用于制备治疗和/或预防神经退行性相关疾病药物的用途，其特征在于所述水杨酸类化合物为具有下述化学结构的化合物，其药学上可接受的盐为：钾盐、钠盐、锂盐、钙盐或镁盐，

。

2.如权利要求1所述的水杨酸类化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防神经退行性相关疾病的药物中的用途，其特征在于神经退行性相关疾病为血管性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森症、亨廷顿症、HIV相关痴呆症、多发性硬化症、进行性脊髓侧索硬化症、神经性疼痛或青光眼。