CN102766623B

CN102766623B - 玉米耐旱种质鉴定和筛选caps标记及其检测方法和应用

Info

Publication number: CN102766623B
Application number: CN 201210235665
Authority: CN
Inventors: 郝转芳; 翁建峰; 李明顺; 梁晓玲; 柳思思; 阿布来提; 邵红雨; 韩登旭; 杨杰; 李新海; 张世煌
Original assignee: INSTITUTE OF CEREAL CROPS XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: INSTITUTE OF CEREAL CROPS XINJIANG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES; Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2012-07-06
Filing date: 2012-07-06
Publication date: 2013-12-18
Anticipated expiration: 2032-07-06
Also published as: CN102766623A

Abstract

本发明提供了玉米耐旱种质鉴定的分子标记，所述分子标记包括dhnC397和rspC1090，其中所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ.ID No 2所示。本发明提供的分子标记及其方法用于耐旱标记辅助选择，开辟了耐旱分子标记应用于育种工作的先河。同时本发明提供的分子标记也将大大提高育种中耐旱的选择效率，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

Description

玉米耐旱种质鉴定和筛选CAPS标记及其检测方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及玉米耐旱种质鉴定和筛选的CAPS（C1eaved Amplified Polymorphic Sequences）标记及其检测方法和应用。

背景技术

玉米目前已成为世界和我国播种面积最大的禾谷类作物。随着全球畜牧业迅速发展和应用玉米加工液体燃料乙醇工业的迅速攀升,对玉米的需求量大幅度增加。然而，全球性气候变化引发干旱发生周期越来越短，程度越来越重，对粮食生产构成严重威胁。据统计，每年因干旱造成玉米减产约20%～30%，干旱已成为玉米产量的重要限制因素（苏治军等，2010）。尽管传统育种技术在作物遗传改良方面取得了显著成就，但由于其选择效率较低、周期较长，已不能满足当前玉米生产对优良品种的需求。利用基因组学和生物信息学的最新研究成果，开展玉米分子标记育种研究，构建实用、经济、高效的分子育种技术体系，选育高产优质多抗玉米新品种，已经成为玉米育种的重要研究方向（李建生等，2007）。

耐旱性是一个非常复杂的数量性状。分子数量遗传学的发展促进了分子标记的更新和高密度遗传连锁图谱的构建，发掘出大量与数量性状相关的QTL（Quantitative Trait Loci），同时也促进了MAS(Marker-assisted selection)在数量性状选择上的应用。MAS是通过利用与目标性状紧密连锁的DNA分子标记对目标性状进行间接选择的现代育种技术，可以使育种家无需测定表型就能够追踪调控耐旱性状的遗传位点，可免去多年多点的大量田间测试工作，提高选择效率。Bernier等（2009）指出QTL效应在不同的群体和环境中缺乏重复性是限制了QTL在MAS上应用的两个重要因素。此外，验证耐旱基因和在基因内开发有效的标记十分困难。因此，一方面利用一致性耐旱QTL及其潜在的基因是解决辅助育种一种有效途径（Hao et al.,2010）。另一方面使用功能基因内部引起表型性状变异的多态性基序开发出来功能标记将更有效地固定群体中的优异等位基因，并由此开发的功能标记将在育种中有助于对不同背景遗传材料的性状选择（Hao et al.,2011）。

酶切扩增多态性序列（C1eavedAmplified Polymorphic Sequences，CAPS）又称为RFLP-PCR技术，是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物，将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术，即属于以PCR为基础的共显性的分子标记。它的基本原理是先用已知位点的DNA序列去设计一套特异性的PCR引物（19~27bp）。然后应用这些引物去扩增该位点上的某一DNA片段；接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得的扩增带并进行RFLP分析。与以杂交为基础的RFLP相比，它具有如下优点:（1）引物与限制酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖凝胶电泳分析；（2）在真核生物中，CAPS标记呈共显性，即可区分纯合基因型和杂合基因型；（3）所需DNA量少；（4）结果稳定可靠；（5）操作快捷、自动化程度高。

CAPS标记技术因具有共显性、位点特异性、操作简单、成本低、所需DNA样品量少和对DNA的纯度要求不高等优点，因此受到了科研人员的重视。目前已成为现代生物学研究的一个非常重要的分子标记技术，在种质鉴定、辅助育种、基因鉴定和图谱构建等领域得到相当广泛的应用。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于筛选出玉米耐旱种质鉴定和筛选的CAPS标记。

本发明的另一目的在于提供上述分子标记的检测方法。

本发明的还一目的在于提供上述分子标记在耐旱基因检测以及标记辅助育种中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供了一种玉米耐旱种质鉴定的分子标记，所述分子标记包括dhnC397和rspC1090，所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ.ID No2所示。

dhnC397和rspC1090两个标记是基于玉米耐旱基因dhn1和rsp41基因多态性基序开发的。其中，dhnC397是基于dhn1基因中G/A碱基突变而开发的一种功能性分子标记。根据dhn1基因序列信息设计特异性引物，扩增出一段长度为164bp的片段。图1中，在基因序列397位点处发生了G与A的变异（CCAAGG/CCAAAG），限制性内切酶StyI可以识别CCAAGG。PCR产物经StyI酶切后，含有G位点的目的片段被酶切成131bp和33bp的两个片段，而含有A位点的目的片段由于缺少StyI酶切识别位点，因此不能被酶切。其中，rspC1090是基于rsp41基因中G/A碱基突变而开发的一种功能性分子标记。根据rsp41基因序列信息设计特异性引物，扩增出一段长度为286bp的片段。图2中，在基因序列1090位点处发生了G与A的变异（CCGG/CCAG），限制性内切酶HpaII可以识别CCGG位点。PCR产物经HpaII酶切后，含有G位点的目的片段被酶切成225bp和61bp的两个片段，而还有A位点的目的片段由于缺少HpaII酶切识别位点，因此不能被酶切。

本发明还提供了扩增上述述分子标记的引物。

所述dhnC397的引物序列如SEQ.ID No3和SEQ.ID No4所示，所述rspC1090的引物序列如SEQ.ID No5和SEQ.ID No6所示。

本发明还提供了含有所述分子标记的载体。所述载体为植物、组织或细胞等。

一种利用分子标记进行玉米耐旱种质鉴定和筛选的检测方法，该方法所用的分子标记为dhnC397和rspC1090。

具体的，上述检测方法的步骤为：利用所述分子标记的引物扩增目标植物基因组DNA，得到该分子标记在目标植物中的特征谱带，所述携带目标等位基因型的植株谱带所测得的核苷酸序列为所述的分子标记的核苷酸序列。所述植物优选为玉米，所述目标植物基因组DNA优选为耐旱和不耐旱玉米基因组DNA。

优选的，上述检测方法的步骤为：利用上述分子标记的引物扩增耐旱和不耐旱基因组DNA，得到该分子标记在玉米中的特征谱带，该特征谱带分为耐旱优异等位基因型的植株谱带和不耐旱等位基因型的植株谱带，所述携带耐旱优异等位基因型的植株谱带所得到的核苷酸序列为上述的分子标记的分子标记的核苷酸序列。

上述方法中，PCR反应扩增体系为：

20μL反应体系包括正、反向引物各0.5μM，0.2mM dNTPs，2.5mM MgCl₂,1X Taq buffer，0.5units Taq聚合酶，DNA模板100ng。

上述方法中，PCR扩增程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃或60℃退火45s,72℃延伸30-60s,37个循环;72℃延伸5-10min。

Sty I酶切反应体系：

Hpa II酶切反应体系：

37℃反应12-16h，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（8％）。

本发明还提供了所述分子标记在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种中的应用

本发明还提供了所述检测方法在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种中的应用。

本发明具备的有益效果在于：

1）本发明的分子标记可用于耐旱种质检测和标记辅助育种。本发明提供的分子标记信息主要来源于一致性通用耐旱QTL或耐旱功能基因，可靠性强。非常适合现代农业分子育种的实现。

2）本发明开发的功能标记，与耐旱基因功能多态性位点相关，直接用于耐旱分子标记辅助育种，本发明为复杂数量性状功能标记的开发和应用提供了重要的理论基础和实践经验。

3）本发明的提供的分子标记用于耐旱标记辅助选择，集所有标记耐旱特征谱带的材料将为耐旱材料，为耐旱性分子标记引物应用于育种工作中开辟先河。并将大大提高育种中耐旱的选择效率，具有很大的应用潜力和较高的经济价值。

附图说明

图1为本发明dhnC397功能标记扩展示意图。

图2为本发明rspC1090功能标记扩展示意图。

图3为dhnC397功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。

图4为rspC1090功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1利用功能基因多态性基序设计和开发CAPS功能标记

材料:试验选用210份我国玉米生产和育种中的常用自交系（Hao et al.,2011）。这些自交系分别来源于不同玉米生态区，属于不同的杂种优势亚群，具有广泛的遗传基础。这些自交系来源于BSSS、PA、PB、Lan（兰卡斯特）、LRC（旅大红骨）和SPT（四平头）这六个亚群。

玉米耐旱全基因组关联分析：根据基因芯片技术，利用1536SNP（SingleNucleotide Polymorphism）多态性信息。采用TASSEL软件中混合线性模型（Mixed Linear Model,MLM）方法对关联数据进行分析发现，在玉米10条染色体上121个多态性SNPs位点与耐旱相关性状相关联。在这些显著关联位点中，29个SNP位点被认为与耐旱有关。因此，它们被认为具有潜在的耐旱功能变异。本研究中，选取了2个与多个耐旱性状密切相关的SNP位点，分别为PZA0355.1和PZA01671.1。PZA0355.1是含有A/G位点变异，位于6号染色体，与其相关的基因为dhn1；PZA01671.1位于5号染色体，含有A/G碱基突变，与rsp41基因有关联。这两个基因都被证实与作物的耐旱性有关（Hao etal.，2011）。

对现有的SNP相关ID序列信息，根据自己的要求，利用在线工具（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）分析最佳酶切位点和选择限制性内切酶。而后利用NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的BLAST功能寻找同源信息最高的序列信息。然后用DNAMAN软件将下载的序列打开，并与SNP ID序列（100bp）比对，找出突变SNP位点两侧附近延伸碱基序列，总长度约500bp。再利用Primer5.0软件，固定SNP位点一端（带改变碱基的酶切位点）的引物，使突变位点为PCR扩增延伸的第一个碱基，而后用该软件需找另一端合适的引物；要求，退火温度（Tm）值约60℃，将上、下游引物TM值调至相近，产物大小为90-140bp左右。将设计的引物下载，并在其中固定的一条引物链中，根据所选择的限制性内切酶，变化相应的1-2个碱基，复查后合成引物。CAPS标记引物则可根据序列信息直接用Primer5.0软件设计引物。

表1根据玉米耐旱基因dhn1和rsp41基因多态性基序开发的两个功能标记、内切酶、引物序列和玉米基因组内扩增片段大小。

对于已设计合成的引物，要经过一系列PCR验证和酶切摸索分析。首先，用芯片材料对合成引物进行预扩产物效果验证，判断扩增条带大小与设计的目的条带是否一致，同时验证引物设计的扩增效果（条带清晰度和稳定性）是否理想，对于不理想的引物重新设计和验证；第二，选择优良的引物扩增芯片材料条带，进行相应的限制性酶切酶反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，判断是否能清晰的区分SNP位点。第三，标记的单克隆及鉴定分析，通过测序对PCR产物进行验证。

实施例2利用CAPS功能标记进行耐旱检测和应用

dhnC397CAPS功能标记耐旱性鉴定分析：通过对210份玉米自交系为试验材料进行基因型验证，除了M14、B104、新自218、2002F22、DP62-7和吉495外，其余的204份自交系在dhnI基因中都能扩增出大小为164bp片段。图3显示了dhnC397功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。对204份自交系进行田间耐旱鉴定，有8份自交系没有获得田间数据（N28、N528-1、金黄59、早8-3、C28、T8、新自153-2和自495）根据综合选择标准值我们将196份自交系的耐旱程度分为5个等级，分别为HR（高耐旱highly drought tolerance），R（耐旱drought tolerance），M（中度耐旱middle drought tolerance），S（旱敏感drought susceptible），HS（高感highly drought susceptible）。对具有田间耐旱表型数据的196份自交系经过StyI酶切后，其中55份自交系被酶切成两条分别为131bp和33bp片段，被确定是G等位变异，同时141份自交系由于缺少酶切识别位点并没有被切开，被确定是A等位变异。从扩增谱带中看出，在G等位变异自交系中含有7份耐旱自交系(HR+R)和24份旱敏感自交系(HS+S)分别占总比例的12.7%和43.6%；A等位变异自交系中含34份耐旱自交系和53份旱敏感自交系所占比例分别为24.1%和37.6%。由此看出含A等位变异自交系的耐旱性（24.1%）高于G等位变异自交系的耐旱性（12.7%）（表2）。含A等位变异自交系（0.01）的耐旱选择指数高于旱G等位变异自交系（-0.26）的0.27（表4）。

表2玉米dhnC397CAPS功能标记检测的自交系耐旱性评价

rspC1090CAPS功能标记耐旱性鉴定分析：通过对210份玉米自交系为试验材料进行基因型验证，除了长3、铁7922、红玉米、DP62-7和5022(B)外，其余的205份自交系在rsp41基因中都能扩增出大小为286bp的目的片段。对205份自交系进行田间耐旱表型鉴定，除去9份没有获得田间数据的自交系（N28、N528-1、2002F22、金黄59、早8-3、C28、T8、新自153-2和自495），剩余的196份自交系经过HpaII酶切后，108份自交系被酶切成两条分别为225bp和61bp片段，同时88份自交系由于缺少酶切识别位点并没有被切开。图4rspC1090功能标记在自交系中扩增的聚丙烯凝胶电泳图。在G等位变异自交系中含有30份耐旱自交系和31份旱敏感自交系分别占总比例的27.8%和28.7%；A等位变异自交系中含10份耐旱自交系和47份旱敏感自交系所占比例分别为11.4%和53.4%。由此看出含A等位变异自交系的耐旱性与含G等位变异自交系的相比，其比较不耐旱（53.4%>28.7%）（表4）。含G等位变异自交系（0.19）的耐旱选择指数高于含A等位变异自交系（-0.37）的0.56。而同时选择两个标记的优势等位变异时，自交系的耐旱选择指数将提高到0.83（表6）。

表3玉米rspC1090CAPS功能标记检测的自交系耐旱性评价

表4210份玉米自交系功能标记检测情况和耐旱性评价

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种利用分子标记进行玉米耐旱种质鉴定和筛选的检测方法，其特征在于，具体步骤为：利用分子标记为dhnC397和rspC1090的引物扩增目标植物玉米基因组DNA，得到该分子标记在目标植物玉米中的特征谱带，所述携带目标等位基因型的玉米谱带所测得的核苷酸序列如SEQ.ID No1和SEQ.IDNo2所示；其中，所述分子标记dhnC397的核苷酸序列如SEQ.ID No1所示，所述分子标记rspC1090的核苷酸序列如SEQ.ID No2所示；所述dhnC397的引物序列如SEQ.ID No3和SEQ.ID No4所示，所述rspC1090的引物序列如SEQ.ID No5和SEQ.ID No6所示；所述分子标记的PCR扩增体系如下：20μL反应体系包括正、反向引物各0.5μM，0.2mM dNTPs，2.5mM MgCl₂,1X Taqbuffer，0.5units Taq聚合酶，DNA模板100ng；所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃-60℃退火45s,72℃延伸30-60s,37个循环;72℃延伸5-10min；PCR扩增后获得的DNA序列用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳即可获得的所述的特征谱带。

2.权利要求1所述方法在玉米耐旱种质鉴定和筛选及分子标记辅助育种中的应用。