CN105985962B - 特异性靶向类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，提供了一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子，所述适配子具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列；本发明进一步提供了所述适配子在制备识别炎性滑膜细胞的生物探针的应用和在制备靶向性抗类风湿性关节炎药物或药物载体的应用。本发明所述适配子对炎性滑膜细胞的具有高选择性，且消除或弱化了与肝细胞结合；含有本发明适配子的生物探针可识别体外人炎性滑膜细胞，如RA病人滑膜组织切片中的炎性滑膜细胞，为临床RA诊断和靶向治疗提供了依据。

Description

特异性靶向类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性靶向人体类风湿关节炎炎性滑膜细胞的单链DNA适配子及其应用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种以多关节滑膜炎症性病变为特征的慢性全身性自身免疫性疾病，号称″致残疾病之首″，被世界医学界称为不死的癌症，已成为21世纪威胁人类健康的四大顽疾之一。RA在成人中发病率较高，每10万成年人口中约有20-40％的发病率。研究显示，10％的RA患者在发病2年内即可出现严重的功能障碍，约50％的患者在患病10年后丧失劳动能力。目前，我国RA患者年人均疾病费用达13506元人民币，占当年人均国内生产总值(GDP)的51％，给患者和社会都造成严重的经济负担。

RA至今尚无特效治疗方法。传统的抗风湿药物包括非甾体抗炎药、激素、抗风湿药等疗效不高，且存在毒副作用及耐药性。新型生物制剂可有效改善RA病情，成为近年来RA治疗的新里程碑。肿瘤坏死因子(TNF)抑制剂已经成为针对RA的共识性生物治疗剂。然而，接受TNF抑制剂治疗的患者存在严重感染等并发症的风险，限制了临床应用。因此，开发具有高效、低毒的抗RA替代药物尤为必要。

寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段，其作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。SELEX(systematicevolution of ligands by exponential enrichment)技术是九十年代发展起来的一种新的体外筛选技术，它运用大容量的随机寡核苷酸文库，并结合体外PCR扩增技术，以指数富集与靶分子 特异结合的寡核苷酸，经过多轮筛选，获得高亲合力、特异性强的寡核苷酸适配子(aptamers)，已成功运用于许多靶分子的筛选，包括金属离子、有机染料、蛋白质、药物、氨基酸以及各种细胞因子等，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子和朊病毒等。这种方法具有简便、快速、经济等特点，与其他组合化学库如随机肽库、抗体库和噬菌体表面展示文库相比，从寡核苷酸文库中筛选出的适配子具有更高的亲合性和特异性，近年来核酸适配子不断被应用于基础研究、药物开发、临床应用等方面，具有良好的应用前景。特异结合于病变细胞的核酸适配子有利于疾病的诊断和治疗。与抗体相比，适配子有如下优点：化学稳定性高，可以耐受80℃的高温，可在蛋白药物不能耐受的各种溶剂和恶劣条件下储存；无免疫原性，可反复给药，安全性优于单克隆抗体；批间差异小，质量稳定，有利于工业化生产；容易进行各种化学修饰，便于扩展其应用范围；相对分子质量小，容易渗透入组织内部。基于上述优势，适配子在很多生物应用方面可以替代抗体。适配子出现十多年来，已应用于酶联寡核苷酸实验、流式细胞仪、适配子芯片(aptamer chip)、蛋白定量及蛋白纯化等体外实验，同时具有可在体内抑制生长因子和受体的相互作用或抑制酶活性等功能，还可进行体内成像等。适配子可作为诊断和治疗试剂，用于诊断时可识别与结合特定靶分子，用于治疗时可作为靶向输送、功能阻断物质或者直接阻断疾病进程。CN 200610015738.0公开了一组与人乳腺癌组织高特异性和高亲和力的核酸适配子及其制备方法与应用；CN201210224174.7公开了一种用于血小板衍生生长因子检测的核酸适配子分子信标探针；CN201410468490.8公开了一种心肌肌钙蛋白I核酸适配子及其应用、试剂盒；CN201010295767.3公开了一种特异识别志贺氏菌的核酸适配子及其筛选方法与应用；CN201210240284.2公开了一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用。

然而到目前为止，尚未发现成功将SELEX筛选技术用于开发类风湿关节炎诊断试剂及治疗药物的报道。

发明内容

针对以上技术情况，本发明提供了一种特异性、高亲和力结合人类风湿关节炎炎性滑膜细胞膜表面的单链DNA适配子，所述适配子具有如下SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列：SEQ ID NO.1：5’-GCAAC CAGGG GAACC GGGGA ATTGGAACGC TTTCC TCCCG TTGGC-3’；所述适配子具有图4示二级结构。

本发明还提供了一种特异性靶向炎性滑膜细的适配子的筛选方法，所述方法包括：

(1)随机ssDNA文库的构建和引物的合成

构建长度为81nt的随机文库，两端为固定序列，中间为45个核苷酸随机序列，库容量大约为IO¹⁵-IO¹⁶，根据随机ssDNA文库两端固定序列设计上下游引物。

ssDNA文库的序列：5′-ATCCAGAGTGACGCAGCA-(45N)-TGGACA CGG TGG CTT AGT-3′，其中N代表A，T，C，G四个随机碱基；

上游引物P1：5′FITC-ATC CAG AGT GAC GCA GCA-3′；

下游引物P2：5′Biotin-ACTAAG CCA CCG TGT CCA-3′；

(2)SELEX筛选

靶细胞(人成纤维滑膜细胞)和负筛选细胞(肝细胞)的培养；

靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育；

与靶细胞结合ssDNA的扩增；

链酶亲和素磁珠法制备ssDNA文库；

重复上述过程，共进行8-12轮筛选；

(3)流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况

制备FITC标记ssDNA；

靶细胞的处理；

靶细胞与FITC标记ssDNA孵育；

流式细胞术检测，通过荧光强度值的大小比较富集的情况。

(4)克隆与测序

经多轮筛选得到的ssDNA用PCR扩增dsDNA，回收纯化连接T载体，经蓝白斑筛选，随机挑选多个克隆进行序列测定。

(5)DNA适配子一、二级结构分析和预测及同源序列分析。

作为本发明实施方案之一，所述筛选方法进一步包括：

(6)DNA适配子特异性的鉴定

流式细胞术检测DNA适配子与靶细胞(人成纤维样滑膜细胞)结合的亲和力解离常数Kd；

DNA适配子特异性的鉴定通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与人成纤维样滑膜细胞、肝细胞及人Kupffer细胞的亲合力以鉴定其特异性。

DNA适配子体外选择性鉴定

通过荧光显微镜成像和流式荧光强度变化，初步分析ssDNA适配子对靶细胞的选择性。

作为本发明实施方式之一，所述筛选方法中的人成纤维样滑膜细胞包括但不限于MH7A细胞。

作为本发明实施方式之一，所述筛选方法中的肝细胞包括但不限于L-02细胞。

作为本发明实施方式之一，所述特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子的筛选方法包括：

(1)合成随机单链DNA文库和引物

随机文库：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-(45N)-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’

5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’

3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’

(2)SELEX筛选

人成纤维样滑膜细胞MH7A(靶细胞)和人肝细胞L-02(负筛选细胞)细胞培养及筛选前处理。采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按2×10⁵个细胞接种于P100培养皿中培养，当细胞的融合率达到95％即可用于文库的筛选。

靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育及筛选

收集约1×10⁶个MH7A细胞，用Washing Buffer(DPBS+CaCl₂+MgCl₂)洗涤细胞2次，Binding Buffer(DPBS+CaCl₂+MgCl₂+tRNA)洗涤细胞一次；

将上述文库8nmol与洗涤后的靶细胞在37℃孵育1h，用Washing Buffer洗涤细胞2次，向细胞沉淀中加入超纯水500ul，95℃水浴10min，

于4℃，13600g离心10min，收集上清，上清中含有第一轮筛选特异结合的ssDNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80℃冻存备用。

第一轮筛选后的单链DNA文库PCR扩增

通过上、下游引物将单链DNA文库扩增为双链DNA文库，扩增条件为：于95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共12个循环，72℃延伸3min；

将双链DNAPCR产物作为模板，进行第二次扩增循环数摸索，扩增条件为：

95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，分别扩增6、10、14、18、22、26、30个循环，72℃延伸3min；

将PCR扩增产物行3％凝胶电泳鉴定，选择最佳扩增循环数5；

按照上述PCR条件把剩余的第一次PCR产物继续扩增循环数为5(图1)；

链霉亲和素磁珠法分离单链DNA制备第二轮筛选亚文库；

按下列条件大量扩增双链DNA以备制备单链；

采用链酶亲和素磁珠方法分离制备ssDNA；

用1×PBS将链酶亲和素磁珠洗涤3次，PCR产物溶于ddH₂0中，与磁珠在室温下孵育1h，通过带生物素标记的一条链与链霉亲和素磁珠结合；1×PBS洗涤3次，加入0.25mol/LNaOH于室温下变性5min，与靶细胞结合的另一条链被游离出来；上磁力架，室温3min，吸取上清转入EP管中，加入一定体积的浓HCl中和，核酸定量仪测ssDNA浓度，用于下一轮筛选。

筛选的第4轮引入负筛选细胞进行消减cell-SELEX筛选；

将第4轮筛选的ssDNA文库于95℃变性5min后立即置于冰上充分冷 却备用；

取约1×10⁷负筛细胞L-02，用Washing buffer洗涤2次，加入冰浴变性后筛选文库，37℃孵育1h，小心收集结合后上清，获得与消减细胞结合的ssDNA文库即消减文库。

继续按照上述操作进行靶细胞特异结合ssDNA适配子的筛选，并每轮跟随同时负筛选；

(3)荧光显微镜鉴定及流式监测

经约10轮筛选后的FTIC-ssDNA用盐酸HCl中和后，检测浓度，用于流式或荧光显微镜监测各轮富集情况；

流式监测富集情况的靶细胞处理；

将靶细胞用不含胰酶的EDTA液消化，以免损伤细胞膜表面组分，影响核酸适配子与靶细胞的结合；收集MH7A细胞，用PBS洗涤2次，用Binding Buffer重悬细胞并调整为1×10⁶/ml；

靶细胞与FITC标记ssDNA孵育

筛选出文库ssDNA pool与靶细胞MH7A在37℃孵育30min，PBS洗涤细胞3次，加入450ulI×PBS重悬细胞沉淀，上流式检测。

荧光显微镜监测适配子与靶细胞结合情况

接种合适密度的消减细胞和靶细胞于共聚焦小皿中，贴壁过夜生长；用1×PBS轻轻漂洗2次，Binding buffer洗涤一次；加入200ul含FITC-ssDNApool的Bindingbuffer，37℃孵育30min；1×PBS漂洗细胞3次；荧光显微镜下观察结合情况。

(4)载体克隆及测序

反应体系如下(6ul)：1ul(10ng)的PCR4-TOPO vector；1ul的salt solution；最多4ul(30ng)的ssDNA pool轻轻混匀，室温反应30min；冰上或-20℃冻存；

取10ul连接产物加入100ul冰浴的宿主菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃水浴热休克90sec，立即冰浴2min；加入700ul不含抗生素的室温SOC培养基，37℃缓慢振摇45min；取适量体积菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

隔天挑取白色单克隆，进行菌落PCR鉴定并测序。

(5)寡核苷酸适配子一级序列及二级结构分析

利用RNA structure 4.5软件、DNAMAN软件和MEME在线软件。

http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi进行，即得具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的单链DNA适配子：SEQ ID NO.1：5’GCAAC CAGGG GAACC GGGGA ATTGGAACGC TTTCC TCCCG TTGGC3’；所述适配子具有图4示二级结构。

作为本发明实施方案之一、所述方法进一步包括：

(6)DNA适配子特异性的鉴定(参见图3)

通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与人成纤维样滑膜细胞MH7A、人肝细胞L-02及人Kupffer细胞的结合力以鉴定其特异性。

分别制备合成FITC标记的待检测单链寡核苷酸适配子；

用1×PBS洗涤待检上述测细胞，用Binding buffer重悬细胞并分别调整为1×10⁶/ml。

取约400pmol FITC-ssDNA分别与上述细胞孵育约30min；离心小心去上清，用PBS洗涤2次，加450ulPBS轻柔重悬细胞；

流式细胞仪检测，通过荧光强度值比较适配子的结合情况。

本发明进一步提供一种上述单链DNA适配子耦联荧光分子形成的功能化生物分子探针，能识别组织切片中的炎性滑膜细胞；

本发明更进一步还提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备类风湿关节炎靶向诊断试剂中的应用。

本发明本发明更进一步提供了一种上述单链DNA适配子或其衍生物在制备靶向性抗类风湿关节炎药物或靶向输送载体中的应用。

本发明以人成纤维样滑膜细胞MH7A和人肝细胞L-02分别为筛选靶和消减靶细胞，采用消减cell-SELEX技术，筛选出能特异识别人成纤维样滑膜细胞MH7A而不识别人肝细胞L-02的单链DNA适配子、在维持对滑膜细胞高选择性的同时，消除或减弱其与肝细胞可能的结合。

以荧光素或量子点标记的本发明适配子的功能化生物分子探针，可识别体外人炎性滑膜细胞。荧光素或量子点耦联本发明适配子的功能化生物 分子探针可识别RA病人滑膜组织切片中的炎性滑膜细胞，这为临床RA诊断和靶向治疗提供了依据。

附图说明

图1：适配子与MH7A靶细胞结合ssDNA的扩增产物电泳结果；

图2：流式细胞仪监测DNA适配子的各轮筛选富集情况；

图3：荧光标记适配子体外选择性研究；

图4：适配子的二级结构图谱。

具体实施方式

以下实施例用于进一步阐述本发明，但不以任何的方式限制本发明的有效范围。

实施例1

消减cell-SELEX筛选特异结合人成纤维样滑膜细胞MH7A的核酸适配子

(1)合成随机单链DNA文库和引物

随机文库：

5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-45nt-TGGACACGGTGGCTTAGT-3’

5’引物：5’-FITC-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’

3’引物：5’-biotin-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’

(2)SELEX筛选

2.1人成纤维样滑膜细胞MH7A(靶细胞)和和人肝细胞L-02(负筛选细胞)细胞培养及筛选前处理。

采用无酶的细胞消化液处理生长状况良好的细胞，按2×10⁵个细胞接种于P100培养皿中培养，当细胞的融合率达到95％即可用于文库的筛选。

2.2靶细胞、负筛选细胞与ssDNA文库孵育及筛选

收集约1×10⁶个MH7A细胞，用Washing Buffer(DPBS+CaCl2+MgCl2) 洗涤细胞2次，Binding Buffer(DPBS+CaCl2+MgCl2+tRNA)洗涤细胞一次；

将上述文库8nmol与洗涤后的靶细胞在37℃孵育1h，用Washing Buffer洗涤细胞2次，向细胞沉淀中加入超纯水500ul，95℃水浴10min，

于4℃，13600g离心10min，收集上清，上清中含有第一轮筛选特异结合的ssDNA，上清液作为模板可用于PCR扩增，制备下一轮筛选的亚文库。-80℃冻存备用。

第一轮筛选后的单链DNA文库PCR扩增。

通过上、下游引物将单链DNA文库扩增为双链DNA文库，扩增条件为：

于95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，共12个循环，72℃延伸3min；

将双链DNAPCR产物作为模板，进行第二次扩增循环数摸索，扩增条件为：

95℃预变性3min，再进行94℃，30s，56℃，30s，72℃，30s，分别扩增6、10、14、18、22、26、30个循环，72℃延伸3min；

将PCR扩增产物行3％凝胶电泳鉴定，选择最佳扩增循环数5；

按照上述PCR条件把剩余的第一次PCR产物继续扩增循环数为5(图1)；

链霉亲和素磁珠法分离单链DNA制备第二轮筛选亚文库；

按下列条件大量扩增双链DNA以备制备单链；

采用链酶亲和素磁珠方法分离制备ssDNA；

用1×PBS将链酶亲和素磁珠洗涤3次，PCR产物溶于ddH₂0中，与磁珠在室温下孵育1h，通过带生物素标记的一条链与链霉亲和素磁珠结合；

1×PBS洗涤3次，加入0.25mol/L NaOH于室温下变性5min，与靶细胞结合的另一条链被游离出来；上磁力架，室温3min，吸取上清转入EP管中，加入一定体积的浓HCl中和，核酸定量仪测ssDNA浓度，用于下一轮筛选。

筛选的第4轮引入负筛选细胞进行消减cell-SELEX筛选

将第4轮筛选的ssDNA文库于95℃变性5min后立即置于冰上充分冷 却备用；

取约1×10⁷负筛细胞L-02，用Washing buffer洗涤2次，加入冰浴变性后筛选文库，37℃孵育1h，小心收集结合后上清，获得与消减细胞结合的ssDNA文库即消减文库。

继续按照上述操作进行靶细胞特异结合ssDNA适配子的筛选，并每轮跟随同时负筛选。

(3)荧光显微镜鉴定及流式监测

经约10轮筛选后的FTIC-ssDNA用盐酸HCl中和后，检测浓度，用于流式或荧光显微镜监测各轮富集情况I.7.2流式监测富集情况的靶细胞处理；

将靶细胞用不含胰酶的EDTA液消化，以免损伤细胞膜表面组分，影响核酸适配子与靶细胞的结合。收集MH7A细胞，用PBS洗涤2次，用Binding Buffer重悬细胞并调整为1×10⁶/ml；

靶细胞与FITC标记ssDNA孵育

筛选出文库ssDNA pool与靶细胞MH7A在37℃孵育30min，PBS洗涤细胞3次，加入450ul 1×PBS重悬细胞沉淀，上流式检测。

荧光显微镜监测适配子与靶细胞结合情况(参见图1)

接种合适密度的消减细胞和靶细胞于共聚焦小皿中，贴壁过夜生长；用1×PBS轻轻漂洗2次，Binding buffer洗涤一次；加入200ul含FITC-ssDNA pool的Binding buffer，37℃孵育30min；1×PBS漂洗细胞3次；荧光显微镜下观察结合情况。

(4)载体克隆及测序

反应体系如下(6ul)：

PCR4-TOPO vector 1ul(10ng)；

salt solution(盐溶液) 1ul；

ssDNA pool 最多至4ul(30ng)；

轻轻混匀，室温反应30min(可以按照上述反应体系适量放大)；冰上或-20℃冻存；

取10ul连接产物加入100ul冰浴的宿主菌感受态细胞中，轻轻混匀， 冰浴30min，42℃水浴热休克90秒，立即冰浴2min；加入700ul不含抗生素的室温SOC培养基，37℃缓慢振摇45min；取适量体积菌液涂布于LB/Amp/IPTG/X-gal平板上，37℃培养箱中倒置培养过夜。

隔天挑取白色单克隆，进行菌落PCR鉴定并测序。

(5)寡核苷酸适配子一级序列及二级结构分析

利用RNA structure 4.5软件、DNAMAN软件和MEME在线软件。

http：//meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi进行，即得具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的单链DNA适配子：SEQ ID NO.1：5’GCAAC CAGGG GAACC GGGGA ATTGGAACGC TTTCC TCCCG TTGGC3’；所述适配子具有图4示二级结构。(参见图4)

(6)DNA适配子特异性的鉴定(参见图2-3)

通过流式细胞术检测筛选得到的DNA适配子与人成纤维样滑膜细胞MH7A、人肝细胞L-02及人Kupffer细胞结合力以鉴定其特异性。

分别制备合成FITC标记的待检测单链寡核苷酸适配子；

用1×PBS洗涤待检上述测细胞，用Binding buffer重悬细胞并分别调整为1×10⁶/ml。

取约400pmol FITC-ssDNA分别与上述细胞孵育约30min；离心小心去上清，用PBS洗涤2次，加450ulPBS轻柔重悬细胞；

流式细胞仪检测，通过荧光强度值比较适配子的结合情况。

Claims (4)

1.一种特异性靶向人类风湿关节炎炎性滑膜细胞的适配子，其特征在于，所述适配子为如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，并为图4所示二级结构。

2.权利要求1所述的适配子用于制备识别炎性滑膜细胞的生物探针的应用。

3.权利要求1所述的适配子用于制备靶向性抗类风湿性关节炎药物的应用。

4.权利要求1所述的适配子作为靶向炎性滑膜细胞的药物载体的应用。