CN109338000A - 一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（sad）的caps标记方法 - Google Patents

一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（sad）的caps标记方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，它包括如下步骤：一、基因组DNA提取；二、对SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物设计；三、PCR反应和产物回收及纯化；四、PCR产物测序；五、CAPS的标记：将两个种测序所得的SAD基因序列通过BLASTN进行比对，分析SNP位点，基于找到的SNP位点，利用软件分析是否可以转化为CAPS的标记，然后对目标片段进行PCR扩增，选择相应的限制性内切酶进行酶切反应，用琼脂糖凝胶进行产物检测，即可利用软件SPSS对亲本、F1和BC1群体的CAPS标记类型与冷驯化能力进行相关分析，旨在为分子标记辅助选择冷驯化能力较强的基因型提供有利的帮助，取得了很好的效果。

Description

一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法
技术领域
本发明涉及一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD），尤其涉及一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，属于基因技术领域。
背景技术
低温冻害主要与植物的双层膜脂相关，研究报道很多不同种类的植物在低温条件下，细胞质膜中多元脂肪酸不饱和度的增加与耐冷或耐冻性的增加相关联。而Δ9硬脂酰载体蛋白脱氢酶对于原生质膜从凝胶状转变为液晶相是最关键的，这个酶在硬脂酰载体蛋白（18:0-ACP）的碳9和碳10之间引入第一个双键使之产生油酰载体蛋白（18:1 Δ9-ACP）。随后的不饱和键的引入与第一个双键引入作用相比逐渐变小。在所有的植物细胞中都发现有可溶性的Δ9-硬脂酰基载体蛋白脱氢酶（SAD），SAD催化硬脂酰载体蛋白变为油酰基载体蛋白并对决定植物中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比率起重要作用。这个比率与植物的很多功能密切相关，特别在植物的低温驯化方面。从很多植物上克隆了SAD基因，并进行结构和功能分析，包括黄瓜、蓖麻子、红花、菠菜、芸苔、荷荷巴油和马铃薯等，表明在冷驯化期间SAD基因转录增加与马铃薯冷驯化响应相关联。目前，还没有关于SAD基因的CAPS标记方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，以耐冻野生马铃薯Solanum commersonii和霜冻敏感的S.cardiophyllum为试材，开发了SAD基因的CAPS标记方法，并用这两个种的回交一代进行了验证，旨在为分子标记辅助选择马铃薯冷驯化能力较强的基因型提供有利的帮助。
本发明的技术方案为：一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，它包括如下步骤：
一、基因组DNA提取；
二、对SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物设计：从NCBI网站下载到硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的mRNA序列（X78935.2），在茄科基因组资源网站上利用BLASTsequence Alignments工具进行SAD基因的mRNA序列比对，找到高度相似的SAD基因的DNA序列，然后通过Primer primer软件设计SAD基因的引物，用DNAMAN进行序列比对；
三、PCR 反应和产物回收及纯化：用步骤一得到的引物进行PCR扩增；
四、PCR产物测序：在测序之前要再进行一次PCR反应；
五、CAPS的标记：将两个种测序所得的SAD基因序列通过用BLASTN进行比对，分析SNP位点，基于找到的SNP位点，利用软件dCAPS Finder 分析是否可以转化为CAPS的标记，然后对目标片段进行PCR扩增，选择相应的限制性内切酶进行酶切反应，用琼脂糖凝胶进行产物检测，即可利用统计分析软件SPSS的Pearson双侧检验对亲本、F1和BC1群体的CAPS标记类型与冷驯化能力进行相关分析。
所述步骤一中包括如下分步骤：
A：在1.5mL离心管中装入2张待测叶片；
B：用液氮研磨成粉末，加入65℃预热的2% CTAB（添加β巯基乙醇，终浓度为1%）700μL；
C：65℃水浴1h，每隔10min左右摇动一次；
D：取出冷却至室温，然后加入预冷的24:1的氯仿-异戊醇溶液700μL，轻轻摇匀5min；
E：14000rpm离心10min，吸取上清液约500μL至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；
F：-20℃沉淀30min（可过夜）至DNA抱团沉淀，14000rpm离心10min；
G：倒掉上清液，加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心5min，倒掉上清液，加入1mL90%乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，倒掉上清液；
H：在通风橱放至DNA晶体干透无酒精味道，加入100μL含有RNA酶 ( RNas浓度为0.1mg/ml)的无菌水复溶，37℃温育2h除去RNA；
I：取2μL DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。
所述步骤三中的反应体系包括：11.2μL去离子水，4μL 5×PCR缓冲液，0.8μL 5mMdNTPs，0.8μL 5μM正向引物，0.8μL 5uM反向引物，0.4μL Taq DNA 连接酶，2μL 30ng/μLDNA模板，总体积20μL；循环条件是：94℃ 4min，94℃ 20s， 45℃30s， 58℃ 2min，共35个循环；接着是72℃ 7min，用2%的琼脂糖凝胶进行产物检测。
所述步骤四中的反应体系为：1.75μL去离子水，0.75μL 2.5X PCR缓冲液，1μL 5μM引物（正向或者反向），0.50μL Big dye, 1μL 纯化后的DNA；循环条件是：95℃ 3min；95℃20s， 50℃20s， 60℃ 4min 共50个循环；接着是72℃ 5min，PCR产物进行清洗，然后进行测序。
所述步骤五中的PCR产物酶切体系为：2μL 的NEBbuffer4、5μL PCR产物、1μL EcorⅠ、12μL ddH2O，再进行酶切，酶切条件：37℃，3h。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，采用本发明的技术方案，可以利用该CAPS标记进行回交后代材料的苗期筛选，从而节省大量的人力物力，同时也为马铃薯的分子标记辅助育种奠定一定基础，取得了很好的应用效果。
附图说明
图1为本发明Cmm1和cph12种间回交分离群体冷驯化前的耐冻性频率分布图；
图2 为本发明Cmm1和cph12种间回交分离群体冷驯化能力的频率分布图；
图3 为本发明SAD基因的外显子和内含子示意图；
图4 为本发明马铃薯SAD基因的引物序列；
图5 为本发明6对引物在cmm1 和cph12中的扩增产物电泳图；
图6 为本发明cmm1和cph12的SAD基因片段序列比对；
图7 为本发明cmm1和cph12的PCR产物酶切效果图；
图8 为本发明SAD基因扩增片段酶切结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将参照本说明书附图对本发明作进一步的详细描述。
实施例1：如附图1～8所示，试验材料包括S. commersonii（cmm1）、S.cardiophyllum（cph12）、F1066以及57个BC1基因型。2017年2月用cmm1作母本，cph12作父本进行杂交，4月初收获F1代杂交果，通过2000ppm赤霉素处理12h，播种于MS培养基中，同年6月在F1基因型中选取F1066作为母本，以cph12作父本进行杂交，9月收获浆果、放常温下进行后熟处理1个月后进行种子清洗，干燥后保存于种子袋中，2018年2月将回交群体种子播种于培养基中，组培扩繁后播种于10×10cm的塑料盆中，内有 1:1的草炭和蛭石，每个基因型定植8株。在温室中生长5周后进行耐冻性鉴定和DNA提取。
一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，其特征在于：它包括如下步骤：
一、基因组DNA提取；
二、对SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物设计：从NCBI网站（National Centerof Biotechnology Information）下载到来自于S.commersonii的硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的mRNA序列（X78935.2），在茄科基因组资源网站（http://potatogenomics.plantbiology.msu.edu/）上利用BLAST sequence Alignments工具进行SAD基因的mRNA序列比对，找到高度相似的SAD基因的DNA序列，然后通过Primer primer5.0软件设计SAD基因的引物，用DNAMAN6.0进行序列比对；
三、PCR 反应和产物回收及纯化：用步骤一得到的引物进行PCR扩增；
四、PCR产物测序：在测序之前需再进行一次PCR反应；
五、CAPS的标记：将两个种测序所得的SAD基因序列通过用BLASTN (Basic LocalAlignment Search Tool for Nucleotides sequences)进行比对，分析SNP位点，基于找到的SNP位点，利用在线软件 dCAPS Finder 2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）分析是否可以转化为CAPS标记，然后对目标片段进行PCR扩增，选择相应的限制性内切酶进行酶切反应，用2%的琼脂糖凝胶进行产物检测，即可利用统计分析软件SPSS13.0 的Pearson双侧检验对亲本、F1和BC1群体的CAPS的标记类型与冷驯化能力进行相关分析。
所述步骤一中包括如下分步骤：
A：在1.5mL离心管中装入2张管盖大小的叶片；
B：用液氮研磨成粉末，加入65℃预热的2% CTAB（添加β巯基乙醇，终浓度为1%）700μL；
C：65℃水浴1h，每隔10min左右摇动一次；
D：取出冷却至室温，然后加入预冷的24:1的氯仿-异戊醇溶液700μL，轻轻摇匀5min；
E：14000rpm离心10min，吸取上清液约500μL至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；
F：-20℃沉淀30min（可过夜）至DNA抱团沉淀，14000rpm离心10min；
G：倒掉上清液，加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心5min，倒掉上清液，加入1mL90%乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，倒掉上清液；
H：在通风橱放至DNA晶体干透无酒精味道，加入100μL含有RNA酶 ( RNas浓度：0.1mg/ml)的无菌水复溶，37℃温育2h除去RNA；
I：取2μL DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。
所述步骤三中的反应体系包括：11.2μL去离子水，4μL 5×PCR缓冲液，0.8μL 5mMdNTPs，0.8μL 5μM正向引物，0.8μL 5uM反向引物，0.4μL Taq DNA 连接酶，2μL 30ng/μLDNA模板，总体积20μL；循环条件是：94℃ 4min，94℃ 20s， 45℃30s， 58℃ 2min 共35个循环；接着是72℃ 7min，用2%的琼脂糖凝胶进行产物检测，产物回收及纯化采用Wizard® SVGel and PCR Clean-Up System （Promaga公司）。
所述步骤四中的反应体系为：1.75μL去离子水，0.75μL 2.5X PCR专用缓冲液，1μL5μM引物（正向或者反向），0.50μL Big dye, 1μL 纯化后的DNA。循环条件是：95℃ 3min；95℃ 20s， 50℃20s， 60℃ 4min 共50个循环；接着是72℃ 5min。PCR产物用Agencourt ®Clean SEQ®进行清洗，然后送样到威斯康星州立大学生物技术中心进行测序。
所述步骤五中的PCR产物酶切体系为：2μL 的NEBbuffer4、5μL PCR产物、1μL EcorⅠ、12μL ddH2O。在BIO-RAD S1000TM PCR仪中进行酶切，酶切条件：37℃，3h。
耐冻性鉴定结果
Cmm1和cph12这两个亲本冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力表现出明显的差异，cmm1冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力分别是-3.4℃和6.7℃，而cph12和F1066冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力分别是-1.8℃、2.2℃和-2.5℃、2.1℃。BC1群体材料冷驯化前的耐冻性范围在-1.6℃～-3.2℃（附图1所示），冷驯化能力范围在0.0℃～6.7℃（附图2所示），冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力的平均值分别是-2.4℃和1.1℃。由图2B可以看出，BC1的冷驯化能力偏向于cph12，即冷驯化能力很弱。通过D检验结果表明这两个性状都是正偏态分布（Sk=0.309，Ku=0.608）。
SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物设计及筛选结果
通过BLAST sequence Alignments工具在茄科基因组资源网站上找到一段长度为4849bp的序列（PGSC0003DMS000000135），与SAD基因的cDNA序列相似性为97.43%。该序列包含3个外显子和2个内含子（附图3所示）。为此，设计了7对引物覆盖该序列，其中P2引物对未能扩增出产物，其余引物的PCR产物电泳检测结果见附图5所示，产物条带大小都在500bp～800bp，各对引物的序列见附图4所示。
SNP和CAPS标记
测序结果表明，在Primer7的扩增产物中，耐冻且能冷驯化的cmm1与霜冻敏感不能冷驯化的cph12的SAD基因之间存在18个SNP位点（附图6所示），通过dCAPS Finder 2.0在线软件发现这段序列的第10个SNP位点（黑框处）含有一个EcoRⅠ的酶切位点。EcoRⅠ的识别序列为“GAATTC”，酶切后cmm1的PCR产物由800bp的片段切为两条长度在400bp左右条带，而cph12的PCR产物不能被酶切。通过这个CAPS标记能将耐冻的S.commersonii和霜冻敏感的S.cardiophyllum完全区别开来（附图7所示）。由此可见，该CAPS标记得到成功转化，命名为SAD-EcoRⅠ，该标记为共显性标记。
CAPS标记与冷驯化能力的相关分析
将BC1代的57个基因型、cmm1、cph12、F1066的冷驯化能力与相应的CAPS标记（附图8所示）做Pearson双侧相关分析，结果发现相关系数（r=0.426）达极显著水平，表明SAD基因与马铃薯的冷驯化能力是密切相关的。
S.commersonii和S.cardiophyllum的种间杂交分离群体是最适合于研究马铃薯耐冻性遗传，因为相对于在美国马铃薯资源库中的120多个块茎繁殖的马铃薯种，这两个种在冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力方面差异极为显著。此外，这两个种易于杂交，方便产生后代，有利于遗传分析。在本实施例中，F1代与霜冻敏感的S.cardiophyllum杂交之后，BC1代基因型的冷驯化前的耐冻性较低，有个别基因型甚至比亲本cph12更为敏感，呈超亲遗传的趋势，同时其冷驯化能力也偏向于亲本cph12，比较弱。Stone等（1993）用S.commersonii和S.cardiophyllum的F1代与耐冻且能冷驯化的S.commersonii杂交，其BC1材料冷驯化前的耐冻性和冷驯化能力明显增强，趋向于S.commersonii。
SAD基因是决定植物中不饱和脂肪酸比例的重要基因。近年来，关于SAD基因的研究已有不少报道。Vipa（1998）等根据向日葵SAD基因的内含子序列开发了4个DFLP、6个SSCP和2个SSR标记。Kodama等（1995）从拟南芥中发现了一个SAD基因的突变体，在低温条件下和对照一样其硬脂酸的含量并没有增加。Tasseva等（2004）发现甘蓝型油菜在低温条件下SAD的表达上调导致了SAD蛋白含量的提高。De Palma等（2008）认为植物中SAD基因的超表达将增加植物的耐寒性，是由于不饱和脂肪酸含量的增加增强了质膜的稳定性。这些研究结果表明通过操作SAD基因很有可能改变植物脂肪酸的成分。同时，关于CAPS标记的开发也有成功的案例，如靳哲等（2012）开发了结球甘蓝BoCBF1与BoCBF2基因的CAPS标记，研究结果表明这两个基因与甘蓝的耐寒性相关性（r=0.531）极显著。马铃薯耐冻性遗传改良过程中通常需要进行大量的耐冻性鉴定工作（Vega等，1995； Palta和Li，1979），需要很多的人力物力。
在本实施例中利用两个耐冻性差异较大的二倍体野生马铃薯S.commersonii和S.cardiophyllum及其F1、BC1，通过对SAD基因组序列的比对与分析，开发了马铃薯SAD基因的CAPS标记SAD-EcoRⅠ，在马铃薯中首次报道了该标记与冷驯能力之间的相关性。基于这些研究结果，在马铃薯的耐冻性遗传改良中，可以利用本实施例中获得的CAPS标记进行回交后代的苗期筛选，从而节省大量的人力物力，同时也为马铃薯的分子标记辅助育种奠定一定基础。
本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (5)

1.一种硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方法，其特征在于：它包括如下步骤：
一、基因组DNA提取；
二、对SAD基因DNA序列的查找、序列分析及引物设计：从NCBI网站下载到硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的mRNA序列（X78935.2），在茄科基因组资源网站上利用BLASTsequence Alignments工具进行SAD基因的mRNA序列比对，找到高度相似的SAD基因的DNA序列，然后通过Primer primer软件设计SAD基因的引物，用DNAMAN进行序列比对；
三、PCR 反应和产物回收及纯化：用步骤一得到的引物进行PCR扩增；
四、PCR产物测序：在测序之前要再进行一次PCR反应；
五、CAPS的标记：将两个种测序所得的SAD基因序列通过用BLASTN进行比对，分析SNP位点，基于找到的SNP位点，利用软件dCAPS Finder 分析是否可以转化为CAPS的标记，然后对目标片段进行PCR扩增，选择相应的限制性内切酶进行酶切反应，用琼脂糖凝胶进行产物检测，即可利用统计分析软件SPSS的Pearson双侧检验对亲本、F1和BC1群体的CAPS标记类型与冷驯化能力进行相关分析。
2.根据权利要求1所述的硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方，其特征在于：所述步骤一中包括如下分步骤：
A：在1.5mL离心管中装入2张待测叶片；
B：用液氮研磨成粉末，加入65℃预热的2% CTAB（添加β巯基乙醇，终浓度为1%）700μL；
C：65℃水浴1h，每隔10min左右摇动一次；
D：取出冷却至室温，然后加入预冷的24:1的氯仿-异戊醇溶液700μL，轻轻摇匀5min；
E：14000rpm离心10min，吸取上清液约500μL至1.5mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；
F：-20℃沉淀30min至DNA抱团沉淀，14000rpm离心10min；
G：倒掉上清液，加入1mL70%乙醇洗涤沉淀，上下颠倒6-8次，7500rpm离心5min，倒掉上清液，加入1mL90%乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心5min，倒掉上清液；
H：在通风橱放至DNA晶体干透无酒精味道，加入100μL含有RNA酶 ( RNas浓度为0.1mg/ml)的无菌水复溶，37℃温浴2h除去RNA；
I：取2μL DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测。
3.根据权利要求1所述的硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方，其特征在于：所述步骤三中的反应体系包括：11.2μL去离子水，4μL 5×PCR缓冲液，0.8μL 5mMdNTPs，0.8μL 5μM正向引物，0.8μL 5uM反向引物，0.4μL Taq DNA 连接酶，2μL 30ng/μLDNA模板，总体积20μL；循环条件是：94℃ 4min，94℃ 20s， 45℃30s， 58℃ 2min，共35个循环；接着是72℃ 7min，用2%的琼脂糖凝胶进行产物检测。
4.根据权利要求1所述的硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方，其特征在于：所述步骤四中的反应体系为：1.75μL去离子水，0.75μL 2.5X PCR缓冲液，1μL 5μM引物（正向或者反向），0.50μL Big dye, 1μL 纯化后的DNA；循环条件是：95℃ 3min；95℃ 20s，50℃20s， 60℃ 4min 共50个循环；接着是72℃ 5min，PCR产物进行清洗，然后进行测序。
5.根据权利要求1所述的硬脂酰载体蛋白脱氢酶基因（SAD）的CAPS标记方，其特征在于：所述步骤五中的PCR产物酶切体系为：2μL 的NEBbuffer4、5μL PCR产物、1μL EcorⅠ、12μL ddH2O，再进行酶切，酶切条件：37℃，3h。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100050291A1 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic loci associated with head smut resistance in maize
CN102766623A (zh) * 2012-07-06 2012-11-07 中国农业科学院作物科学研究所 玉米耐旱种质鉴定和筛选caps标记及其检测方法和应用
CN107881252A (zh) * 2017-11-29 2018-04-06 湖南省农业生物技术研究中心 鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100050291A1 (en) * 2008-08-21 2010-02-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic loci associated with head smut resistance in maize
CN102766623A (zh) * 2012-07-06 2012-11-07 中国农业科学院作物科学研究所 玉米耐旱种质鉴定和筛选caps标记及其检测方法和应用
CN107881252A (zh) * 2017-11-29 2018-04-06 湖南省农业生物技术研究中心 鉴定西瓜枯萎病的dCAPS标记、引物及其获取方法和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李飞: "马铃薯耐冻相关基因克隆与功能分析", 《中国博士学位论文全文数据库(农业科技辑)》 *

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