CN102757969A

CN102757969A - 一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5及其应用

Info

Publication number: CN102757969A
Application number: CN201210207071XA
Authority: CN
Inventors: 廖红; 赵静; 田江; 秦璐
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2012-06-21
Filing date: 2012-06-21
Publication date: 2012-10-31

Abstract

本发明公开了一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5及其应用。该与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。GmPT5基因不仅调控磷从根部向根瘤的转运，超表达该基因还增加了大豆根瘤大小及植株生物量及氮、磷含量。

Description

一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5及其应用。

背景技术

大豆是重要的油料作物和蛋白质来源，能与土壤中的根瘤菌形成互惠互利的共生***，固定空气中的氮 (N)，为宿主植物提供持续的氮源 (Unkovich and Pate, 2000)。随着农业可持续发展和环境保护的要求，利用根瘤菌接种大豆减轻其对氮肥的依赖，对科学种植大豆，保护环境具有重要意义。磷 (P)是植物生长的必需营养元素，也是豆科植物生长及生物固氮过程中需求较高的元素。根瘤固氮是高耗能的过程，每固定1摩尔的N需要消耗16摩尔的ATP，ATP的形成又与磷的有效性密切相关 (Schuize et al., 1999)。但是在全世界13亿公顷耕地中，约5.8亿公顷存在不同程度的土壤有效磷缺乏 (Ellingtoon，1999;vance，2001;吕滨，1987)，我国有效磷缺乏的土壤约占总耕地面积的2/3 (刘建中，1994)，严重限制了植物的生长和产量。

植物在长期的进化过程中，形成了一系列的机制来适应低磷土壤的环境，其中包括诱导或增强植物体内磷转运蛋白高效地吸收利用有效磷。以往的研究表明，根瘤是一个较强的“库”，对磷的需求较高。低磷会抑制根瘤的形成，降低其固氮能力。到目前为止，只有一篇文献研究报道了豆科作物根瘤磷获取的两个来源，包括从根部向根瘤运转的磷和根瘤从介质直接吸收的磷 (Al-Niemi, 1998)，但根瘤磷获取的生理及分子机理仍不清楚。植物磷转运蛋白，尤其是Pht1家族蛋白在植物磷的吸收转运中发挥着重要的作用，但是，对是否存在磷转运蛋白介导豆科作物根瘤磷获取的两个途径目前尚未有相关报道。

因此，寻找参与调控大豆根瘤磷获取的关键基因，不仅可以解析豆科作物根瘤磷吸收/运转的分子机理，而且可为培育氮磷双高效大豆新品种提供基因资源，对发展环境友好型可持续农业具有重要的理论和实践意义。

针对上述研究背景，在大豆基因组测序完成的基础之上，申请人通过同源比对确定大豆Pht1磷转运蛋白家族成员。根据定量PCR结果，本发明克隆了其中一个低磷诱导的、根瘤特异表达的高亲和磷转运蛋白基因GmPT5，证明GmPT5基因编码的蛋白具有将磷从根部向根瘤运转、促进根瘤生长发育及对磷吸收，最终提高根瘤固氮效率及植株生物量的功能。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5，本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质，本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所提供的与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5，可以来源于大豆，其包含或具有选自如下的核苷酸序列：

(1) SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个 (例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(6) (1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1由1566个碱基组成，其开放阅读框架 (ORF)为第1-1566位碱基，编码具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为GmPT5蛋白。

本发明提供的与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5编码的蛋白质，其包含或具有选自如下的氨基酸序列：

(1) SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；

(2) 由于一或多个 (例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

(3) 与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(4) (1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；

(5) 本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明提供的基因GmPT5和蛋白质能够调控包含它的转基因生物体内磷的转运。

扩增上述GmPT5基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。

本发明还提供含有上述GmPT5基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有GmPT5基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pCAMBIA3301 (CAMBIA，Australia，由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见：http://www.cambia.org/)、pYLRNAi (由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。

本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的GmPT5基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。

本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明还涉及本发明的GmPT5基因或重组载体在调控植物体内磷的转运中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物磷转运的制剂。

本发明还涉及调控植物体内磷的转运的方法，该方法包括制备含有本发明的GmPT5基因或重组载体的植物，例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因GmPT5导入大豆中，得到转基因复合植物；所述转基因复合植物接种根瘤菌后根瘤大小、根瘤数、植株生物量及氮、磷含量等高于所述目的对照植物。

所述基因GmPT5可以例如是通过所述重组表达载体导入受体植物的。

携带有本发明的基因GmPT5的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的下胚轴转化法转化到大豆细胞或组织中。

本发明的优点和效果：

1.基因GmPT5所属的磷转运蛋白家族在拟南芥和水稻中虽已被克隆及报道，但其在豆科作物磷吸收运转方面的生物学功能并不清楚，尤其是在根瘤磷的吸收运转方面。本发明克隆的基因GmPT5对大豆根瘤磷的转运有显著的影响，这对阐明磷转运蛋白基因在豆科作物根瘤磷获取过程中的生物学功能及根瘤磷吸收运转的分子机理研究有着重要意义。

2.基因GmPT5不仅影响了磷从大豆根部向根瘤的转运，超量表达该基因还增加了大豆根瘤大小 (图5D)，例如在磷充足的情况下，转基因株系的根瘤大小明显高于空载体对照；该基因的功能研究对于解析豆科作物根瘤磷获取途径的分子机理有着深远的研究意义。

3.该基因的转基因复合植株超表达株系与对照对比，植株氮、磷含量都显著增加 (图5B,C)；说明基因GmPT5对提高植物磷素吸收利用效率及共生***固氮效率效果明显，通过基因工程技术提高基因GmPT5的表达量能够同时提高磷效率及固氮效率，从而达到少施肥多产出的目的。

附图说明

图1：田间试验中大豆接种有效根瘤菌后的效果图。

图2：水培试验中磷供给对根瘤生长发育的影响。

图3：酵母互补试验。

图4：GmPT5基因的组织化学定位。

图5：GmPT5基因的表达对植株生长、氮、磷含量及根瘤生长发育的影响。

图6：GmPT5基因对大豆根瘤磷获取两个途径的影响。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

GmPT5基因的克隆

1、基因 (GmPT5)的克隆

在已公布的大豆基因组数据库中，通过同源比对，预测出大豆Pht1磷转运蛋白家族共有14个成员，通过定量PCR技术，确定GmPT5基因为低磷诱导的、根瘤特异表达的高亲和磷转运蛋白基因。按照TRIzol一步法提取磷高效基因型HN98大豆根瘤总RNA，以反转录得到全基因组cDNA作为模板，以上游引物：

5’-ATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:3)

和下游引物：

5’- TTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:4)

为引物，进行PCR扩增，PCR反应体系为50 μL，包含10 μM正反向引物各1 μL，10×PCR buffer 5 μL，2.5 mM dNTP 8 μL，Taq酶0.3 μL，cDNA模板量1 μL，然后用灭菌ddH₂O补足50 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 1分钟；94 ℃ 30秒，55 ℃ 30秒，72 ℃ 2分钟，扩增30个循环；72 ℃延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳，通过Golden view核酸染料染色后，在凝胶成像***成像。DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。回收得到PCR产物克隆到pMD18-T (TAKARA公司，具体描述见：http://www.takara.com.cn/)载体上进行测序鉴定，表明PCR产物片段具有SEQ ID NO:1的核苷酸序列，将该片段命名为GmPT5。

2、载体的构建

酵母载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，通过PCR扩增得到GmPT5的ORF片段，用上游特异引物

5’-ATATGCGGCCGCATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:5)

和下游特异引物

5’-GCGCGGATCCTTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:6)

扩增GmPT5全长ORF片段，将片段装入酵母表达载体p112A1NE (由复旦大学生命科学学院明凤副教授惠赠，具体描述见文献：Ming et al., 2006, Science in China Series C: Life Sciences)，获得连接成功的Yp112-GmPT5表达载体，通过酵母的转化获得Yp112-GmPT5的转化子。

启动子分析表达载体的构建：按照常规方法，提取大豆叶片或根部基因组DNA，以大豆基因组DNA为模板，用上游特异引物

5’-ATGCTCTAGAGCCTACTGCTGCCTGTGAAT-3’ (SEQ ID NO:7)

和下游特异引物

5’-ATGCCCATGGCTTGCTCCTTCCCCATCGCT-3’ (SEQ ID NO:8)

扩增GmPT5启动子2496 bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过XbaI和NcoI对回收片段及目的载体进行双酶切后，将GmPT5基因连接到目的载体pCAMBIA3301。

过量表达载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，用上游特异引物5’-TGATAAAGCTTATGGGGAAGGAGCAAGTTCAGG-3’ (SEQ ID NO:9)

和下游特异引物

5’-ATTAAACGCGTTTACACCTTGGTCTCCTCTTCTTG-3’ (SEQ ID NO:10)

扩增GmPT5 ORF 1566 bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过HindⅢ和MluⅠ对片段及目的载体进行双酶切后，将GmPT5基因连接到目的载体pYLRNAi。

干涉载体的构建：以大豆根瘤cDNA为模板，用上游特异引物

5’-TCAAGGATCCCCAAGGAGTTCATGAGTCGCCATG-3’ (SEQ ID NO:11)

和下游特异引物

5’-TGCCAAGCTTTGGCATTAGGCCCAAAGTTTGCA-3’ (SEQ ID NO:12)

扩增411 bp目的片段，用BamHⅠ和HindⅢ分别酶切PCR产物和目的载体pYLRNAi，回收411 bp产物纯化后连接载体，转化大肠杆菌Top10F’(由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：Wang et al., 2006, The Plant Cell)，测序无误后，用上游特异引物

5’-ATGCCTGCAGCCAGTGATCATAGGGAATGGCAA-3’ (SEQ ID NO:13)

和下游特异引物

5’-ATGCACGCGTGAACATGGAGATTCAAGCCGAG-3’ (SEQ ID NO:14)

扩增反向片段，用PstⅠ和MluⅠ双酶切反向片段和带有正向片段的载体后，将反向片段连接到包含有正向片段的目的载体pYLRNAi中，转化大肠杆菌DH10B，测序无误后转化发根农杆菌K599 (由澳大利亚昆士兰大学豆科综合研究中心惠赠，保存于华南农业大学根系生物学研究中心实验室，具体描述见文献Kereszt A, et al.，2007)，用于农杆菌介导的大豆下胚轴注射法进行毛根转化。

3、酵母互补试验

应用缺失高亲和力磷转运蛋白的突变体酵母菌株MB192 (MATa pho3-1 Dpho84::HIS3 ade2 leu2-3.112 his3-532 trp1-289 ura3-1.2 can1)进行功能研究，该突变体菌株由复旦大学生命科学学院明凤教授提供，由南京农业大学徐国华教授实验室完成，主要包括Yp112-GmPT5转化子对突变体MB192磷吸收功能的回补及放射性同位素³³P标记测定酵母对磷的吸收速率等试验。试验结果见图3，其中A：酵母生长试验验证GmPT5基因对缺失内源高亲和磷转运蛋白的酵母突变体MB192 (对照)磷素吸收功能的互补。初始体积时酵母细胞数为6X10⁵，依次等体积10倍稀释后分别等量接种于100和50 μM Pi浓度YNB培养基中，30℃培养3天；B：用同位素³³P测定酵母转化子Yp112- GmPT5对磷素吸收的速率 (pH 6.0)。

4、GmPT5组织表达定位分析

通过农杆菌介导的大豆下胚轴注射转化法获得转基因毛状根后，将主根剪掉，保留从愈伤组织处长出来的毛状根，将毛状根浸泡在根瘤菌菌液中30分钟后移入水培，水培营养液全为低氮 (100 μmol/L )处理，设低磷 (5 μmol/L)和正常磷 (250 μmol/L)两个磷水平，根系生长一周后，开始有根瘤出现时，取一株上愈伤组织所有毛根 (大概5条左右)的侧根进行GUS染色，去掉非转基因的毛状根，接种后15天、30天分别摘取根、根瘤进行GUS报告基因表达的组织定位分析，确定GmPT5基因在大豆根瘤生长不同阶段的组织表达部位，基因表达的组织定位可进一步通过石蜡切片进行观察。结果见图4，其中A-C为对照：35S启动子驱动的空载，A，B为根部，C为根瘤；D-I为GmPT5pro::GUS在根部 (未接种根瘤菌，D-F)和根瘤中 (接种根瘤菌后，G-I)的表达。D：根尖；E和F：成熟根部纵切和横切。G：根瘤形成早期根瘤和根部连接处 (接种后15天)；H和I分别是中等大小及成熟根瘤 (接种后30天)。转化空载的对照植株和GmPT5 pro:: GUS转基因植株全为低磷低氮营养液处理。图中除A, D标尺为500 μm及F, G标尺为20 μm外，其余图中标尺均为100 μm。

实施例2

转基因复合植株的研究

1、转基因复合植株的获得

将构建好的表达载体质粒转化至发根农杆菌K599中，采用农杆菌介导的大豆下胚轴注射法获得转基因复合植株 (根部为转基因毛状根、地上部为非转基因)，后续的表型鉴定均使用此株系。空载体对照：按照上述方法，将表达载体pYLRNAi同样方法转化大豆，获得转pYLRNAi空载对照株系 (CK)。

2、转基因复合植株的检测

接种后15天，先采取根部样品提取RNA，转基因毛根筛选标记为潮霉素，可用潮霉素抗性基因 (Hyg)检测毛根的真假；接种40天后，根瘤处于成熟期时，摘取两个根瘤，提取RNA，进一步用定量PCR检测过表达及干涉的效果，定量PCR试验中以大豆看家基因TefS1为参照基因，相对表达量为目的基因GmPT5的表达量与看家基因表达量的比值。

定量PCR步骤：

1) Hyg基因的引物为：

Hyg F: 5’-GCTGTTATGCGGCCATTGTC-3’ (SEQ ID NO:15)

Hyg R: 5’-GACGTCTGTCGAGAAGTTTC-3’ (SEQ ID NO:16)

TefS1基因的引物为：

TefS1 F: 5’- TGCAAAGGAGGCTGCTAACT -3’ (SEQ ID NO:17)

TefS1 R: 5’- CAGCATCACCGTTCTTCAAA -3’ (SEQ ID NO:18)

GmPT5基因的引物为：

GmPT5 F: 5’- GAACACTTTCAGGGCAACTC -3’ (SEQ ID NO:19)

GmPT5 R: 5’- GTCATCACAGTCTTTGCATCG -3’ (SEQ ID NO:20)

2) 反应体系：

2×SYBR Green PCR master mix： 10 μL

上游引物. (10 mol/L)： 0.6 μL

下游引物. (10 mol/L)： 0.6 μL

Mili-Q水：补至20 μL

稀释的cDNA： 2 μL

3) 反应条件：

Figure 201210207071X100002DEST_PATH_IMAGE001

经过抗性基因的检测及定量PCR确认得到有效的不同转基因株系。

3、转基因复合植株表型分析

1) 植株鲜重及根瘤生长指标测定

收获接种根瘤菌50天后的不同转基因株系测定相关生理指标，包括：植株生物量、根瘤鲜重、根瘤数、根瘤大小等，其中根瘤大小为单个根瘤的鲜重 (根瘤鲜重与根瘤数的比值)。生物量：百分之一天平称量地上部和根部样品鲜重，将根部的根瘤摘下计数后，用万分之一天平称取鲜重，所有样品在105 ℃烘箱杀青30分钟后置于75 ℃烘干至恒重，称取干重。

2) 氮、磷含量测定

先将植株各部分样品粉碎，用H₂SO₄-H₂O₂法消煮，然后按一定比例吸取消煮液进行氮和磷的测定。氮浓度用2300自动定氮仪 (Kjedahl2300，FOSS，瑞士)测定，磷浓度用钼锑抗比色法 (Murphy and Riley, 1963)测定。

植株养分含量用单位植株氮、磷量表示，计算公式为：

氮含量 (mg/plant) =氮浓度 (mg/g) ×植株干重 (g/plant)

磷含量 (mg/plant) =磷浓度 (mg/g) ×植株干重 (g/plant)

图5为GmPT5基因的表达对植株生长、氮、磷含量及根瘤生长发育的影响。其中A：植株鲜重；B：植株氮含量；C：植株磷含量；D：根瘤数及根瘤大小。不同转基因株系接种根瘤菌后在不同磷浓度 (低磷：5 μM P；高磷：250 μM P)低氮营养液中生长50天。CK，转化空载的对照株系；OX, GmPT5的超表达株系；RNAi，GmPT5的干涉株系。图中数据为同一转基因植物4个系数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在OX或RNAi株系与对照CK株系之间的显著性比较：*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 <P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著；ns表示差异不显著。

4、转基因复合植株根瘤磷吸收试验 (³³P同位素标记法)

1) 根段吸收 [³³P] Pi同位素试验

不同磷浓度处理50天后的GmPT5基因过表达、对照、干涉三种转基因株系，保留各株系根段上有相同数目的根瘤 (最好靠近根上部)，只供给下部一定长度 (6 cm)根段 (没有根瘤)³³P标记的营养液 (100 mL营养液中加入10 μCi ³³P同位素原液)，保证根瘤不直接接触³³P标记的营养液 (如图6B所示)。吸收8小时之后，把根系放入杯子中相同磷浓度的营养液浸泡清洗，用吸水纸吸干，重复3次左右，至清洗液中几乎检测不到放射性为止。将植株用透明胶固定在硬纸上，105 ℃杀青30 min后，用压片盒盖住后进行放射自显影，3天后洗片。洗片后将样品分为三部分 (接触³³P标记营养液的吸收根段、上部根段、根瘤)，称取各自的重量后，剪碎放入5 mL离心管，加入4 mL闪烁液，放入白色闪烁瓶中，放置过夜后用LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter BECKMAN COULTER闪烁计数仪 (南京农业大学)测定样品的cpm值 (单位时间的计数次数)。

2）根瘤离体吸收[³³P] Pi试验

低磷处理50天后的GmPT5基因过表达、对照、干涉三种转基因株系各摘取3个根瘤，称取鲜重后，放入一定体积³³P标记的不同磷浓度营养液，³³P标记强度为10 μCi per μmol PO₄，根瘤与根接触点伤口处用硅脂封住避免液体直接从伤口进入，处理2小时后，把根瘤放入杯子中用相同磷浓度营养液浸泡清洗，用吸水纸吸干，重复3次左右，到清洗液几乎检测不到放射性为止。将根瘤研磨后，转移到5 mL离心管中，加入4 mL闪烁液，放入白色闪烁瓶中，放置过夜后用LS6500 Multi-purpose Scintillation Counter BECKMAN COULTER闪烁计数仪 (南京农业大学)测定样品的cpm值 (单位时间的计数次数)。

图6为GmPT5基因对大豆根瘤磷获取两个途径的影响。其中A：大豆根段 [³³P] Pi吸收试验操作图示，6cm直接接触³³P标记营养液的根段作为吸收根段；箭头表示上部根段中根瘤的位置，上部根段及根瘤不接触³³P标记的营养液；B：GmPT5不同转基因株系³³P根段吸收试验；C：GmPT5不同转基因株系根瘤离体³³P同位素吸收试验。CK，转化空载的对照株系；OX, GmPT5的超表达株系；RNAi, GmPT5的干涉株系。cpm表示通过液闪仪测定得到的每分钟计数次数。图中数据为同一转基因植物4个系数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在OX或RNAi株系与对照CK株系之间的显著性比较：*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 < P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著；ns表示差异不显著。

5、田间试验与水培试验

图1为田间试验中大豆接种有效根瘤菌后的效果图。A：田间试验大豆接种根瘤菌50天后整体生长状况图；B：根瘤鲜重和籽粒产量；C：植株氮磷含量；试验中每个处理设5个重复，每个重复包括3株大豆。图中柱子为试验各处理5个重复数据的平均值和标准误差。星号表示同一指标在不接种根瘤菌处理 (-R)和接种根瘤菌处理 (+R)时通过t-测验进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0.001< P <0.01时，差异显著性介于显著与极显著之问；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著。

图2为水培试验中磷供给对根瘤生长发育的影响。A：图中所示为低氮情况下高低磷处理大豆根瘤生长情况 (接种后50天)；B：根瘤数和根瘤大小；C：植株鲜重和磷含量；D：植株叶片、根部及根瘤可溶性磷浓度。大豆幼苗接种根瘤菌后在不同磷浓度处理的培养液中生长50天，其中低磷为5 μM P，高磷为250 μM P。试验中每个处理设4个重复，图中柱子为试验各处理4个重复数据的平均值和标准误差。B图和C图中星号表示同一指标在高低磷处理时通过t-测验进行差异显著性比较的结果，*表示显著水平P <0.05时，差异显著；**表示显著水平0. 001 <P <0. 01时，差异显著性介于显著与极显著之间；***表示显著水平P <0.001时，差异极显著。D图中不同的字母表示磷浓度在不同组织间的差异性比较，大小写字母分别表示高低磷处理下的比较情况。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5及其应用

<130>

<160> 20

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1566

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggggaagg agcaagttca ggtgctgaat gccctggacg tggcaaagac acaatggtat 60

catttcacag caatcatcat tgctggaatg ggcttcttca ctgatgctta tgatctgttc 120

tgtatatcac tagtcacaaa gctacttggt cgcatttact accacgttga tggggctgca 180

aagcctggtt cattgcctcc caatgtgtca gctgcagtta atggtgtagc ttttgttgga 240

acactttcag ggcaactctt ctttggctgg ctcggcgaca aaatgggccg aaaaaaggtc 300

tatggcatga cccttgcgct tatggttata gcttccattg cttcgggtct atccttcgga 360

cacgatgcaa agactgtgat gacaactcta tgcttctttc gcttctggct tggttttggc 420

attggtggag actaccctct ttcggccacc ataatgtctg agtattctaa taagaagact 480

cgaggtgcct ttatagctgc agtgtttgcc atgcagggtt ttggaatttt ggcaggaggt 540

gtgtttgcta ttatcatagc atctgtgttc aagtccaagt ttgattctcc accatacgag 600

gttgatccgt tgggttcgac tgttccacaa gcagactatg tttggaggat aattctcatg 660

tttggagcaa ttcctgctgc aatgacttac tactcgcgat ccaagatgcc agaaaccgct 720

cgttacactg ccttggttgc caagaatatg gagaaggctg cagcagatat gtctaaggtt 780

atgaacatgg agattcaagc cgagccaaag aaggaggagg aggcacaagc taaatcatat 840

ggattgttct ccaaggagtt catgagtcgc catggactgc atctgctcgg aacaacaagc 900

acatggttct tgcttgacat tgcattctac agccaaaatc ttttccagaa ggatatcttc 960

agcgcaattg gttggattcc tccggcaaaa acaatgaatg ctcttgagga ggttttcttt 1020

attgcaaggg ctcaaactct tattgctcta tgcagtacag ttcctggata ctggttcact 1080

gtggccttca ttgataggat aggaagattc gccatccaat tgatgggatt cttctttatg 1140

actatcttca tgtttgctct tgccattccc tatgatcact ggactcttag ggagaacaga 1200

attggatttg tggtcattta ctctctcaca ttcttctttg caaactttgg gcctaatgcc 1260

accacatttg ttgtgccggc ggagattttc ccagctagat ttagatccac ttgccatgga 1320

atatcttcag catctgggaa gctcggggct atggttggtg cattcgggtt tttatatttg 1380

gcacagaatc aggacccgag caaagcagat gcagggtacc ctgcaggtat tggtgtgagg 1440

aattcactgc ttgtgttggg tgtgattaac attttaggct tcatgttcac tttcttggtg 1500

cctgaggcca agggtagatc cttggaggag atttcgggag agcaagaaga ggagaccaag 1560

gtgtaa 1566

<210> 2

<211> 521

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Lys Glu Gln Val Gln Val Leu Asn Ala Leu Asp Val Ala Lys

1 5 10 15

Thr Gln Trp Tyr His Phe Thr Ala Ile Ile Ile Ala Gly Met Gly Phe

20 25 30

Phe Thr Asp Ala Tyr Asp Leu Phe Cys Ile Ser Leu Val Thr Lys Leu

35 40 45

Leu Gly Arg Ile Tyr Tyr His Val Asp Gly Ala Ala Lys Pro Gly Ser

50 55 60

Leu Pro Pro Asn Val Ser Ala Ala Val Asn Gly Val Ala Phe Val Gly

65 70 75 80

Thr Leu Ser Gly Gln Leu Phe Phe Gly Trp Leu Gly Asp Lys Met Gly

85 90 95

Arg Lys Lys Val Tyr Gly Met Thr Leu Ala Leu Met Val Ile Ala Ser

100 105 110

Ile Ala Ser Gly Leu Ser Phe Gly His Asp Ala Lys Thr Val Met Thr

115 120 125

Thr Leu Cys Phe Phe Arg Phe Trp Leu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Asp

130 135 140

Tyr Pro Leu Ser Ala Thr Ile Met Ser Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Thr

145 150 155 160

Arg Gly Ala Phe Ile Ala Ala Val Phe Ala Met Gln Gly Phe Gly Ile

165 170 175

Leu Ala Gly Gly Val Phe Ala Ile Ile Ile Ala Ser Val Phe Lys Ser

180 185 190

Lys Phe Asp Ser Pro Pro Tyr Glu Val Asp Pro Leu Gly Ser Thr Val

195 200 205

Pro Gln Ala Asp Tyr Val Trp Arg Ile Ile Leu Met Phe Gly Ala Ile

210 215 220

Pro Ala Ala Met Thr Tyr Tyr Ser Arg Ser Lys Met Pro Glu Thr Ala

225 230 235 240

Arg Tyr Thr Ala Leu Val Ala Lys Asn Met Glu Lys Ala Ala Ala Asp

245 250 255

Met Ser Lys Val Met Asn Met Glu Ile Gln Ala Glu Pro Lys Lys Glu

260 265 270

Glu Glu Ala Gln Ala Lys Ser Tyr Gly Leu Phe Ser Lys Glu Phe Met

275 280 285

Ser Arg His Gly Leu His Leu Leu Gly Thr Thr Ser Thr Trp Phe Leu

290 295 300

Leu Asp Ile Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Leu Phe Gln Lys Asp Ile Phe

305 310 315 320

Ser Ala Ile Gly Trp Ile Pro Pro Ala Lys Thr Met Asn Ala Leu Glu

325 330 335

Glu Val Phe Phe Ile Ala Arg Ala Gln Thr Leu Ile Ala Leu Cys Ser

340 345 350

Thr Val Pro Gly Tyr Trp Phe Thr Val Ala Phe Ile Asp Arg Ile Gly

355 360 365

Arg Phe Ala Ile Gln Leu Met Gly Phe Phe Phe Met Thr Ile Phe Met

370 375 380

Phe Ala Leu Ala Ile Pro Tyr Asp His Trp Thr Leu Arg Glu Asn Arg

385 390 395 400

Ile Gly Phe Val Val Ile Tyr Ser Leu Thr Phe Phe Phe Ala Asn Phe

405 410 415

Gly Pro Asn Ala Thr Thr Phe Val Val Pro Ala Glu Ile Phe Pro Ala

420 425 430

Arg Phe Arg Ser Thr Cys His Gly Ile Ser Ser Ala Ser Gly Lys Leu

435 440 445

Gly Ala Met Val Gly Ala Phe Gly Phe Leu Tyr Leu Ala Gln Asn Gln

450 455 460

Asp Pro Ser Lys Ala Asp Ala Gly Tyr Pro Ala Gly Ile Gly Val Arg

465 470 475 480

Asn Ser Leu Leu Val Leu Gly Val Ile Asn Ile Leu Gly Phe Met Phe

485 490 495

Thr Phe Leu Val Pro Glu Ala Lys Gly Arg Ser Leu Glu Glu Ile Ser

500 505 510

Gly Glu Gln Glu Glu Glu Thr Lys Val

515 520

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggggaagg agcaagttca gg 22

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttacaccttg gtctcctctt cttg 24

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atatgcggcc gcatggggaa ggagcaagtt cagg 34

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gcgcggatcc ttacaccttg gtctcctctt cttg 34

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgctctaga gcctactgct gcctgtgaat 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atgcccatgg cttgctcctt ccccatcgct 30

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tgataaagct tatggggaag gagcaagttc agg 33

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

attaaacgcg tttacacctt ggtctcctct tcttg 35

<210> 11

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tcaaggatcc ccaaggagtt catgagtcgc catg 34

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

tgccaagctt tggcattagg cccaaagttt gca 33

<210> 13

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atgcctgcag ccagtgatca tagggaatgg caa 33

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

atgcacgcgt gaacatggag attcaagccg ag 32

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctgttatgc ggccattgtc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gacgtctgtc gagaagtttc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

tgcaaaggag gctgctaact 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

cagcatcacc gttcttcaaa 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

gaacactttc agggcaactc 20

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

gtcatcacag tctttgcatc g 21

Claims

1.一种与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5。

4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述与大豆根瘤磷转运相关的磷转运蛋白基因GmPT5在制备促进植物磷转运的制剂中的应用。

7.权利要求3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。

8.权利要求3所述的表达载体在制备促进植物磷转运的制剂中的应用。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述双子叶植物为大豆。