CN103525825A

CN103525825A - 一种植物耐锰毒害重要基因ShMDH1的克隆及其应用

Info

Publication number: CN103525825A
Application number: CN201310290864.7A
Authority: CN
Inventors: 田江; 廖红; 陈志坚
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-07-11
Filing date: 2013-07-11
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-07-11
Also published as: CN103525825B

Abstract

本发明公开了一个促进植物耐锰毒害的关键基因ShMDH1的克隆及其应用。该ShMDH1的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。ShMDH1基因调控了柱花草苹果酸的合成与分泌，对增强植物的耐锰能力具有重要作用。

Description

一种植物耐锰毒害重要基因ShMDH1的克隆及其应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及耐锰毒害基因ShMDH1的克隆及其应用。

背景技术

世界上50%以上的潜在可耕作土壤为酸性土壤，主要分布在热带、亚热带及温带地区（Kochian et al., 2004)。在酸性土壤中，除了缺磷和铝毒外，锰毒害也是限制作物生长和产量的重要障碍因素（de Carvalho et al., 1980; Horst et al., 1988；Raghothama, 1999；Vance et al., 2003）。锰是植物生长必需的微量元素之一（Mukhopadhyay and Sharma, 1991）。但是，过量锰也会对植物造成毒害作用。锰毒害的症状一般表现为叶片出现褐色锰氧化斑，叶绿素含量的降低、光合作用的减弱等症状，最终抑制植物的生长和产量（Horst et al., 1999; Millaleo et al., 2010）。

以往的研究表明植物在长期的进化和人工选育过程中，通过增加根系苹果酸的合成与分泌，螯合根际中的铝，镍，铜和锌等金属元素，从而缓解金属离子对植物生长的毒害作用（Yang et al., 1997; Parker et al., 2001; Sasaki et al., 2004; Delhaize et al., 2012）。前期通过在苜蓿和烟草中超量表达苹果酸脱氢酶（MDH）基因，能够提高转基因植株根系苹果酸的合成与分泌，有效地增强了转基因植株的耐铝能力（Tesfaye et al,, 2001; Wang et al., 2010），但是关于苹果酸分泌及其耐锰毒害的机制鲜有报道。

柱花草起源于热带和亚热带地区，具有良好的营养价值和饲用价值，是优质的豆科牧草（Liu et al., 1997）。柱花草对含有高锰浓度的酸性土壤具有良好的适应性，其可能通过调控植株体内基因表达，从而增强自身的耐锰能力（de Carvalho et al., 1980）。但是，控制柱花草耐锰毒害的关键基因尚未报道。

基于上述研究背景，申请人通过双向电泳的方法，鉴定了一个锰毒害上调表达的蛋白，ShMDH1，而且克隆了编码该蛋白的基因，该基因的表达受外源锰毒害的调控，与植物其它的苹果酸脱氢酶有较高的相似性。在拟南芥和酵母中超量表达该基因，结果表明ShMDH1基因编码的蛋白具有调控苹果酸合成与分泌的功能，最终提高转基因株系耐锰毒害能力。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种苹果酸脱氢酶基因ShMDH1，本发明的另一个目的是提供上述基因编码的蛋白质，本发明的进一步目的是提供上述基因及其编码的蛋白质的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

本发明所提供的苹果酸脱氢酶基因ShMDH1，可以来源于柱花草，其包含或具有选自如下的核苷酸序列：

(1) SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(2)与(1)的核苷酸序列的互补序列在低等严格条件、中等严格条件、优选高严格条件下杂交的核苷酸序列；

(3)与(1)的核苷酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的核苷酸序列；

(4)与(1)的核苷酸序列编码相同氨基酸序列的蛋白质、但在序列上不同的核苷酸序列；

(5)编码如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或者，由于一或多个 (例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(6) (1)-(5)任何一个的核苷酸序列的活性片段；

(7)与(1)-(5)任何一个的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1由1038个碱基组成，其开放阅读框架 (ORF)为第1-1038位碱基，编码具有序列SEQ ID NO:2的氨基酸序列，所述氨基酸序列组成的蛋白质在本发明中称为ShMDH1蛋白。

本发明提供的苹果酸脱氢酶基因ShMDH1编码的蛋白质，其包含或具有选自如下的氨基酸序列：

(1) SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列；

(2) 由于一或多个 (例如1-25个、1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的替代、缺失和/或***而与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列；

(3) 与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、特别优选至少90%、尤其是至少95%或98%或99%同一性的氨基酸序列；

(4) (1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段；

(5) 本发明的多核苷酸分子编码的氨基酸序列。

本发明提供的基因ShMDH1和蛋白质能够调控包含它的转基因生物体内苹果酸的合成。

扩增上述ShMDH1基因全长或其任一片段的引物对属于本发明的保护范围。

本发明还提供含有上述ShMDH1基因的表达载体，可用现有的植物表达载体构建含有ShMDH1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体等，如pYLRNAi (由刘耀光研究员实验室惠赠，具体描述见文献：胡旭霞和刘耀光，2006，分子植物育种)或其它衍生植物表达载体。

本发明还提供一种基因工程菌，其含有上述的表达载体。

本发明还涉及细胞，其包含本发明的ShMDH1基因或重组载体。所述细胞可以是植物细胞，例如豆科植物细胞，或者微生物细胞，例如细菌或真菌细胞，例如酵母细胞。所述细胞可以是分离的、离体的、培养的、或者是植物的一部分。

本发明还涉及植物或者植物部分，植物材料，植物种子，其包含本发明的细胞。所述植物可以是豆科植物，例如柱花草和大豆，也可以是其它植物，例如单子叶植物如水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦、或黑麦等，或者其他双子叶植物如烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯、番茄等。还涉及来自所述植物的转基因种子。

本发明还涉及生产植物的方法，该方法包括：从本发明的植物细胞再生转基因植物，或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明还涉及本发明的方法生产的植物。

本发明还涉及本发明的ShMDH1基因或重组载体在调控植物苹果酸合成中的用途，包括制备转基因植物以及制备促进植物适应酸性土壤的制剂。

本发明还涉及调控植物适应酸性土壤的方法，该方法包括制备含有本发明的ShMDH1基因或重组载体的植物。例如，所述方法可以包括从本发明的植物细胞再生转基因植物或者将本发明的植物与另一植物杂交。

本发明所提供的一个优选实施方案是将上述基因ShMDH1导入拟南芥和酵母细胞中，得到转基因株系；所述转基因株系的耐锰能力等高于所述目的对照植株和菌株。

所述基因ShMDH1可以例如是通过所述重组表达载体导入受体拟南芥和酵母细胞。

携带有本发明的基因ShMDH1的植物表达载体可通过例如农杆菌介导的转化法转化到拟南芥中，酵母表达载体可转化到酵母细胞中。

本发明的优点和效果：

1.基因ShMDH1所属的苹果酸脱氢酶家族在拟南芥、苜蓿、玉米和水稻等虽已被克隆及报道，但其在豆科牧草苹果酸合成方面的生物学功能并不清楚。本发明克隆的基因ShMDH1对柱花草苹果酸合成有显著的影响，这对阐明苹果酸合成和分泌在豆科牧草适应酸性土壤锰毒害的生物学功能有着重要意义。

2.基因ShMDH1不仅影响了苹果酸的合成，超量表达该基因还增加了拟南芥和酵母细胞对锰毒的忍耐能力；该基因的功能研究对于解析豆科作物适应酸性土壤的分子机理有着深远的研究意义。

附图说明

图1：水培试验中不同锰浓度处理对柱花草生长的影响；A：图中所示为不同锰浓度处理对柱花草叶绿素含量的影响；B：图中所示为不同锰浓度处理对柱花草生物量的影响；C：图中所示为不同锰浓度处理对柱花草叶部和根部锰浓度的影响；其中锰处理浓度分别为5 μM 和 400 μM；试验中每个处理设4个生物学重复，图中柱子为4个生物学重复数据的平均值和标准误差；*表示同一指标在同一基因型不同处理之间差异显著，P <0.05；**表示同一指标在同一基因型不同处理之间差异极显著，0. 001 <P <0. 01。

图2：水培试验中不同锰浓度处理对柱花草根系苹果酸积累和分泌的影响；A：不同锰浓度处理对柱花草根系内源苹果酸浓度的影响；B：不同锰浓度处理对柱花草根系苹果酸分泌的影响；其中锰处理浓度分别为5 μM 和 400 μM；试验中每个处理设4个生物学重复，图中柱子为4个生物学重复数据的平均值和标准误差；*表示同一指标在同一基因型不同处理之间差异显著，P <0.05；**表示同一指标在同一基因型不同处理之间差异极显著，0. 001 <P <0. 01。

图3：ShMDH1的亚细胞定位；图3A-C为35S启动子驱动的空载体对照洋葱表皮质壁分离后的细胞：A为GFP荧光信号；B为PI信号；C为A和B的融合结果；D-F为ShMDH1-GFP在洋葱表皮质壁分离后的细胞定位，D为ShMDH1-GFP荧光信号；E为PI信号；F为D和E的融合结果。

图4：锰处理对ShMDH1基因在柱花草根系表达的调控；图中数据为4个生物学重复的平均值和标准误差；*号表示同一指标在不同处理之间的差异显著，P <0.05。

图5：超量表达ShMDH1对转基因拟南芥苹果酸的合成与分泌以及耐锰性的影响；其中A：ShMDH1基因在转基因拟南芥中的表达量分析；B：ShMDH1不同超量表达转基因株系和野生型拟南芥苹果酸合成量；C：ShMDH1不同超量表达转基因株系和野生型拟南芥中的苹果酸分泌量；D：ShMDH1不同超量表达转基因株系和野生型拟南芥在锰处理条件下的表型分析，图中标尺为1 cm；E：ShMDH1不同超量表达转基因株系和野生型拟南芥生物量的比较。F：ShMDH1不同超量表达转基因株系和野生型拟南芥锰浓度的比较；WT，野生型拟南芥的对照株系；OX，ShMDH1的超量表达株系；试验中每个处理设4个生物学重复，图中柱子为4个生物学重复数据的平均值和标准误差；*表示同一指标在超量表达株系与对照株系之间的差异显著，P<0.05；**表示同一指标在超量表达株系与对照株系之间的差异极显著，0. 001 < P <0.01。

图6：超量表达ShMDH1对酵母细胞苹果酸的合成以及耐锰性的影响；其中A：超量表达ShMDH1转基因菌株和空载体对照酵母细胞中的苹果酸浓度；B：超量表达ShMDH1转基因株系和空载体对照酵母细胞在锰处理条件下的表型分析；试验中每个处理设4个重复，图中柱子为4个重复数据的平均值和标准误差；*表示同一指标在超量表达株系与对照株系之间的差异显著，P<0.05。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

ShMDH1基因的克隆

1、ShMDH1基因克隆

根据蛋白双向电泳鉴定了一个受锰毒害上调表达的蛋白为苹果酸脱氢酶。然后，根据已报道的大豆 (XM_003527163)，苜蓿 (AF020271)，百脉根 (BT146072) 和蓖麻 (XM_002524216) 基因的核苷酸序列进行同源性比较，在高度保守区域设计上游同源引物5’- ATTATTGCCGCTGAGGTTTTCAAGA -3’(SEQ ID NO:3)和下游同源引物5’- GATTCCCTTCAAGCAAGCATCG -3’(SEQ ID NO:4)，运用TRIzol法提取柱花草耐锰基因型Fine-stem根系总RNA，然后反转录成cDNA后作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为20 μL，包含10μM上下游引物各0.5 μL，10×PCR buffer 2 μL，2.5 mM dNTP 1.6 μL，Ex-Taq(TAKARA公司)酶0.12 μL，cDNA模板量1 μL，然后用灭菌ddH₂O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4分钟；94 ℃ 30秒，57 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒，扩增35个循环；72 ℃延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳分离，并在凝胶成像***中成像。运用DNA凝胶回收试剂盒回收长度为354 bp的PCR产物。回收产物克隆到pMD18-T (TAKARA公司，具体描述见：http://www.takara.com.cn/)载体并测序鉴定。根据测序的结果，运用Primer 5.0引物设计软件，设计以下扩增ShMDH1基因的引物：5’端EST特异引物 5’- GAAAACCTCAGCAGCAATGGGAACAGT -3’(SEQ ID NO:5)，3’端EST特异引物 5’- CTGCTGAGGTTTTCAAGAAGGCAGG -3’(SEQ ID NO:6)。

以柱花草锰毒害处理根部的RNA为模板，采用Clontech公司 (美国) 的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒构建5’和3’RACE cDNA，进行cDNA末端快速扩增。分别取2 μg 根部总RNA与试剂盒中的5’-CDS Primer A 5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’(N = A，C，G，or T，V = A，G，or C) (SEQ ID NO:7)和3’-CDS Primer A 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30 V N-3’(SEQ ID NO:8)结合，并在5’RACE中加入SMARTer II A Oligonucleotide，随后分别用SMARTScribe Reverse Transcriptase进行反转录，构建成5’和3’RACE cDNA。上述ShMDH1基因5’EST特异引物和3’EST特异引物分别与试剂盒中的UPM引物5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’(SEQ ID NO:21)配对，以5’和3’RACE cDNA为模板，分别扩增ShMDH1基因的5’端和3’端序列，然后用DNA凝胶回收试剂盒分别回收5’/3’端-PCR的产物。回收得到PCR产物克隆到pMD18-T (TAKARA公司，具体描述见：http://www.takara.com.cn/)载体上进行测序鉴定。将以上获得ShMDH1基因的5’和3’端的序列和前面得到的ShMDH1的部分cDNA序列用MEGA 4.1软件拼接得到柱花草ShMDH1全长cDNA序列。

2、载体的构建

拟南芥过量表达载体的构建：以柱花草根部cDNA为模板，用上游特异引物5’- GGATCCAATGATTAAGCCTTCGATGC -3’(SEQ ID NO:9)和下游特异引物5’- ACGCGTTTACTGGTTGGCGAATT -3’(SEQ ID NO:10)扩增ShMDH1 ORF 1038 bp片段，PCR片段回收测序无误后，通过BamH I和MluⅠ对片段及目的载体进行双酶切后，将ShMDH1基因连接到目的载体pYLRNAi (由华南农业大学刘耀光研究员实验室惠赠)。

酵母过量表达载体的构建：以柱花草根部cDNA为模板，用上游特异引物

5’- CGGGATCCAAAAAAATGTCTATTAAGCCTTCGATGCTC -3’ (SEQ ID NO:11)和下游特异引物5’- GAATTCTTACTGGTTGGCGAATTTG -3’ (SEQ ID NO:12) 扩增1052 bp目的片段，PCR片段回收测序无误后，用BamHⅠ和EcoR I分别酶切PCR产物和目的载体pYES2 vector（Invitrogen公司）。

亚细胞定位分析表达载体的构建：以柱花草根部cDNA为模板，用上游特异引物5’- TCTAGAGATGATTAAGCCTTCG -3’(SEQ ID NO:13)和下游特异引物 5’- GGATCCCGCTGGTTGGCG -3’(SEQ ID NO:14)扩增 ShMDH1开放阅读框片段，PCR片段回收测序无误后，将ShMDH1基因连接到目的载体EGFP (由华南师范大学王晓菁教授实验室惠赠)。

3、ShMDH1亚细胞定位及其基因表达模式分析

1）ShMDH1亚细胞定位分析

将装载ShMDH1-EGFP载体和EGFP空载体通过基因枪转化法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达。然后用荧光显微镜(LEICA DM5000B, 德国)观察洋葱表皮细胞的GFP和PI荧光信号。

结果如图3所示，由结果可知，ShMDH1定位于洋葱表皮细胞中除细胞壁以外的其他部位。

2）ShMDH1基因的表达模式分析

锰对ShMDH1基因表达的影响：

两个柱花草基因型‘TPRC2001-1’和‘Fine Stem’，种子去种皮后经10% NaClO消毒，播入石英砂中，在25 ℃暗室催芽，发芽后移栽至14 L塑料盆中于温室进行营养液栽培。待幼苗第2片复叶完全展开时 (1个月)，对其进行两个锰浓度处理，分别为正常锰浓度5 μM MnSO₄，过量锰浓度400 μM MnSO₄，处理10 d后收获样品，提取根部RNA，反转录成cDNA，进一步用定量PCR检测ShMDH1的表达模式。柱花草的看家基因EF-1a作为内参。用于定量PCR 检测基因表达量的引物分别为：

柱花草EF-1a基因的引物为：

EF-1aF: 5’- CACTTCAGGACGTGTACAAGATC -3’ (SEQ ID NO:15)

EF-1a R: 5’- CTTGGAGAGCTTCATGGTGCA -3’ (SEQ ID NO:16)

ShMDH1基因的引物为：

ShMDH1F: 5’- CCGCTGAGGTTTTCAAGAAGGCAGG -3’ (SEQ ID NO:17)

ShMDH1 R: 5’- CCTGCATGGCCACCTATGACCG -3’ (SEQ ID NO:18)

结果如图4，由结果可知，相对正常锰（5 μM），过量锰（400 μM）处理显著增强了ShMDH1在Fine-stem根部中的表达，而过量锰处理对ShMDH1在TPRC2001-1根部中的表达影响不明显。

实施例2

转基因材料的研究

1、转基因材料的获得

1）转基因拟南芥植株的获得

将构建好的超量表达ShMDH1载体质粒转化至根癌农杆菌Gv3101中，采用农杆菌介导的拟南芥花序转染法获得转基因拟南芥植株。

2）转基因酵母菌株的获得

参照SC easy comp transformation kit（Invitrogen公司）方法，将构建好的酵母表达ShMDH1载体质粒与pYES2空载体分别转化酵母INVSC1（Invitrogen公司）。

2、转基因材料的检测

1）转基因拟南芥植株的检测

将T1代拟南芥种子经潮霉素抗性筛选后，获得T1代转基因植株，收获种子；将T2代种子用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为60%的T2代植株，收获种子；将T3代种子用潮霉素抗性筛选，获得成苗率为100%转基因系。提取该转基因系植株的RNA，反转录成cDNA后，进一步用定量PCR检测超量表达ShMDH1基因的效果。

拟南芥看家基因EF-1a作为参照基因，相对表达量为目的基因ShMDH1的表达量与看家基因表达量的比值。柱花草ShMDH1的检测引物为SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18。

1.1) 拟南芥EF-1a基因的引物为：

EF-1aF: 5’- GTCGATTCTGGAAAGTCGACC -3’ (SEQ ID NO: 19)

EF-1aR: 5’- AATGTCAATGGTGATACCACGC -3’ (SEQ ID NO: 20)

1.2) 反应体系：包含10 μM上下游引物各0.6 μL，2×SYBR Green PCR master mix 10 μL，然后用Mili-Q水补足20 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 1分钟；95 ℃ 15秒，58 ℃ 15秒，72 ℃ 30秒，扩增35个循环。

2）转基因酵母菌株的检测

通过缺尿氨酸筛选培养基筛选阳性转化子，并通过PCR检测酵母细胞DNA中的目的基因ShMDH1，柱花草ShMDH1的检测引物为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12。PCR反应体系为20 μL，包含10 μM上下游引物各0.5 μL，10×PCR buffer 2 μL，2.5 mM dNTP 1.6 μL，Taq酶0.12 μL，酵母菌液1 μL，然后用灭菌ddH₂O补足20 μL。PCR反应程序为：94 ℃ 4分钟；94 ℃ 30秒，57 ℃ 30秒，72 ℃ 60秒，扩增35个循环；72 ℃延伸10分钟。扩增的PCR产物通过1%琼脂糖胶电泳。

3、转基因拟南芥耐锰性分析

1) 根部有机酸的分泌

超量表达ShMDH1转基因拟南芥和野生型拟南芥在固体MS培养基上生长7天后，将大小一致的幼苗转移至液体MS培养基中继续培养7天。将液体MS培养基倒掉，用pH值为5.0的0.5 mM CaCl₂溶液清洗植株3遍，然后用0.5 mM CaCl₂溶液（pH 5.0）收集24小时后，收集液测定苹果酸含量。

2）锰浓度处理对拟南芥生长的影响

T3代超量表达ShMDH1转基因拟南芥和野生型拟南芥种子经消毒后，于正常MS培养基中培养7d，然后将大小一致的幼苗移至含0.1 mM，2 mM和4 mM MnSO₄ 固体MS培养基中处理7d后，收获植株，测定植株鲜重及锰含量。

结果如图5所示，由结果可知，相对野生型拟南芥，超量表达ShMDH1基因显著增加了拟南芥的苹果酸浓度和根系苹果酸的分泌（图5A-C）。并且，超量表达ShMDH1基因显著提高了拟南芥的耐锰能力。相对野生型植株，在过量锰处理下（2 mM和4 mM），转基因拟南芥具有较高的生物量和较低的锰浓度（图5D-F）。

4、转基因酵母细胞耐锰性分析

1) 酵母细胞苹果酸的合成

将装载ShMDH1-pYES2与pYES2空载体的酵母分别在100 mL液体诱导培养基中培养1 d后，4 ℃下6000 g离心10 min收集菌体，1 mL Millipore水清洗2次，冷冻浓缩机（Labconco公司）冻干样品。然后液氮破碎菌体细胞壁。最后用1.2 mL Millipore水溶解， 4 ℃12000 g离心10 min，吸取上清，过0.45 μm微孔滤膜后测定苹果酸含量。

2）锰处理对酵母细胞生长的影响

酵母超量表达ShMDH1及含空载体的菌株在SC培养基中培养至OD600为0.6，稀释至0.2后，再稀释为0.02，0.002，0.0002不同的OD浓度，分别在含有 2% galactose, 1% raffinose, 0.67% yeast nitrogen base w/o amino acids, 0.1% uracil dropout mix, 2% agar，10 mM 或 15 mM MnSO₄的培养基中培养4 d，拍照记录结果。

结果如图6所示，由结果可知，相对pYES2空载体对照酵母菌株，表达ShMDH1基因显著提高了酵母细胞的苹果酸浓度（图6A），并且，显著增强了酵母细胞在过量锰（10 mM和15 mM）处理下的耐锰能力（图6B）。

5、水培试验

水培试验以两个柱花草基因型‘TPRC2001-1’和‘Fine Stem’为材料，种子去种皮后经10% NaClO消毒，播入石英砂中，在25 ℃暗室催芽，发芽后移栽至14 L塑料盆中于温室进行营养液栽培。待幼苗第2片复叶完全展开时 (1个月)，对其进行两个锰浓度处理，分别为正常锰浓度5 μM MnSO₄，过量锰浓度400 μM MnSO₄，处理10 d后收获样品。一部分植株样品用于叶绿素含量，植株生物量及锰含量测定。一部分植株用pH值为5.0的0.5 mM CaCl₂溶液清洗植株3遍后，分别用新配制的40 mL上述营养液收集植株根系分泌的有机酸，收集6 h，收集完后收集液于-80 ℃保存用于有机酸测定。

结果如图1-2所示。由结果可知，相对正常锰浓度(5 μM)，过量锰 (400 μM) 处理10 d显著降低了TPRC2001-1叶绿素浓度和叶片生物量（图1A），但过量锰处理对Fine-stem叶绿素浓度和生物量没有显著影响（图1B）。过量锰处理显著增加了TPRC2001-1和Fine-stem叶部和根部的锰浓度，但过量锰处理下Fine-stem叶部和根部的锰浓度显著低于TPRC2001-1（图1C）。相对正常锰浓度处理，过量锰处理显著增加了Fine-stem根部的苹果酸浓度和苹果酸的分泌，但过量锰处理对TPRC2001-1根部的苹果酸浓度和苹果酸的分泌影响不明显（图2A和2B）。

SEQ ID NO:1

ATGATTAAGCCTTCGATGCTCAGATCCCTCCACTCAGCCGTGTCCCGCGGCTCCTCTCACCTCGCTCGCCGTGGCTACTCCTCCGAGTCGACCCCCGATCGCAAGGTCGTCGTTCTCGGCGCCGCCGGCGGCATCGGCCAGCCCCTCTCCCTCCTCATGAAGCTCAACCCACTCGTTTCCAGCCTCTCCCTTTACGATATCGCCGGCACTCCCGGCGTCGCCGCCGATGTAAGCCACGTCAACACCAGATCTGAGGTGGTTGGATATCAAGGTGAAGGAGAGCTTGGAAAAGCTTTGGAGGGAGCTGATGTCGTTATTATCCCAGCTGGTGTGCCCAGGAAGCCTGGAATGACTCGTGATGATCTTTTCAACATTAATGCTGGCATTGTCAAGTCTCTCTGCACTGCTATTTCCAAGTACTGCCCCAAGGCCCTTGTTAACATGATCAGCAATCCTGTGAACTCCACTGTTCCCATTGCTGCTGAGGTTTTCAAGAAGGCAGGGACATATGATGAGAAGAGATTGTTTGGGGTCACCACCCTTGATGTTGTTAGGGCAAAAACTTTTTATGCTGGAAAGGCCAAAGTTCCAGTTGCTGAGGTCAATGTACCGGTCATAGGTGGCCATGCAGGCATTACTATTCTGCCATTATTTTCTCAAGCAACACCACAAGCCAATTTGGATCATGATGTCATAGTAGCTCTTACTAAGAGAACACAAGATGGAGGAACGGAAGTTGTTGAAGCTAAGGCTGGAAAGGGTTCTGCAACTTTGTCAATGGCTTATGCCGGAGCCCTTTTTGCCGATGCTTGTCTCAAGGGTCTTAATGGTGTCCCAGATGTTGTTGAGTGTTCATTTGTGCAATCTAATGTCACTGAACTTCCTTTCTTCGCTTCAAAGGTGAGGCTTGGGAAGAATGGCGTGGAAGAAGTTCTGGGGTTGGGGTCTCTTTCAGATTTTGAGAAAGAAGGCCTTGAAAAGCTTAAGCCTGAGCTCTTGTCATCTATTGAGAAGGGAATCAAATTCGCCAACCAGTAA

SEQ ID NO:2

MIKPSMLRSLHSAVSRGSSHLARRGYSSESTPDRKVVVLGAAGGIGQPLSLLMKLNPLVSSLSLYDIAGTPGVAADVSHVNTRSEVVGYQGEGELGKALEGADVVIIPAGVPRKPGMTRDDLFNINAGIVKSLCTAISKYCPKALVNMISNPVNSTVPIAAEVFKKAGTYDEKRLFGVTTLDVVRAKTFYAGKAKVPVAEVNVPVIGGHAGITILPLFSQATPQANLDHDVIVALTKRTQDGGTEVVEAKAGKGSATLSMAYAGALFADACLKGLNGVPDVVECSFVQSNVTELPFFASKVRLGKNGVEEVLGLGSLSDFEKEGLEKLKPELLSSIEKGIKFANQ。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种植物耐锰毒害重要基因ShMDH1的克隆及其应用

<130>

<160> 21

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1038

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atgattaagc cttcgatgct cagatccctc cactcagccg tgtcccgcgg ctcctctcac 60

ctcgctcgcc gtggctactc ctccgagtcg acccccgatc gcaaggtcgt cgttctcggc 120

gccgccggcg gcatcggcca gcccctctcc ctcctcatga agctcaaccc actcgtttcc 180

agcctctccc tttacgatat cgccggcact cccggcgtcg ccgccgatgt aagccacgtc 240

aacaccagat ctgaggtggt tggatatcaa ggtgaaggag agcttggaaa agctttggag 300

ggagctgatg tcgttattat cccagctggt gtgcccagga agcctggaat gactcgtgat 360

gatcttttca acattaatgc tggcattgtc aagtctctct gcactgctat ttccaagtac 420

tgccccaagg cccttgttaa catgatcagc aatcctgtga actccactgt tcccattgct 480

gctgaggttt tcaagaaggc agggacatat gatgagaaga gattgtttgg ggtcaccacc 540

cttgatgttg ttagggcaaa aactttttat gctggaaagg ccaaagttcc agttgctgag 600

gtcaatgtac cggtcatagg tggccatgca ggcattacta ttctgccatt attttctcaa 660

gcaacaccac aagccaattt ggatcatgat gtcatagtag ctcttactaa gagaacacaa 720

gatggaggaa cggaagttgt tgaagctaag gctggaaagg gttctgcaac tttgtcaatg 780

gcttatgccg gagccctttt tgccgatgct tgtctcaagg gtcttaatgg tgtcccagat 840

gttgttgagt gttcatttgt gcaatctaat gtcactgaac ttcctttctt cgcttcaaag 900

gtgaggcttg ggaagaatgg cgtggaagaa gttctggggt tggggtctct ttcagatttt 960

gagaaagaag gccttgaaaa gcttaagcct gagctcttgt catctattga gaagggaatc 1020

aaattcgcca accagtaa 1038

<210> 2

<211> 345

<212> PRT

<213> 序列

<400> 2

Met Ile Lys Pro Ser Met Leu Arg Ser Leu His Ser Ala Val Ser Arg

1 5 10 15

Gly Ser Ser His Leu Ala Arg Arg Gly Tyr Ser Ser Glu Ser Thr Pro

20 25 30

Asp Arg Lys Val Val Val Leu Gly Ala Ala Gly Gly Ile Gly Gln Pro

35 40 45

Leu Ser Leu Leu Met Lys Leu Asn Pro Leu Val Ser Ser Leu Ser Leu

50 55 60

Tyr Asp Ile Ala Gly Thr Pro Gly Val Ala Ala Asp Val Ser His Val

65 70 75 80

Asn Thr Arg Ser Glu Val Val Gly Tyr Gln Gly Glu Gly Glu Leu Gly

85 90 95

Lys Ala Leu Glu Gly Ala Asp Val Val Ile Ile Pro Ala Gly Val Pro

100 105 110

Arg Lys Pro Gly Met Thr Arg Asp Asp Leu Phe Asn Ile Asn Ala Gly

115 120 125

Ile Val Lys Ser Leu Cys Thr Ala Ile Ser Lys Tyr Cys Pro Lys Ala

130 135 140

Leu Val Asn Met Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Thr Val Pro Ile Ala

145 150 155 160

Ala Glu Val Phe Lys Lys Ala Gly Thr Tyr Asp Glu Lys Arg Leu Phe

165 170 175

Gly Val Thr Thr Leu Asp Val Val Arg Ala Lys Thr Phe Tyr Ala Gly

180 185 190

Lys Ala Lys Val Pro Val Ala Glu Val Asn Val Pro Val Ile Gly Gly

195 200 205

His Ala Gly Ile Thr Ile Leu Pro Leu Phe Ser Gln Ala Thr Pro Gln

210 215 220

Ala Asn Leu Asp His Asp Val Ile Val Ala Leu Thr Lys Arg Thr Gln

225 230 235 240

Asp Gly Gly Thr Glu Val Val Glu Ala Lys Ala Gly Lys Gly Ser Ala

245 250 255

Thr Leu Ser Met Ala Tyr Ala Gly Ala Leu Phe Ala Asp Ala Cys Leu

260 265 270

Lys Gly Leu Asn Gly Val Pro Asp Val Val Glu Cys Ser Phe Val Gln

275 280 285

Ser Asn Val Thr Glu Leu Pro Phe Phe Ala Ser Lys Val Arg Leu Gly

290 295 300

Lys Asn Gly Val Glu Glu Val Leu Gly Leu Gly Ser Leu Ser Asp Phe

305 310 315 320

Glu Lys Glu Gly Leu Glu Lys Leu Lys Pro Glu Leu Leu Ser Ser Ile

325 330 335

Glu Lys Gly Ile Lys Phe Ala Asn Gln

340 345

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<400> 3

attattgccg ctgaggtttt caaga 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<400> 4

gattcccttc aagcaagcat cg 22

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<400> 5

gaaaacctca gcagcaatgg gaacagt 27

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<400> 6

ctgctgaggt tttcaagaag gcagg 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

tttttttttt tttttttttt tttttvn 27

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

aagcagtggt atcaacgcag agtactvn 28

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 序列

<400> 9

ggatccaatg attaagcctt cgatgc 26

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 10

acgcgtttac tggttggcga att 23

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 序列

<400> 11

cgggatccaa aaaaatgtct attaagcctt cgatgctc 38

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<400> 12

gaattcttac tggttggcga atttg 25

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<400> 13

tctagagatg attaagcctt cg 22

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 序列

<400> 14

ggatcccgct ggttggcg 18

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 序列

<400> 15

cacttcagga cgtgtacaag atc 23

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<400> 16

cttggagagc ttcatggtgc a 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 序列

<400> 17

ccgctgaggt tttcaagaag gcagg 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<400> 18

cctgcatggc cacctatgac cg 22

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 序列

<400> 19

gtcgattctg gaaagtcgac c 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 序列

<400> 20

aatgtcaatg gtgataccac gc 22

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 序列

<400> 21

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

Claims

1.一个植物耐锰毒害关键基因ShMDH1，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种权利要求1所述的ShMDH1编码的蛋白质，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种表达载体，其特征在于含有权利要求1所述耐锰毒基因ShMDH1。

4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述耐锰毒基因ShMDH1在制备转基因植物中的应用。

6.权利要求1所述耐锰毒基因ShMDH1在制备促进植物适应酸性土壤制剂或提高植物锰耐受力上的应用。

7.权利要求3所述的表达载体在制备转基因植物中的应用。

8.权利要求3所述的表达载体在制备促进植物适应酸性土壤的制剂或提高植物锰耐受力上的应用。

9.根据权利要求5-8中任一项所述的应用，其特征在于所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于所述双子叶植物为豆科植物、烟草、向日葵、甜菜、辣椒、马铃薯或番茄；所述的单子叶植物为水稻、小麦、大麦、玉米、高粱、甘蔗、燕麦或黑麦。