CN102757924A - 一种红球菌及其在制备(s)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013，其保藏编号为CGMCC No.5911；该红球菌酯酶的制备方法，以及利用该红球菌及其酯酶催化制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸[简写:(S)-(+)-DMCPA]的方法。本发明的有益效果在于：利用本发明提供的红球菌及其酯酶催化2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的对映选择性水解制备(S)-(+)-DMCPA的工艺具有专一性强、催化效果良好、反应条件温和、对环境友好等显著优点。其目标产物(S)-(+)-DMCPA的光学纯度>98% ee，单次拆分收率在40%以上。

Description

一种红球菌及其在制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，特别涉及一株红球菌(Rhodococcus sp.)ECU1013，其保藏编号为CGMCC No.5911。该红球菌酯酶的制备方法，以及利用该红球菌细胞及其酯酶催化制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法。

背景技术

(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸[(S)-(+)-DMCPA]是合成西司他汀的重要手性中间体。西司他汀(Cilsatatin)是由美国默克(Merck)公司开发的肾脱氢二肽酶抑制剂，其本身并无抗菌效果，仅仅作为一种特异性的酶抑制剂；亚胺培南(Imipenem)是一种β-内酰胺类抗生素，具备高效的抗菌活性，但易于被肾脱氢二肽酶所破坏。由西司他汀与亚胺培南以1:1比例制成的复合制剂—泰能(Tienam)，是第一个成功应用于临床的新型碳青霉烯类抗生素，特别适用于由多种病原体所致疾病以及需氧/厌氧菌共同引起的混合感染。目前泰能是用于重症感染的首选药物，同时也是全球畅销药物之一。

西司他汀的结构式如下式所示，该化合物可拆分为三个中间体：(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺(甲酸)、7-溴(氯)-2-氧代庚酸和L-半胱氨酸。研究表明，西司他汀的主要活性中间体正是(S)-(+)-2,2-二甲基环丙甲酰胺(甲酸)。

西司他汀结构式

根据文献调研，生产(S)-(+)-DMCPA的方法包括两大类：不对称合成法；外消旋体拆分法。对外消旋体进行拆分是许多光学纯手性化合物制备的常用方法，按照目前文献报道，(S)-(+)-DMCPA的拆分制备法又可分为化学拆分法和生物拆分法两类。

1)化学拆分法

2,2-二甲基环丙烷甲酸的化学拆分，大多是通过光学活性试剂的拆分方法，即利用光学活性的手性试剂与DMCPA反应生成非对映异构的手性酯或盐，它们在溶剂中的溶解度相差较大，通过分步结晶将二者分开，然后分别进行水解或酸化，从而实现(±)-DMCPA的分离。所用的化学拆分方法存在很多缺点：一些手性拆分试剂难以得到或价格昂贵，或不易回收利用；一些拆分方法步骤繁琐，通常需要反复多次的结晶，物料损失较大，单次拆分收率较低，大多在20~30%之间。上述这些缺点严重地限制了其在工业上的应用，正在逐渐被其他更好的方法所替代。

2)生物拆分法

生物拆分法是利用微生物整细胞或其所含的酶作为催化剂，在一定条件下，催化外消旋体中的一个对映异构体发生反应，而对另一个异构体不起催化作用(或作用很小)，从而使两种对映体彼此分开，达到外消旋体拆分的目的。由于该法反应条件温和、低能高效、绿色环保，引起了人们极大的关注。采用生物拆分法制备(S)-(+)-DMCPA这种手性酸，一般采用的是水解酶。根据水解酶种类的不同，用于拆分的底物可分为三种：2,2-二甲基环丙烷甲腈、2,2-二甲基环丙烷甲酰胺和2,2-二甲基环丙烷甲酸酯。

***等(J.Mol.Catal.B:Enzym.2002，18:267-272)以2,2-二甲基环丙烷甲腈为底物，利用红球菌（Rhodococcus sp.）AJ270整细胞催化2,2-二甲基环丙烷甲腈的酰胺化以及2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的对映选择性水解，底物浓度20mM，30℃反应3h后生成(R)-(-)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺和(S)-(+)-DMCPA，两者的ee值分别为76%和82%，产率分别为46%和39%。瑞士Lonza公司的Robins等报道从菌株Comomonas acidivorans A:18中利用基因技术克隆出专一性(R)-构型酰胺水解酶，以2,2-二甲基环丙烷甲酰胺为拆分底物，将(R)-(-)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺优先水解为(R)-(-)-2,2-二甲基环丙烷甲酸，从而得到高光学纯度的(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺。在37℃下反应7~24h，(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的收率为36~46%，光学纯度为98.2%(EP 0524604，US 5427934)。郑裕国等建立了一种高通量筛选立体选择性酰胺酶的方法，由此发现了两株产(R)-型酰胺水解酶的微生物新菌株，一菌株为Delftia tsuruhatensis CCTCC No.205114，细胞经固定化后，10mM2,2-二甲基环丙烷甲酰胺，pH8.5，35℃反应40min，分离得到(R)-(-)-DMCPA，产率为49.5%，ee值>99%；而剩余(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率>49%，ee值为97.7%(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2010，37:503-510)；另一菌株为Brevibacterium epidermidis CCTCC No.207076，使用整细胞作催化剂，在底物浓度10mM，pH7.4，35℃条件下反应70min，所得(R)-(-)-DMCPA的产率为49.9%，ee值为69.7%，剩余(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率为41.1%，ee值>99%(J.Appl.Microbiol.2008，105:1150-1157)。

王普等采用商品化脂肪酶Novozym 435催化2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯对映选择性水解生成(S)-(+)-DMCPA，以pH值为7.2的磷酸缓冲液(1mol/L)为反应介质，脂肪酶Novozym435用量为16g/L，底物浓度为65mmol/L时，30℃反应64h，产物的收率和光学纯度分别为45.6%和99.2%(Chin.J.Catal.2010，31:651-655)。随后，王普等又公开了通过自行筛选得到的微生物菌株—红球菌(Rhodococcus sp.)ZJPH 1003，以其整细胞为催化剂，以2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯为拆分底物，当底物浓度为30mM时，反应28h后分离所得目标产物(S)-(+)-DMCPA的ee值为82.5%，产率为41.3%(CN 102161978)。

综上所述，利用生物催化拆分法制备(S)-(+)-DMCPA，已经取得了较大的进展，但是目前仍存在着一些问题，例如：底物2,2-二甲基环丙烷甲腈在合成过程中需使用剧毒的氰化物，影响了环境效益；商品酶的催化效果虽然较好，但其价格昂贵，酶的活性相对偏低，重复使用次数不多(4次)；红球菌(Rhodococcus sp.)ZJPH 1003在对映选择性方面还不能达到制药工业的要求。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有技术催化底物2,2-二甲基环丙烷甲腈制备(S)-(+)-DMCPA的过程中需使用剧毒的氰化物，对环境产生不利影响；现有的商品化酯酶价格昂贵，酶的活性相对偏低，重复使用次数不多，以及现有的红球菌在对映选择性方面还不能达到制药工业要求的问题，提供一株红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013，其保藏编号为CGMCC No.5911。所述红球菌培养方法、所述红球菌酯酶的制备方法和该红球菌菌株及其酯酶在催化对映选择性水解反应制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用。

本发明人通过对自然界的微生物进行广泛的菌种筛选，获得了一株具有高对映选择性的优良红球菌株(Rhodococcus sp.)ECU 1013 CGMCC No.5911，同时大大提高了生物催化制备(S)-(+)-DMCPA技术路线的经济性和可行性，从而完成了本发明。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一株红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013，其保藏编号为CGMCC No.5911。

本发明所述的红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013，是发明人从来自上海的土壤样品中，采用传统富集筛选方法得到的一株能够高度对映选择性(E＞100)优先催化(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸酯水解的细菌。

其中筛选菌株所用的培养基为本领域常规使用的培养基，本发明所述培养基优选配方为：

1)第一轮富集培养基：酵母膏1g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂ 0.1g/L，自来水配制，pH7.0。添加终浓度为2.0mM的2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯，预先溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，DMSO的终浓度为5%(v/v)。

2)第二轮富集培养基：(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂ 0.1g/L，自来水配制，pH7.0。添加终浓度为5.0mM的2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯，预先溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，DMSO的终浓度为5%(v/v)。

3)三丁酸甘油酯平板培养基：三丁酸甘油酯10g/L，吐温-8010g/L，蛋白胨16g/L，酵母膏10g/L，NaCl5g/L，琼脂粉15g/L。

4)丰富培养基：葡萄糖5g/L，酵母膏5g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄ 0.2g/L，NaCl 1g/L，CaCl₂ 0.1g/L，去离子水配制，pH7.0。

本发明所述红球菌筛选方法为本领域常规使用的筛选方法，所述筛选方法的一较佳实例包括以下步骤：

1)富集培养：从江苏、上海、温州、山东、成都、长沙等地不同环境中采集土壤样品。取少许土样加入到2mL第一轮富集培养基中，30℃、180rpm振摇培养2天后，吸取200μL培养液，转接到2mL第二轮富集培养基中，相同条件下继续培养2天。

2)平板单菌分离：取500μL第二轮富集培养液，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，然后用薄板层析法定性检测是否有酶促水解产物2,2-二甲基环丙烷甲酸的生成。将有明显产物生成的培养液进行梯度稀释后，涂布三丁酸甘油酯培养基平板，倒置于30℃恒温培养箱中培养1~2天。用灭菌牙签挑取产透明圈的单菌落，总共得到221株具有明显透明圈的菌株，保存于丰富培养基平板上，并进行编号，进入后续筛选。

3)初筛：挑取丰富培养基平板保存的单菌落，接入3mL丰富培养基中，30℃、180rpm振摇培养24h，将培养液离心，沉淀的细胞用磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)充分悬浮，在此细胞悬浮液和离心上清液中分别加入终浓度为5mM的2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯进行反应，30℃，900rpm振摇反应24h。反应结束后取200μL反应液，加入20%的H₂SO₄溶液调节至pH<2，然后加入200μL乙酸乙酯进行萃取，萃取液采用薄板层析法定性检测。在上述221株初筛分离的三丁酸甘油酯活性菌株中，有39株能催化2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯水解生成2,2-二甲基环丙烷甲酸，采用甘油管加以保存。取一定体积的种子液分装至事先灭菌的菌种保存管，以1:1(v/v)的量加入50%的无菌甘油，混合后于-70℃保存。

4)复筛：取初筛保存的对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯具有水解活性的微生物菌株0.5mL接种到装50mL丰富培养基的250mL三角烧瓶中，30℃、180rpm振摇培养24h。培养结束后，8800rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤两次后，取0.5g湿细胞，10mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)充分悬浮，加入终浓度为10mM的2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯，在50mL的磨口三角瓶中振摇反应24h。反应结束后，取少量反应液萃取产物，以气相色谱检测产物的ee值和转化率。在初筛筛选出的39株菌体中，确认有26株可以催化2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯水解生成(S)-2,2-二甲基环丙烷甲酸，其中有6株表现出相对较高的活性(反应转化率>17%)和对映选择性(水解产物的eep>75%)，结果见图1所示，其中每个圆圈代表1个菌株，而黑色圆点代表催化活性和对映选择性都比较高的菌株。

5)复证

通过上述筛选结果，结合王普等公开的筛选结果，显示自然界中对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯或乙酯具有高对映选择性催化活性的微生物菌株较少，复筛所得菌株的对映选择性普遍不高。

通过变换底物，采用三种不同醇基的2,2-二甲基环丙甲酸酯[(2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯和2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯)]作为复证底物，比较上述获得的6株具有较高活性和对映选择性的菌株催化不同2,2-二甲基环丙烷甲酸酯水解的情况，结果见表1。最终确定了目标菌株7-9，该菌株对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯具有较高的对映选择性，其水解产物的ee值高于92%。

表1.各菌株对环丙烷甲酸酯的催化状况

挑取菌株7-9的单菌落进行培养，采用常规方法提取菌株的基因组DNA，以所述菌株的基因组DNA为模板，使用16S rDNA扩增通用引物进行PCR扩增，具体方法请参考Appl.Microbiol.Biotechnol.2010，86:83-91。

经琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出大约1400bp大小的目的片段，将PCR产物用凝胶纯化试剂盒(北京天根生化公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒)进行纯化回收，最后将回收的DNA片段送去测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示(北京六合华大基因公司提供测序服务)。

该16S rDNA序列已提交GenBank(GenBank登录号为JX013910)，其序列在NCBI数据库中进行比对。在NCBI数据库同源性比对中，我们获得的红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013与红球菌（Rhodococcus erythropolis）的16S rDNA的相似性为99%；而专利文献CN 102161978中涉及到的红球菌株ZJPH1003与红球菌（Rhodococcus phenolicus）的16S rDNA序列相似性最高；将红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013与红球菌ZJPH1003的16SrDNA进行相互比对，其相似性仅为96%。因此，比对结果表明，本发明筛选获得的红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013与专利文献CN 102161978提到的红球菌ZJPH1003是同属但不同种。因此我们将获得的菌株命名为红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013。

本发明所述的红球菌具有如下微生物学特征：

1)形态特征：

球状，3~4μm，不产芽孢，无鞭毛，革兰氏染色阳性。

2)平板固体培养基上的菌落特征(30℃，24h)：

细胞为球状，淡粉色，在固体培养基上呈潮湿状，底部有***，边缘粗糙，不透明。

3)生长环境

适宜的生长温度为25~40℃，可以在pH5.0~9.0的环境中生存。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种如上所述的红球菌的培养方法，其中包括将本发明所述的红球菌在发酵培养基中进行发酵培养。

其中所述红球菌的发酵培养基为本领域常规的微生物发酵培养基，本发明所述发酵培养基成分较佳地包括：葡萄糖较佳地含量为5~20g/L，优选地含量为5g/L，酵母膏较佳地含量为5~10g/L，优选地含量为5g/L，NaCl较佳地含量为1~5g/L，优选地含量为1g/L，MgSO₄较佳地含量为0.2~2g/L，优选地含量为0.2g/L，KH₂PO₄较佳地含量为1~5g/L，优选地含量为1g/L，CaCl₂较佳地含量为0.1~1g/L，优选地含量为0.1g/L，pH较佳地为6.0~7.5，pH优选地为6.0。

其中所述红球菌的发酵培养可采用本领域常规的红球菌发酵培养条件，本发明所述发酵培养条件为：培养温度较佳地为25~35℃，培养温度优选地为30℃，培养时间较佳地为12~48小时，培养时间优选地为36小时，红球菌相对于发酵培养基体积的接种量较佳地为1~10%(v/v)，pH较佳地为5.0~9.0。

本发明所述红球菌发酵培养的一较佳实例为：

取4℃保藏的红球菌斜面培养基，以1~10%(v/v)的比例接种到发酵培养基中，25~35℃，150~200rpm振摇培养8~12h，形成种子液。将红球菌种子液以5~10%(v/v)比例接种到装有发酵培养基的发酵罐中，25~35℃进行24~48h发酵培养，培养期间通气量为0.8~1.2vvm，发酵期间不控制pH。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：如上所述的红球菌在催化2,2-二甲基环丙烷甲酸酯进行对映选择性水解反应制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用。

其中所述的应用方式优选地为将本发明所述红球菌作为对映选择性水解反应催化剂，制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸产物。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：一种红球菌酯酶的制备方法，其中所述方法包括以下步骤：

(1)发酵培养本发明所述红球菌，将培养混合物离心后获得红球菌整细胞；或

(2)将步骤(1)所得红球菌整细胞破碎后制备成红球菌酯酶粗酶液；或

(3)将步骤(2)所得粗酶液冷冻干燥后制备成红球菌酯酶粗酶粉。

其中步骤(1)所述红球菌酯酶制备方法为本领域常规使用的酯酶制备方法。步骤(1)中所述的发酵培养红球菌的条件如上文所述，其中所述离心速度较佳地为8000~10000rpm，离心时间较佳地为15~30min。

其中步骤(2)所述红球菌整细胞破碎方法为本领域常规的细胞破碎方法。所述破碎方法较佳地包括以下步骤：将收获的红球菌湿菌体用500~1000ml磷酸盐缓冲液(10mM,pH7.0)重新悬浮，所述磷酸盐缓冲液体积优选地为700ml，较佳地通过60~100目的滤网过滤，滤网优选地为100目，压力较佳地为800~1000bar连续破碎二次，所述压力优选为1000bar，离心速度较佳地为8000~10000rpm，优选地为9000rpm，离心时间较佳地为20~30min，优选为20分钟，收集破碎上清液即得红球菌酯酶粗酶液。

其中步骤(3)所述的粗酶液冷冻干燥方法为本领域常规的冷冻干燥方法。本发明所述粗酶液的冷冻干燥方法较佳地为：将步骤(2)所得红球菌酯酶粗酶液放入-80℃冰箱预冻过夜，在真空度0.1~0.2mbar，冷冻温度-50~-80℃的条件下冷冻干燥24~48h，即得红球菌酯酶粗酶粉。所述红球菌酯酶粗酶粉比活力为1~2u/g，储存于4℃备用。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之五是：一种利用本发明所述的红球菌制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法，其中包括如下步骤：在单水相***或水-有机溶剂***的反应体系中，在红球菌酯酶的催化作用下，2,2-二甲基环丙烷甲酸酯进行对映选择性水解反应形成(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸，从反应液中分离获得(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。

其中所述酯酶为本领域常规使用的酯酶，本发明所述酯酶较佳地包括：发酵培养本发明所述红球菌所得的发酵液离心后获得的红球菌整细胞；将所得红球菌整细胞进行破碎后获得的红球菌酯酶粗酶液；或将所得红球菌酯酶粗酶液冷冻干燥后获得的红球菌酯酶粗酶粉。

其中所述2,2-二甲基环丙烷甲酸酯较佳地包括2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯或2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯。

其中所述单水相***为本领域常规的单水相反应体系，本发明所述单水相反应体系较佳地包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述单水相溶剂***的pH为4.0~10.0。其中所述的水-有机溶剂***中的有机溶剂为本领域常规使用的有机溶剂，所述有机溶剂的LogP较佳地为1.9~4.5。其中所述有机溶剂较佳地包括异丙醚、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种或几种，所述有机溶剂优选为异辛烷。其中所述有机溶剂与水相的体积比较佳的为1:1~1:9，所述有机溶剂与水相的体积比优选为1:7。

其中所述的制备方法为本领域常规制备方法。其中所述制备方法的反应体系包括：底物浓度较佳地为5~400mM，优选地为5mM，基于所述底物的催化剂用量较佳地为：2~10g整细胞/mmol底物或者1~7单位酶/mmol底物；反应温度较佳地为30~45℃，优选地为30℃，pH较佳地为4.0~10.0，优选地为7.0，反应时间较佳地为1~100小时，优选地为72小时。

其中所述水解产物(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的分离方法为本领域常规方法的产物分离方法，本发明所述产物分离方法较佳地包括以下步骤：

(1)调节反应液的pH>7，加入有机溶剂萃取，取水相萃余液；

(2)调节步骤(1)所得水相萃余液的pH<2，再次加入有机溶剂萃取；

(3)将步骤(2)的有机溶剂萃取液干燥后蒸馏除去溶剂，即得所述产物(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。

其中步骤(1)所述反应液的pH值优选为7~10，其中有机溶剂优选地包括二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或两种，所述有机溶剂的加入量优选地为有机溶剂与反应液的体积比1:1~2:1。

其中步骤(2)所述水相萃余液的pH值优选为1~2，有机溶剂优选为二氯甲烷或乙酸乙酯中的一种或两种，所述有机溶剂的添加量优选地为有机溶剂与反应液的体积比1:1~2:1。

其中步骤(3)优选地为：将步骤(2)所得的萃取液用饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥过夜，蒸馏温度较佳地为60~80℃，除去溶剂即得所述产物(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。

将本发明所述红球菌应用于催化2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的对映选择性水解制备(S)-(+)-DMCPA的一较佳实例包括如下步骤：

1)红球菌的发酵培养

将红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013在灭菌的丰富培养基平板上划线，于25~35℃静置培养2天后挑取单菌落，划斜面培养，2天后置于冰箱4℃保藏备用，每个月转接一次。

取4℃保藏的红球菌斜面，挑取一环接种到装有100mL丰富培养基的500mL三角烧瓶中，30℃、180rpm振摇培养10h作为种子液。基于培养基体积，按1~10%(v/v)的接种量转接至发酵培养基中。发酵培养基组成和浓度如下：葡萄糖5~20g/L，酵母膏5~10g/L，NaCl 1~5g/L，MgSO₄ 0.2~2g/L，KH₂PO₄ 1~5g/L，CaCl₂ 0.1~1g/L，自来水配制，pH 6.0~7.5。培养温度优选25~35℃，培养时间为12~48h。

2)催化剂的制备

培养结束后，培养液离心，收集湿细胞，即得整细胞催化剂；采用高压匀浆的方法对获得的湿细胞进行破碎，破碎液离心，获得粗酶液；粗酶液冷冻干燥后获得冻干粗酶粉。

3)催化反应

2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的生物催化转化涉及(S)-(+)-DMCPA制备的反应式如下：

应用上述步骤(2)制备所得的生物催化剂(红球菌整细胞或粗酶粉)在单水相或水-有机溶剂两相反应体系中进行酶促催化转化。底物浓度为5~400mM；基于底物的催化剂用量为：2~10g整细胞/mmol底物或者1~7单位酶/mmol底物；反应液pH为4.0~10.0，反应温度为30~45℃，反应时间为1~100h。反应完全后从反应混合物中分离得到水解产物(S)-(+)-DMCPA，精制后得到纯品，ee>98%。所述的底物包括：2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯或者2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯，优选2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯。

其中所述反应液的pH为4.0~10.0，所述反应液较佳地包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或者甘氨酸-NaOH缓冲液。在反应过程中流加碱液，如NaOH溶液、Na₂CO₃溶液或者氨水，以中和水解过程中生成的酸，维持反应液pH恒定。

2,2-二甲基环丙烷甲酸酯在水中的溶解度较低，采用水-有机溶剂两相反应体系是生物转化中提高水不溶性底物浓度的重要方法。所述的有机相可选择LogP值在1.9~4.5之间的有机溶剂，包括异丙醚、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷或者异辛烷。有机溶剂在反应体系中的体积比为10~50%(v/v)。本发明优选的有机溶剂为异辛烷，加入量为反应液总体积的12.5%(v/v)。

其中所述的分离方法为：用碱溶液将反应液的pH调节至碱性，较佳地为pH>9，加入有机溶剂。所述有机溶剂为本领域通常使用的有机溶剂，较佳地包括：二氯甲烷或乙酸乙酯，有机溶剂的加入量与萃取反应液体积比为1:1。萃取1~2次，取水相萃余液，用酸溶液(优选浓度为20%的H₂SO₄)调节萃余液的pH至酸性，较佳地为pH<2，加入与萃余液等体积的有机溶剂萃取两次，合并萃取液，有机相用饱和食盐水洗涤两次，干燥后蒸馏除去溶剂，即得产物(S)-(+)-DMCPA。

本发明中所述产物的对映体过量值(ee_p)和产率通过气相色谱法检测，检测条件如下：色谱柱为手性CP-Chirasil-Dex CB毛细管柱(25m×0.25mm×0.25μm)；载气为N₂，检测器为氢火焰离子检测器(FID)；进样口温度280℃，检测器温度350℃；采用程序升温：在80℃保温3min，以10℃/min的速度升温至180℃，保持3min。

取一定体积的反应液，用浓度为20%的H₂SO₄溶液将反应液的pH调至<2，加入等体积的含有内标物(十二烷)的乙酸乙酯标准溶液萃取反应液中的底物和产物，由气相色谱分析得到的(S)-和(R)-对映体的峰面积，计算产物的光学纯度。具体计算方法为：(% ee_p)=(A_S-A_R)/(A_S+A_R)×100%，其中A_S和A_R分别为反应后(S)-和(R)-两种异构体的峰面积。

产率的计算方法为：以十二烷为内标，根据2,2-二甲基环丙烷甲酸/内标物(A_acid/A_sd)的峰面积比与2,2-二甲基环丙烷甲酸/内标物的浓度比(C_acid/C_sd)的对应关系绘制产物标准曲线，以内标物浓度来计算出产物浓度。产率=C_acid/C_s0×100%，C_acid为生成产物的浓度，C_s0为初始底物浓度。

反应的对映选择性(E)按公式计算得到：

其中c为反应的转化率或产率，ee_p为产物的ee值。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：采用本发明提供的红球菌（Rhodococcus sp.）ECU1013 CGMCC No.5911或者其酯酶制剂催化制备(S)-(+)-DMCPA，不仅具有良好的催化效果，所得产物(S)-(+)-DMCPA的光学纯度达到了98%以上；而且该催化剂易于制备，稳定性良好，催化反应条件温和，对环境友好，具有极大的工业应用前景。

菌株保藏

本发明提供的红球菌（Rhodococcus sp.）菌株ECU 1013，已于2012年3月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。其保藏编号为：CGMCC No.5911。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是红球菌（Rhodococcus sp.）ECU 1013 CGMCC No.5911复筛结果图。

图2是pH值对红球菌催化2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯酶促水解反应的影响效果图。

图3是水-有机溶剂体系中水-异辛烷两相体积比对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯酶促水解反应的影响效果图。

图4是实施例19反应结束时样品的气相色谱图。

图5是(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的核磁图谱。

具体实施方式

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013 CGMCC No.5911的摇瓶发酵培养

摇瓶发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖5，酵母膏5，NaCl 1，KH₂PO₄ 1，MgSO₄ 0.2，CaCl₂ 0.1，pH 6.0，自来水配制，121℃高温灭菌20min。取4℃保藏的红球菌斜面，挑取一环接种到装有100mL摇瓶发酵培养基的500mL三角烧瓶中，30℃，180rpm振摇培养36h，发酵液细胞活力约为3.2u/L。培养结束后，8800rpm离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤两次后，保存于4℃备用。细胞活力单位(u)定义为：30℃，pH7.0的条件下，每小时催化2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯水解生成1.0μmol的2,2-二甲基环丙烷甲酸所需的细胞量。

实施例2红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013 CGMCC No.5911的发酵罐培养以及该红球菌酯酶粗酶粉制备

发酵培养基配方(g/L)：葡萄糖20，酵母膏10，NaCl5，KH₂PO₄5，MgSO₄2，CaCl₂1，pH7.5，121℃高温灭菌20min。种子液培养基配方同发酵培养基。取4℃保藏的红球菌斜面，挑取一环接种到装有100mL种子液培养基的500mL三角烧瓶中，35℃，180rpm振摇培养12h。将三瓶种子液(300ml)接入到装有3L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃进行发酵培养。通气量：0.8~1.2vvm，发酵期间不控制pH。培养25h后，发酵液细胞活力达到11u/L，9000rpm离心收集细胞，菌体湿重达40g/L。

收获的湿菌体用700ml磷酸盐缓冲液(10mM,pH7.0)重新悬浮，高压匀浆破碎，冷冻干燥制得粗酶粉。具体步骤为：待破碎菌液经过100目的滤网过滤，在1000bar压力下连续破碎二次，9000rpm离心20min收集破碎上清液，放入-80℃冰箱预冻过夜，在真空度0.1mbar，冷冻温度-50℃的条件下冷冻干燥48h，即得粗酶粉。其比活力为1.4u/g，储存于4℃备用。

实施例3红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013 CGMCC No.5911细胞催化2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯的酶促水解

取0.5g实施例1所得的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中，加入5mM的2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯，反应混合物在30℃，180rpm振摇反应72h。反应结束后，取100μL反应液，加入20%的H₂SO₄溶液调节pH至<2，加入等体积的乙酸乙酯萃取产物和底物，通过气相分析产物的ee值和产率。产物ee值为83.9%，产率21.2%。

实施例4-6红球菌(Rhodococcus sp.)ECU 1013 CGMCC No.5911催化三种不同2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的酶促水解

取1.0g实施例1所得的湿细胞悬浮于10mL的磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.0)中，分别加入底物2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯和2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯，终浓度为10mM。反应混合物在30℃，180rpm振摇反应24h。反应结束后，取样萃取其中的产物和底物，通过气相分析产物的ee值和产率，结果见表2。

表2.红球菌对三种2,2-二甲基环丙烷甲酸酯的催化性能比较

实施例7pH对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯酶促水解反应的影响

取25mg实施例2所得的冻干酶粉溶解于0.5mL不同pH的缓冲液中(柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：pH4.0、5.0；磷酸盐缓冲液：pH6.0~8.0；Tris-HCl缓冲液：pH8.0、9.0；甘氨酸-NaOH缓冲液：pH9.0、10.0)，加入终浓度为10mM的底物，反应混合物在30℃，1000rpm条件下反应30h。反应结束后取样萃取，通过气相色谱分析产物的对映体过量值(ee_p)和产率，结果见图2。

相同条件下，缓冲液中只加入底物，不加酶粉作为空白对照，反应相同时间以检测底物在不同pH条件下的自发水解情况。如图2所示，pH在6.5~8.5范围内，水解产物的ee值和产率均较高，变化差异非常小。在pH6.0以下和pH9.0以上，反应速率和产物的光学纯度都有所下降。在pH4.0~9.0之间，底物基本上不发生非酶催化的自发水解反应，在碱性体系pH10.0下也非常弱，反应30h的自发水解率仅为1.7%，说明底物酯是相当稳定的。

实施例8-11温度对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯酶促水解反应的影响

取25mg实施例2所得的冻干酶粉溶解于0.5mL的磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入终浓度为10mM的底物，反应混合物在1000rpm，不同的温度(30℃、35℃、40℃、45℃)条件下反应30h，反应结束后取样萃取，通过气相色谱分析产物的对映体过量值(ee_p)和产率。如表3所示，当温度低于40℃时，酶活性随着温度的升高而升高，产率增大。超过40℃时，酶由于高温而变性失活，转化能力迅速下降，同时酶的对映选择性也有所降低。

表3.温度对2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯的酶促水解反应的影响

实施例	T(°C)	产率(%)	eep(%)	E
					实施例8	30	22.4±0.7	97.2±0.2	>100
实施例9	35	35.8±1.2	97.9±0.7	>100
					实施例10	40	38.8±2.5	97.7±0.2	>100
实施例11	45	28.5±1.6	94.7±0.3	50

实施例12-17水-有机溶剂两相体系中2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯的酶促水解

取0.5g实施例2所得的冻干酶粉悬浮于5mL的磷酸盐缓冲液中(pH7.5,100mM)，加入等体积不同的有机溶剂，所选的有机溶剂分别是：异丙醚、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷、异辛烷。加入底物0.1mmol(表观底物浓度10mM)，反应混合物在35℃，200rpm条件下反应30h，反应结束后取样萃取，气相色谱分析产物的对映体过量值(ee_p)和产率如表4所示。

表4.不同水-有机溶剂两项体系中酶促水解反应的比较

实施例	有机溶剂	logP	产率(%)	eep(%)
					实施例12	异丙醚	1.9	6.5	98.7
实施例13	甲苯	2.5	3.0	99.2
					实施例14	环己烷	3.2	40.7	98.7
实施例15	正己烷	3.5	36.4	98.9
					实施例16	正庚烷	4.0	41.9	98.9
实施例17	异辛烷	4.5	45.9	98.6

实施例18水-有机溶剂两相体系中水-异辛烷两相体积比的优化

取0.5g实施例2所得的冻干酶粉溶解于一定体积的磷酸盐缓冲液中(pH7.5,100mM)，加入异辛烷使总体积保持10mL不变，水与有机溶剂的体积比(V_水/V_有机)分别为1:1、3:1、5:1、7:1、9:1，底物量为0.1mmol(表观底物浓度10mM)，反应混合物在35℃，200rpm条件下反应30h，反应结束后取样萃取，气相色谱分析产物的对映体过量值(ee_p)和产率，根据产物与底物的摩尔比来计算产物的得率。如图3所示：在相体积比为1:1~7:1范围内，产率随着体积比的增大而增加，体积比为7:1时，产物的得率最大，为43%。

实施例19水-异辛烷两相体系中2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯的酶促水解拆分

取1.0g实施例2所得的冻干酶粉溶解于17.5mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入100mL三角磨口烧瓶中，加入含有0.13g底物的2.5mL异辛烷(表观底物浓度50mM)，35℃、200rpm机械搅拌反应。通过气相色谱监测反应进程，反应72h，产率为41%，产品光学纯度>98%ee，如图4所示。

实施例20(S)-(+)-DMCPA产物的克级制备

取10g实施例2所得的冻干酶粉溶解于175mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入500mL三口烧瓶中，加入含有1.3g底物的25mL异辛烷(表观底物浓度50mM)，35℃、200rpm机械搅拌反应。通过气相色谱监测反应进程，直至产物浓度不再继续增长时终止反应，大约需要96h。反应结束后将反应液12,000rpm离心30min，取离心上清液，加入碳酸氢钠将反应液的pH调至9.0，加入等体积的二氯甲烷萃取，取萃余水相，加入20%的H₂SO₄溶液将萃余液的pH调至2以下，加入与萃余液等体积的二氯甲烷萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，加入无水硫酸钠干燥过夜。用布氏漏斗过滤掉硫酸钠，60℃旋转蒸发除去萃取液中的二氯甲烷，得到目标产物(S)-(+)-DMCPA 0.4g，分离得率为35%，产品光学纯度为99%，比旋光度为

(c=0.86,CHCl₃)，核磁图谱如图5所示。

实施例21(S)-(+)-DMCPA产物的克级制备

取10g实施例2所得的冻干酶粉溶解于175mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入500mL三口烧瓶中，加入含有1.3g底物的25mL异辛烷(表观底物浓度50mM)，35℃、200rpm机械搅拌反应，流加氨水维持反应体系pH恒定为7.5，反应96h。反应结束后将反应液12,000rpm离心30min，取离心上清反应液，加入碳酸氢钠将反应液的pH调至9.0，加入等体积的二氯甲烷萃取，取萃余相，加入20%(w/v)H₂SO₄溶液将萃余液的pH调至2以下，加入与萃余液等体积的二氯甲烷萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，加入无水硫酸钠干燥过夜。用布氏漏斗过滤掉硫酸钠，60℃旋转蒸发除去萃取液中的二氯甲烷，得到目标产物(S)-(+)-DMCPA 0.51g，产品光学纯度为99%。

实施例22(S)-(+)-DMCPA产物的克级制备

取10g实施例2所得的冻干酶粉溶解于175mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入500mL三口烧瓶中，加入含有1.3g底物的25mL异辛烷(表观底物浓度50mM)，35℃、200rpm机械搅拌反应，流加2M的Na₂CO₃维持反应体系pH恒定为7.5，反应96h。反应结束后将反应液12,000rpm离心30min，取离心上清反应液，加入碳酸氢钠将反应液的pH调至9.0，加入等体积的二氯甲烷萃取，取萃余相，加入20%(w/v)的硫酸溶液将萃余液的pH调至2以下，加入与萃余液等体积的二氯甲烷萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，加入无水硫酸钠干燥过夜。用布氏漏斗过滤掉硫酸钠，60℃旋转蒸发除去萃取液中的二氯甲烷，得到目标产物(S)-(+)-DMCPA0.45g，产品光学纯度为99%。

实施例23(S)-(+)-DMCPA产物的克级制备

取10g实施例2所得的冻干酶粉溶解于175mL磷酸盐缓冲液(100mM,pH7.5)中，加入500mL三口烧瓶中，加入含有1.3g底物的25mL异辛烷(表观底物浓度50mM)，35℃、200rpm机械搅拌反应，流加2M的NaOH维持反应体系pH恒定为7.5，反应96h。反应结束后将反应液12,000rpm离心30min，取离心上清反应液，加入碳酸氢钠将反应液的pH调至9.0，加入等体积的乙酸乙酯萃取，取萃余相，加入20%(w/v)的硫酸溶液将萃余液的pH调至2以下，加入与萃余液等体积的乙酸乙酯萃取2次，合并萃取液，用饱和食盐水洗涤2次，加入无水硫酸钠干燥过夜。用布氏漏斗过滤掉硫酸钠，80℃旋转蒸发除去萃取液中的乙酸乙酯，得到目标产物(S)-(+)-DMCPA 0.35g，产品光学纯度为99%。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013，其保藏编号为CGMCC No.5911。

2.一种如权利要求1所述的红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013的培养方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1所述的红球菌在发酵培养基中进行发酵培养。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述的发酵培养条件为：培养温度25~35℃，培养时间12~48小时，发酵培养基的组分包括：葡萄糖5~20g/L，酵母膏5~10g/L，NaCl 1~5g/L，MgSO₄ 0.2~2g/L，KH₂PO₄1~5g/L，CaCl₂ 0.1~1g/L，pH 5.0~9.0。

4.如权利要求1所述的红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013在催化2,2-二甲基环丙烷甲酸酯进行对映选择性水解反应制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸中的应用。

5.一种红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013酯酶的制备方法，其特征在于，其方法包括以下步骤：

(1)发酵培养权利要求1所述的红球菌，将其培养混合物离心后获得红球菌整细胞；或

(2)将步骤(1)所得红球菌整细胞破碎后制备成红球菌酯酶粗酶液；或

(3)将步骤(2)所得粗酶液冷冻干燥后制备成红球菌酯酶粗酶粉。

6.一种利用权利要求1所述的红球菌(Rhodococcus sp.)菌株ECU 1013制备(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸的方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：在单水相***或水-有机溶剂***的反应体系中，在红球菌酯酶的催化作用下，2,2-二甲基环丙烷甲酸酯进行对映选择性水解反应形成(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸，从反应液中分离获得(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的红球菌酯酶包括：发酵培养权利要求1所述的红球菌所得的发酵液离心后获得的红球菌整细胞、将该红球菌整细胞破碎后获得的粗酶液和粗酶液冷冻干燥后获得的粗酶粉中的一种或几种。

8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的2,2-二甲基环丙烷甲酸酯包括2,2-二甲基环丙烷甲酸甲酯、2,2-二甲基环丙烷甲酸乙酯或2,2-二甲基环丙烷甲酸氯乙酯。

9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的单水相溶剂***包括柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCL缓冲液或甘氨酸-NaOH缓冲液，所述单水相溶剂***的pH为4.0~10.0；所述的水-有机溶剂***中的有机溶剂包括异丙醚、甲苯、环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷中的一种或几种，所述有机溶剂的LogP为1.9~4.5，所述有机溶剂与水相的体积比为1:1~1:9；所述底物的浓度为5~400mM，基于所述底物的催化剂用量为：2~10g整细胞/mmol底物或者1~7单位酶/mmol底物；反应温度为30~45℃，pH4.0~10.0，反应时间为1~100h。

10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的产物分离方法包括以下步骤：

(1)调节反应液的pH>7，加入有机溶剂萃取，取水相萃余液；

(2)调节步骤(1)所得水相萃余液的pH<2，再次加入有机溶剂萃取；

(3)将步骤(2)的有机溶剂萃取液干燥后蒸馏除去溶剂，即得所述产物(S)-(+)-2,2-二甲基环丙烷甲酸。

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