CN102753559B - 作为抗癌剂的吡咯并[1,4]苯并二氮杂*二聚物的共轭物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可以用作抗癌剂的新型吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物的共轭物(I)。
Description
技术领域
本发明涉及吡咯并[1,4]苯并二氮杂(PBD)二聚物共轭物,涉及包含它们的组合物以及它们的治疗应用,特别是作为抗癌剂的治疗应用。本发明也涉及制备共轭物的方法,涉及它们作为抗癌剂的应用以及该二聚物本身。
背景技术
吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物是通过共价结合于细胞的DNA而起作用的抗癌剂。这些衍生物已经描述于申请WO00/12508和WO2005/085260,和描述于下列公开:Eur:J.Med.Chem.,2005,40,641-654;TetrahedronLetters,1988,29(40),5105-5108。
共轭物的化学已经已知很多年并且已经应用于几个家族的细胞毒素剂,例如,美登木素生物碱(WO04103272),紫杉类(taxans)(WO06061258),细霉素(WO07144709),或CC-1065及其类似物(WO2007102069);关于共轭物也参见MonneretC.etal.,BulletinduCancer,2000,87(11),829-38;RicartA.D.etal.,NatureClinicalPracticeOncology,2007,4,245-255;SinghR.andRicksonH.K.,TherapeuticAntibodies:MethodsandProtocols,2009,525,445-467。
吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物共轭物已经描述于申请WO07085930或WO2009/016516。使用的二聚物更特别地具有下式:
其中T可以表示由-G-D-(Z)p-SZa或-G-D-(Z)p-C(=O)ZbRb取代的芳基或杂芳基基团。G表示单键或双键,或者为-O-、-S-或-NR-。D表示单键,或为下列基团之一:-E-,-E-NR-,-E-NR-F-,-E-O-,-E-O-F-,-E-NR-CO-,-E-NR-CO-F-,-E-CO-,-CO-E-,-E-CO-F,-E-S-,-E-S-F-,-E-NR-CS-,-E-NR-CS-F-,对于这些E和F选自-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-,-烷基(OCH2CH2)i-烷基-,CH2CH2)i-,-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-,-(OCH2CH2)i杂环基(heterocyclyl)(OCH2CH2)j-,-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-,-(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-,-烷基-(OCH2CH2)i烷基(OCH2CH2)j-,-烷基-(OCH2CH2)i-,-烷基-(OCH2CH2)i环烷基(OCH2CH2)j-,-烷基(OCH2CH2)i杂环基(OCH2CH2)j-,-烷基-(OCH2CH2)i芳基(OCH2CH2)j-,-烷基(OCH2CH2)i杂芳基(OCH2CH2)j-,-环烷基-烷基-,-烷基-环烷基-,-杂环基-烷基-,-烷基-杂环基-,-烷基-芳基-,-芳基-烷基-,-烷基-杂芳基-,-杂芳基-烷基-。i和j表示整数0至2000。Z表示烷基基团和p是数值为0或1的整数。
表现本发明一些化合物特征的基团L2=-CH2C(=O)NR3-(CH2CH2O)i-ALK-包括酰胺单元(-CONR3-)并且可以在WO07085930或在WO2009/016516中仅对应于单元-E-CONR-F-,其中E=烷基和F=-(CH2CH2O)j-烷基-。但是,与苯环或吡啶环连接并且与L2连接的基团L1在这两篇专利申请中未描述或暗示。特别地,其可以仅对应于单元G。实际上,G可以仅为键(单键、双键、三键),或为-O-、-S-或-NR-。对于具有连接基-O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-ALK-的本发明其它化合物,WO07085930或WO2009/016516的单元D都未提供胺基团NR3和键-S-的组合。下列二聚物描述于WO2009/016516:
但是这些二聚物中都不包括类似于本发明描述的那些的连接基(特别地,无-ALK-S-单元)。
因此,两篇申请WO07085930和WO2009/016516既未描述也未暗示本发明的化合物。
本发明意在解决的技术问题是提供新型吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物共轭物。
定义
以下术语具有相应含义:
●共轭物:细胞结合剂,至少一个细胞毒素化合物的分子与该细胞结合剂共价连接;
●细胞结合剂:对于生物靶具有亲和力的分子:其可以,例如,是配体、蛋白质、抗体(更特别是单克隆抗体)、蛋白质或抗体片段、肽、寡核苷酸或寡糖。结合剂的作用是将生物活性化合物(例如细胞毒素剂)导向生物靶;
●生物靶:优选地位于与该肿瘤有关的癌细胞或基质细胞表面的抗原(或抗原群);对于这些抗原其可以为,例如,生长因子受体,致癌基因产物或变异的“肿瘤抑制”基因产物,血管生成-相关的分子或粘着分子;
●烷基:通过从烷烃移除氢原子得到的饱和脂族烃基。烷基可以是直链的或支化的。可以提及例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔-丁基、戊基、2,2-二甲基丙基或己基;
●环烷基:在环状结构中包含3至8个碳原子的环状烷基。可以提及的是例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基;
●芳基:不包含杂原子的单环或双环芳族基团。更特别地为苯基和萘基基团;
●杂芳基:包含至少一个位于环内且与形成环的碳原子连接的杂原子(O、S、N)的单环或双环芳族基团。更特别为吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基或***基基团;
●杂环烷基:包含至少一个位于环内且与形成环的碳原子连接的杂原子(O、S、N)的环烷基基团;
●烷氧基:-O-烷基,其中烷基如上定义;
●链烷酰氧基:-O-CO-烷基,其中烷基如上定义;
●亚烷基:具有实验式-CmH2m-的饱和二价基团,其通过从烷烃上移除两个氢原子得到。烷烃可以是直链的或支化的。可以提及例如亚甲基(-CH2-),亚乙基(-CH2CH2-),亚丙基(-CH2CH2CH2-),亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-),亚异丁基或亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)基团。直链亚烷基基团可以更特别为具有式-(CH2)m-的基团,m表示整数;
●在数值的范围中,包括界限(例如,类型“i为1至6”的范围包括界限1和6)。
使用的缩写
AcOEt:乙酸乙酯;ALK:(C1-C12)亚烷基基团,更特别为(C1-C6)亚烷基基团;TLC:薄层色谱;DAR:药物抗体比;DBU:1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯;DCC:N,N’-二环己基碳二酰亚胺;DCM:二氯甲烷;DEAD:偶氮二羧酸二乙酯;DIC:N,N’-二异丙基碳二酰亚胺;DIPEA:N,N-二异丙基乙胺;DMA:二甲基乙酰胺;DMAP:4-二甲基氨基吡啶;DME:二甲氧基乙烷;DMF:二甲基甲酰胺;DMSO:二甲基亚砜;e:摩尔消光系数;EEDQ:2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1,2-二氢喹啉;EDCl:N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二酰亚胺;EDTA:乙二胺四乙酸;Fmoc:芴基甲氧基羰基;PG:保护基团;Hal:卤素原子;HOBt:1-羟基苯并***;HEPES:4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸;LG:离去基团;NHS:N-羟基琥珀酰亚胺;NMP:N-甲基吡咯烷酮;RP:减压;Rf:保留因子;SEC:空间排阻色谱;AT:环境温度;TBDMS:叔-丁基二甲基甲硅烷基;TEA:三乙胺;TFA:三氟乙酸;TIPS:三异丙基甲硅烷基;THF:四氢呋喃;rt:保留时间。
附图说明
图1:实施例1的共轭物在去糖基化之后的高分辨质谱;
图2:实施例2的共轭物在去糖基化之后的高分辨质谱;
图3:实施例3的共轭物在去糖基化之后的高分辨质谱;
图4:实施例4的共轭物在去糖基化之后的高分辨质谱;
图5:实施例6的未去糖基化的共轭物的高分辨质谱。
对于在去糖基化之后的各共轭物,这些图显示了携载0至8个茅屋霉素二聚物的实体的分布(D0:无二聚物;Dx:x个二聚物)。
具体实施方式
本发明涉及下式的化合物:
其中:
●表示单键或双键,条件是如果表示单键,那么:
----表示单键;
U和/或U’相同或不同,彼此独立地表示H;
W和/或W’相同或不同,彼此独立地表示:OH、-OR、-OCOR、-COOR、-OCOOR、-OCONRR’、使得N10和C11包含在环内的环状氨基甲酸酯基团、-NRCONRR’、-OCSNHR、使得N10和C11包含在环内的环状硫代氨基甲酸酯基团、-SH、-SR、-SOR、-SOOR、-SO3 -、-NRSOOR’、-NRR’、使得N10和C11包含在环内的环状胺基团、-NROR’、-NRCOR’、-N3、-CN、卤素或三烷基基团或三芳基基团;
●R1、R2、R1’和R2’相同或不同,彼此独立地表示:H、卤素或(C1-C6)烷基,该(C1-C6)烷基任选地取代有一个或多个选自下列的取代基:卤素、CN、NRR’、CF3、OR、芳基或杂芳基基团、或S(O)qR,其中q=0、1或2;
或者
●R1和R2和/或R1’和R2’分别共同形成双键=CH2或=CH-CH3;
●Y和Y’相同或不同,彼此独立地表示H或OR;
●M表示CH或N;
●ALK和ALK’相同或不同,彼此独立地表示(C1-C6)亚烷基;
●R和R’彼此独立地表示H或任选地由选自下列的一个或多个取代基取代的(C1-C6)烷基或芳基基团:卤素、CN、NRR’、CF3、OR或芳基或杂芳基;
●L表示:
-L1-L2-基团,其中L1经ALK或OALK基团与包含M的芳环连接,表示下列基团之一:
-ALK-S-
-O-ALK-NR3-ALK-S-
和L2表示经-CH2C(=O)-与L1连接的-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-基团;
或者
经OALK基团与包含M的芳环连接的-O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-ALK-基团;
●R3表示H或(C1-C6)烷基基团;
●i表示整数1至40,更适合为1至20,优选为1至10;
●Zb表示单键、-O-或-NH-,和Rb表示H或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基基团,或者Zb表示单键和Rb表示卤素。
式(I)的化合物(包括具体示例的那些)的形式可以是碱的形式或与药用酸的加成盐的形式或也可以是这些碱或这些盐的水合物或溶剂化物。
更特别地,与苯基核或吡啶基核连接的两个ALK和ALK’基团都表示亚甲基:
更特别地,在式(I)的化合物中,挑选出具有式(IA)或(IB)的那些:
Y和Y’更特别地表示(C1-C4)烷氧基基团,特别是甲氧基基团。R和R’可以更特别地彼此独立地表示H或(C1-C6)烷基基团。根据具体形式,U=U’和/或W=W’和/或R1=R1’和/或R2=R2’和/或Y=Y’和/或与苯基核或吡啶基核连接的两个ALK和ALK’基团是相同的。
L可以更特别地选自下列之一:
-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2-
-O-ALK-NR3-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2
-O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-CH2CH2-
在这些之中,ALK更特别地表示(C1-C4)亚烷基基团。特别地,ALK可以是下列之一:-CH2CH2-、-CH2CMe2-或-CH2CH2CMe2-。L也可以是以下表I或表II中描述的那些之一。
i表示整数1至40,更适合为1至20,优选为1至10。i可以为1至40中的任一值;特别地,i的值可以为3、4、5、6、7、8、9或10。
表I描述根据式(IA)的化合物的代表性实例。该表的各化合物可以按其中M=CH(苯)或M=N(吡啶)的形式存在。其中M=N的化合物更易溶于水。
表I
根据本发明的化合物包含化学基团-C(=O)ZbRb(RCG1),该基团与结合剂上存在的反应性化学基团(RCG2)具有反应性。RCG1和RCG2之间的反应确保通过形成共价键使化合物与结合剂结合。因此,该化合物能够与结合剂共轭。更特别地,Zb表示O;在这种情况下,RCG1表示酸官能团(Rb=H)或酯官能团。更特别地,-C(=O)ZbRb表示-COOH,-COO(C1-C6)烷基,特别是-COOCH3,或-COOCH2CH=CH2。在酯官能团中,优选的是对于RCG2基团、特别是关于抗体上存在的氨基基团表现出良好反应性的“活化”酯。活化酯的实例如下:
其中IG表示至少一个诱导基团,例如-NO2或-Hal,特别是-F。可以使用以下基团,例如:另一种类型的-C(=O)ZbRb基团如下:
作为RCG2的实例,可以提及由存在于抗体表面的赖氨酸残基侧链携载的赖氨酸的ε-氨基基团,铰链区的糖基或通过还原链内二硫键得到的半胱氨酸的硫醇(GarnettM.C.etal.,AdvancedDrugDeliveryReviews,2001,53,171-216)。更近地,已经考虑过其它方法,例如通过突变引入半胱氨酸(JunutulaJ.R.etal.,NatureBiotechnology,2008,26,925-932;WO09026274)或引入非天然氨基酸,这使得可以使用其它类型的化学方法(deGraafA.J.etal.,BioconjugateChem.,2009,February3,2009(Review);DOI:10.1021/bc800294a;WO2006/069246,和根据ChinJ.W.etal.,JACS,2002,124,9026-9027(ReCodetechnology))。用于连接抗体的这些方法可以根据它们的结构应用于所有已知的结合剂。
根据本发明的化合物因此可以用于制备结合剂,下式的二聚物在M的对位共价连接于所述结合剂:
更特别地,结合剂是抗体。更特别地,二聚物具有下式:
制备式(I)的化合物的方法
式(I)的化合物可以根据方案1制备:
方案1
化合物P1、P’1和P2一起反应得到P3。LG和LG’表示离去基团。L3可以表示-L-C(=O)ZbRb基团;在这种情况下,P3因此表示式(I)的化合物。在其中P3不表示-L-C(=O)ZbRb基团的情况下,必须使用一步或多步反应将L3转化为-L-C(=O)ZbRb基团。特别地,在其中的情况下,可以引入由-C(=O)ZbRb基团(=-C(=O)O-(C1-C4)烷基或-C(=O)O-烯丙基)封端的L3基团,然后将其转化为-C(=O)OH基团,该基团最终与N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯或NHS反应。-COO烷基/烯丙基向-COOH的转化可以通过使用氢氧化锂处理而进行。特别有利地使用甲酯。与N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的反应在碱例如DIPEA的存在下进行;与NHS的反应在偶联剂例如DCC的存在下进行。同样,在其中的情况下,可以引入-C(=O)ZbRb基团=-COOH,该基团随后与N,N’-羰基二咪唑反应(JACS,1958,80,4423;JACS,1960,82,4596)。
化合物P1和P’1描述于专利申请WO00/12508、WO00/12507、WO2005/040170、WO2005/085260、WO07085930或WO2009/016516或可以通过全合成得到(MoriM.etal.Tetrahedron,1986,42,3793-3806)。在其中P1和/或P’1表示下式的茅屋霉素的情况下:
后者利用Streptomycescroceus菌株通过参考FR1516743的教导或通过全合成制备(参见J.Antibiotics,1983,XXXVI(3),276-282,Z.Tozuka,“Studiesontomaymycin.TotalsynthesesoftheantitumorantibioticsE-andZ-tomaymycins”)。也存在商业的P1/P’1化合物。为引入W/W’基团,亚胺官能团(=双键)能够加成各种HW/HW’化合物(例如H2O或醇ROH)。
关于式P
2
的化合物
这些具有下式:
其中:
■L、M、ALK、ALK’、Zb和Rb如上定义;
■E和E’彼此独立地表示-OH基团或离去基团。
L可以更特别地表示方案2、2’、3、3’、3”、4、5、5’、6、6’、6”、7中描述的那些之一。
也选出了具有下式的中间体:
其中L*选自:-ALK-SH;-O-ALK-NR3-ALK-SH;
在本发明中,术语“离去基团”表示原子或原子团,它们在P2和P1或P’1之间的异裂反应中离去并带走连接ALK和LG或LG’的共价键的电子对。离去基团更特别地选自卤素原子,特别是氯或溴,或甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团、对硝基苯磺酸酯基团(nosylate)或-OPPh3 +基团。
对于以下的其它方案,为简便使用以下缩写:
L1=-ALK-S-和L2=-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-ALK-
方案2
制备P
2
P2由式的相应卤化二醇根据实施例3的教导(方案2’)获得:
方案2’
i.使用保护基团例如叔-丁基二甲基甲硅烷氧基(TBS)保护两个醇官能团;
ii.分别使用n-BuLi或镁制备相应的有机锂或有机镁衍生物;
iii.对酮亲核加成形成醇官能团;
iv.经由形成相应的硫代乙酸酯制备硫醇(参见实施例3.7和3.8);
v.脱保护;
vi.引入LG和LG’。在甲磺酸酯基团的情况下,在碱例如叔胺(例如,TEA或DIPEA)的存在下使用甲烷磺酰氯;参见实施例1.4。
卤化二醇及其相应保护的二醇的实例是WO2009/016516的第48页上的方案1中描述的那些(方案1的化合物2和3)。保护的二醇的两个实例是CAS号181225-40-1和181225-41-2的那些。
卤化二醇可以通过相应二酸或二酯化合物的还原、例如CASNo.193010-40-1的还原获得。在吡啶(M=N)的情况下也参见:LiebigsAnnalenderChemie,1991,10,987-988或Tetrahedron,2005,61(7),1755-1763(方案1的化合物3)。
制备P
4
其中ALK=CH
2
CH
2
的情形
其中R
3
=H的情形
步骤(i):形成酰胺和使酸活化;这两步骤在极性非质子溶剂例如DCM中连续进行:胺官能团和N-羟基琥珀酰亚胺基卤代乙酸酯之间的反应,然后原位添加偶联剂例如DIC。
其中R
3
≠H的情形
步骤(ii):以呈甲酯形式保护羧酸和以呈三氟乙酰胺的形式保护胺;反应在极性非质子溶剂例如DCM中在两个连续步骤中进行:通过用三甲基甲硅烷基重氮甲烷在甲醇的存在下处理来保护酸,然后通过添加三氟乙酸酐和碱例如TEA来保护胺;
步骤(iii):将胺烷基化和将酯皂化;反应在无水极性非质子溶剂例如THF中在两个连续的步骤中进行:通过用碱例如NaH在携载离核基团的反应物例如烷基卤R3Hal的存在下处理将胺烷基化,然后添加氢氧化锂和水;
步骤(i):在步骤(iii)之后,重复对于R3=H的情况的步骤(i)的反应。
其中ALK≠CH
2
CH
2
的情形
其中R
3
=H的情形
其中R
3
≠H的情形
步骤(iv):延长PEG链;在无水极性非质子溶剂例如THF或DMF中经由用通过NaH或萘基钾的作用产生的二苯甲酮/亚胺/PEG醇的醇盐处理卤化的酯进行该反应,如描述于WO2007/127440;
步骤(v):通过在钯/碳的存在下根据WessjohannL.etal.,Synthesis,1989,5,359-63氢化使亚胺选择性断裂;
步骤(vi):通过添加三氟乙酸酐和碱例如TEA来保护胺。
氨基/PEG醇对于例如i=3,4,7,8是可商购的或可以由PEG二醇制备,对于i=3至12可商购,根据描述于US7230101的过程。通过二苯甲酮保护胺官能团可以通过在路易斯酸例如BF3醚化物的存在下共沸脱水进行。
和L2=-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-
方案3
制备P
2
方案3’
i.-OH官能团之一(其余两个由表示保护基团的PG和PG’保护)和通过式Br-ALK-NHBoc的Boc保护的溴胺在碱例如K2CO3的存在下在极性溶剂例如DMF、THF或MeCN中的亲核反应(参见,例如,WO07085930的第63页上的条件)。
根据可替换的形式,可以通过下式的羟基二酯:进行溴胺的亲核取代反应,然后例如用硼氢化钠还原酯官能团得到-CH2OH官能团;对于此,可以应用WO2007/085930的第62-63页给出的亲核取代条件和还原条件;
ii.将保护基团脱保护;
iii.用式HC(=O)-ALK-SSMe的醛在异丙醇钛的存在下进行还原胺化;反应在环境温度在无水极性非质子溶剂例如THF中进行;
iv.形成中间体络合物,用还原剂例如氰基硼氢化钠将其原位还原;
v.引入LG和LG’。在甲磺酸酯基团的情况下,在碱例如叔胺(例如TEA)的存在下使用甲烷磺酰氯;参见实施例1.4。
方案3”中陈述的可替换形式包括在特别是由KitagawaT.etal.,JACS,2006,128(45),14448-14449描述的方法的启示下引入-ALK-SSMe基团到NHBoc基团上,该方法用于引入乙酰基硫烷基链到仲胺上:
方案3”
根据该可替换形式,烷基化反应使用中间体Hal-ALK-SCOMe(例如,Hal=I)进行,然后通过在碱性介质中处理释放硫醇:
vi.通过携载硫代乙酰基基团的烷基卤化物在碳酸铯的存在下在极性非质子溶剂例如DMF中进行烷基化;
vii.在弱碱性介质中选择性断裂乙酰基基团;
viii.通过中间体硫醇与MeSSO2Me的反应形成-SSMe基团;
ix.保护基团PG和PG’断裂;
x.将羟基基团转化为离核基团LG/LG’,优选为甲磺酸酯基团。
方案3”’
在合成的不同阶段都可以将R3基团=(C1-C4)烷基引入到NH基团上(方案3”’中给出实例)。这例如通过利用其中使用醛的Wallach反应(参见实施例1.5,其中烷基化NHNMe使用甲醛)进行。
关于P
5
ThermoFisherScientific,Rockford,IL61105,USA,JenkemTechnologyUSAInc.,2033W.McDermottDr,Allen,TX75013-4675,USA,和QuantaBioDesignLtd.,195WestOlentangyStreet,SuiteO,Powell,Ohio43065-8720,USA出售通式的化合物,表示为NHS-PEG-马来酰亚胺。可以更特别地提及CASNo.756525-99-2的化合物。
将硫醇加成至马来酰亚胺单元的过程描述于“BioconjugateTechniques”,GregT.Hermanson,2ndEd.,ElsevierInc.(ISBN-13:978-0-12-370501-3;ISBN-10:0-12-370501-0)的第721页。
L1=-O-ALK-NR3-ALK-S-和L2=-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-
方案4
该制备方法类似于方案3中描述的制备方法,其中P5替换为P4。
方案4’中描述的可替换形式对应于与方案2和2’中描述的类似的制备方法:
方案4’
i.通过还原二硫键进行脱保护
和L2=-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-
方案5
制备P
2
使用下式的化合物P2:该化合物根据以下方案5’得到:
方案5’
i.通过哌嗪将芳环的羟基烷基化,该哌嗪在1位单保护并且在4位携载由离核LG基团在端基位置官能化的烷基链。优选地,离核基团是甲磺酸基团和Williamson反应在氢化物的存在下无水极性非质子溶剂例如THF或DMF中进行;
ii.将Boc、PG和PG’基团脱保护,优选地在酸性介质中进行,例如当PG和PG’基团为TBDMS时在盐酸或TFA的存在下进行。
根据步骤i和ii的可替换形式,可以通过下式的羟基二酯进行溴胺的亲核取代:然后例如使用硼氢化钠还原酯官能团得到-CH2OH官能团;对于此,可以应用WO2007/085930的第62-63页给出的亲核取代的条件和还原的条件;
iii.在将酸初始活化之后进行偶联,得到NHS酯;
iv.引入离去基团LG和LG’。在甲磺酸酯基团的情况下,在碱例如叔胺(例如TEA)的存在下使用甲烷磺酰氯。
和L2=-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-
方案6
制备P
2
使用下式的化合物P2:其通过根据以下方案6’的还原胺化获得。
方案6’
v.通过例如在氰基硼氢化物和异丙醇钛的存在下进行的还原胺化引入-ALK-SSMe基团。
类似于方案3”中陈述的和使用由KitagawaT.etal.,JACS,2006,128(45),14448-14449描述的烷基化方法的可替换形式在方案6”中给出:
方案6”
i.通过单保护的哌嗪进行烷基化(参考方案5’的步骤i.);
vi.在酸性介质中使Boc基团选择性脱保护;
vii.在碳酸铯的存在下在极性非质子溶剂例如DMF中通过携载硫代乙酰基基团的烷基卤化物进行烷基化;
viii.在弱碱性介质中选择性断裂乙酰基基团,和通过中间体硫醇与MeSSO2Me在碱例如TEA的存在下的反应形成-SSMe基团;
ix.使保护基团PG和PG’断裂,和优选地用甲烷磺酰氯将羟基基团转化为甲磺酸酯。
L=-O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-ALK-
方案7
该方案从前述方案3得到启示。化合物P6可以,例如,是CASNo.564476-32-0的化合物、或CASNo.309916-91-4的化合物,前一化合物根据WO03068144制备(参见图7的化合物10a)。具有不同链长度i的相似化合物可以根据WO03068144的图7的相同原理由相应PEG化合物起始进行制备。
关于P
6
可以根据以下方案制备:
其中ALK=CH
2
CH
2
的情形
其中ALK≠CH
2
CH
2
的情形
步骤(i):将醇活化为甲磺酸酯的形式;反应在无水极性非质子溶剂例如DCM中通过用甲磺酰氯在碱例如TEA的存在下处理进行。
步骤(ii):甲磺酸酯/卤素交换;反应在极性非质子溶剂例如丙酮的回流下用卤化钠例如碘化钠进行。
步骤(iii):使用盐酸的溶液(例如在二烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
步骤(iv):酸的活化;反应在环境温度在极性非质子溶剂例如DCM中通过用NHS在偶联剂例如DCC的存在下处理进行。
步骤(v):PEG链的延长;反应在无水极性非质子溶剂例如THF或DMF中通过用以四氢吡喃(THP)醚形式单保护的PEG二醇的醇盐处理卤化酯进行。该类型的单保护的PEG二醇的制备方法详细描述于文献;参见,例如,RichardA.etal.,Chem.Eur.J.,2005,11,7315-7321或SakellariouE.G.etal.,Tetrahedron,2003,59,9083-9090。
步骤(vi):使用0.1N盐酸溶液(例如在二烷或乙醇中的溶液)进行脱保护。
本领域技术人员可以从以下描述的实施例的操作条件得到他的启示。
制备共轭物的方法
共轭物通过包括以下步骤的方法获得:
(i)使结合剂的任选地添加缓冲液的水溶液和式(I)的化合物的溶液接触并使其反应;
(ii)然后任选地将步骤(i)中形成的共轭物与式(I)的化合物和/或与未反应的结合剂和/或可能形成的聚集体分离。
根据可替换形式,在步骤(i)中形成的共轭物在步骤(ii)中与未反应的结合剂和与可能存在于溶液中的聚集体分离。根据另一种可替换形式,步骤(i)的共轭物在步骤(ii)中仅与未反应的式(I)的化合物和与可能形成的聚集体分离,而可能未反应的结合剂留在溶液中。
式(I)的化合物优选地包含活化的官能团-C(=O)ZbRb,该官能团与RCG2基团具有反应性,特别是与存在于抗体上的氨基基团具有反应性。使用一步或多步本领域技术人员已知的化学反应可以容易将相对无反应性的或反应性不足的化学基团转化为反应性较高的基团;例如-COOH+N-羟基琥珀酰亚胺→或者-COO(C1-C6)烷基→-COOH→-COOH+N-羟基琥珀酰亚胺→
可用于抗体和式(I)的化合物的情况的方法的实例是在实施例1中所给出的。
结合剂的水溶液可以使用例如缓冲液缓冲,所述缓冲液例如磷酸钾或N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES缓冲液)。缓冲液取决于结合剂的性质。将式(I)的化合物溶解在极性有机溶剂例如DMSO或DMA中。
反应通常在20至40℃的温度进行。反应的持续时间可以为1至24h。结合剂和式(I)的化合物之间的反应可以通过SEC使用折射率和/或紫外检测器监测,从而确定其中的进程状态。如果接枝的程度不充分,可以允许反应进行较长的时间和/或可以进一步添加式(I)的化合物。对于用于共轭物的具体条件更多细节,可以参考实施例部分中所给的通用方法。
本领域技术人员可使用用于步骤(ii)的分离的各种色谱技术:共轭物可以通过以下技术纯化,例如空间排阻色谱(SEC)、吸附色谱(例如离子交换色谱,IEC)、疏水作用色谱(HIC)、亲和色谱、在混合载体例如陶瓷羟磷灰石上的色谱,或HPLC。也可以使用通过渗析或渗滤的纯化。
术语“聚集体”应理解为表示可以在两个或更多个结合剂之间形成的组合,该结合剂已经或未通过共轭进行改性。聚集体能够在大量参数的影响下形成,所述参数例如在溶液中高浓度的结合剂、溶液的pH、高剪切力、接枝的二聚物的数目和它们的疏水性质、或温度(参见J.MembraneSci.,2008,318,311-316的绪论中引用的参考文献),它们中的一些的影响有时未精确阐明。在蛋白质或抗体的情况下,可以参考AAPSJournal,“ProteinAggregationandBioprocessing”,2006,8(3),E572-E579。聚集体的含量可以使用已知技术(例如SEC)(在这点上参见,AnalyticalBiochemistry,1993,212(2),469-480)确定。
在步骤(i)或(ii)之后,可以使共轭物的溶液经受超滤和/或渗滤的步骤(iii)。在这些步骤结束时可得到在水溶液中的共轭物。
抗体
抗体(在这点上参见Janewayetal.,“Immunobiology”,5thedition,2001,GarlandPublishing,NewYork)可以选自特别描述于申请WO04043344,WO08010101,WO08047242和WO05009369(anti-CA6)的那些。抗体可以特别是单克隆抗体、多克隆抗体。也可以使用抗体片段。也可以使用鼠抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
共轭物
共轭物通常包括连接于结合剂的1至10个吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物(这是接枝程度或药物-比-抗体比率(DAR))。该数目根据以下变化:结合剂和二聚物的性质以及用于共轭的操作条件(例如,二聚物相对于结合剂的当量数目,反应时间,溶剂的性质和可能的助溶剂的性质)。使结合剂和二聚物接触得到包含以下物质的混合物:几种共轭物(由于不同的DAR而分别彼此相异);任选的未反应的结合剂(在不完全反应的情况下);和可能的聚集体。例如通过UV光谱法在最终溶液上确定的DAR由此对应于平均DAR。
在其中结合剂是抗体的情况下,UV光谱法可以是用于确定DAR的方法。该方法从AntonyS.Dimitrov(Ed.),LLC,2009,“TherapeuticAntibodiesandProtocols”,vol.525,445,SpringerScience中的陈述获得启示。其包括在分离步骤(ii)之后在两个波长(表示为LO1和LO2)测量共轭物的溶液的吸光率。可以使用下列在共轭之前测得的裸抗体和吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物的摩尔消光系数。
在SEC谱的相应峰上(这使得可以计算“DAR(SEC)”)或通过使用常规UV分光光度计(这使得可以计算“DAR(UV)”)测量共轭物的溶液在LO1和LO2的吸光率(ALO1和ALO2)。吸光率可按以下形式表示:
ALO1=(cDxeDLO1)+(cAxeALO1)
ALO2=(cDxeDLO2)+(cAxeALO2)
关于此的方程:
●cD和cA分别表示关于吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物的共轭物的部分和关于抗体的共轭物的部分在溶液中的浓度;
●eDLO1和eDLO2分别表示共轭之前吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物在两个波长LO1和LO2的摩尔吸光系数;
●eALO1和eALO2分别表示裸抗体在两个波长LO1和LO2的摩尔吸光系数。
术语“裸抗体”应理解为表示未连接吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物的抗体,也就是说在共轭步骤之前的抗体。
这两个方程的解得到:
cD=[(eALO1xALO2)-(eALO2xALO1)]/[(eDLO2xeALO1)-(eALO2xeDLO1)]
cA=[ALO1-(cDxeDLO1)]/eALO1
平均DAR那么对应于cD/cA。在吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物的情况下,考虑两个波长LO1=280nm和LO2=320nm。在SEC谱上测得的平均DAR优选为1至10,优选为1.5至7。
共轭物可以用作抗癌剂。由于存在结合剂,与健康细胞相比,共轭物对肿瘤细胞呈现出高度的选择性。这使得可以指引具有抗癌活性的式(I)的化合物趋向肿瘤细胞的近环境或直接进入肿瘤细胞的内部(关于这点,参见以下公开,这描述了单克隆抗体的共轭物在治疗癌症中的用途:“Antibody-drugconjugatesforcancertherapy”,CarterP.J.etal.,CancerJ.,2008,14,154-169;“Targetedcancertherapy:conferringspecificitytocytotoxicdrugs”,ChariR.,Acc.Chem.Res.,2008,41,98-107)。可以处理实体肿瘤或非实体肿瘤。
将共轭物以缓冲水溶液的形式配制,浓度通常为1至10mg/ml。可以将该溶液原样以输入剂的形式注入或者可以重新稀释形成输液剂。
实施例
化学位移(以ppm计的δ)以ppm表示。
方法A:高压液相色谱-质谱(LCMS)
波谱在WatersUPLC-SQD装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件:柱:ACQUITYBEHC181.7μm-2.1x50mm;溶剂:A:H2O(0.1%甲酸),B:CH3CN(0.1%甲酸);柱温度:50℃;流动速率:1ml/min;梯度(2min):在0.8min内由5%的B至50%的B;1.2min:100%的B;1.85min:100%的B;1.95min:5%的B。
方法B:高压液相色谱-质谱(LCMS)
波谱在WatersZQ装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件:柱:XBridgeC182.5μm3x50mm;溶剂:A:H2O(0.1%甲酸),B:CH3CN(0.1%甲酸);柱温度:70℃;流动速率:0.9ml/min;梯度(7min):在5.3min内由5%的B至100%的B;5.5min:100%的B;6.3min:5%的B。
方法C:质谱(MS)
波谱使用化学电离(反应物气体:氨)在WATERSGCT装置上(无需LC直接导入)记录。
方法D:高压液相色谱-质谱(LCMS)
波谱在WatersUPLC-SQD装置上以正离子和/或负离子电喷雾模式(ES+/-)获得。色谱条件:柱:ACQUITYBEHC181.7μm-2.1x50mm;溶剂:A:H2O(0.1%甲酸),B:CH3CN(0.1%甲酸);柱温度:70℃;流动速率:1ml/min;梯度(2min):在1min内由5%的B至50%的B;1.3min:100%的B;1.45min:100%的B;1.75min:5%的B。
方法E:高压液相色谱-质谱(LCMS)
波谱在WatersUPLC-SQD装置上以电喷雾模式按正离子和/或负离子模式(ES+/-)获得。色谱条件:柱:ACQUITYBEHC181.7μm-2.1x50mm;溶剂:A:H2O(0.1%甲酸),B:CH3CN(0.1%甲酸);柱温度:70℃;流动速率:1ml/min;梯度(4min):在3.15min内由5%的B至100%的B;3.75min:5%的B。
方法F:高压液相色谱-质谱(LCMS)
波谱在WatersUPLC-SQD装置上以电喷雾模式按正离子和/或负离子模式(ES+/-)获得。色谱条件:柱:ACQUITYBEHC18,1.7μm-2.1x30mm;溶剂:A:H2O(0.1%甲酸),B:CH3CN(0.1%甲酸);柱温度:45℃;流动速率:0.6ml/min;梯度(2min):在1min内由5%的B至50%的B;1.3min:100%的B;1.45min:100%的B;1.75min:5%的B。
方法G:共轭物的去糖基化和质谱(HRMS)
去糖基化是使用糖苷酶进行酶消化的技术。以500μl共轭物+100μl的TrisHCl50mM缓冲液+10μl聚糖酶(glycanase)-F酶(100单位冻干的酶/100μl水)开始进行去糖基化。用涡流混合该混合物并使其在37℃保持过夜。然后去糖基化的样品准备通过HRMS分析。也可以的是,无需先前的去糖基化,也可以进行样品的HRMS分析。在两种情况下,质谱都在WatersQ-Tof-2装置上以正离子电喷雾模式(ES+)得到。色谱条件:柱:4μmBioSuite250URHSEC4.6x300mm(Waters);溶剂:A:25mM甲酸铵+1%甲酸:B:CH3CN;柱温度30℃:流动速率0.4ml/min;无梯度70%A+30%B(15min)。
对于本专利申请描述的所有中间体化合物,要求保护它们在制备式(I)的化合物中的用途。更特别地,对于各实施例,对于描述的所有中间体化合物,要求保护它们在制备各式(I)的化合物中的用途。
实施例1
1.1.制备共轭物
共轭物通过使hu2H11(也称为hu532H11,在WO2008010101的第15页;其为包含氨基酸序列为SEDIDNo.24的VH的抗体)和N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)-2,5-二氧杂吡咯烷-1-基]丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯反应制备。
将516μg的N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)-2,5-二氧杂吡咯烷-1-基]丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯在540μlDMA中的溶液添加到8.19mg的hu2H11在2.16ml含水缓冲液中,该缓冲液包含0.05M浓度的N-(2-羟基乙基)哌嗪-N′-2-乙烷磺酸(HEPES)、0.05M浓度的NaCl和2mM浓度的乙二胺四乙酸(EDTA),该缓冲液的pH=8。在AT搅拌3h之后,将混合物过滤通过MillexR-SV0.45μM(PVDFDuraporeMillipore)并在SuperdexTM200制备级柱(HiloadTM26/60GE柱)上纯化,该柱在通过添加HCl使pH=6.5的磷酸盐缓冲液中预平衡。将有用的级分合并并在AmiconUltra-15(Ultracel50kMillipore)上浓缩然后过滤通过SephadexG-25(NAP-5和NAP-10GE柱),该柱在包含10%蔗糖和5%NMP的具有10mM浓度的组氨酸的含水缓冲液中预平衡。
使用4-{2-[甲基(2-甲基-2-巯基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶的消光系数(e319nm=8848M-1cm-1和e280nm=8634M-1cm-1)和hu2H11的消光系数(e280nm=208380M-1cm-1),通过分光光度测量法定量确定获得的共轭物(2.5ml):确定平均3.8个茅屋霉素二聚物每个抗体分子,浓度为1.52mg/ml。
1.2.N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-
基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)-2,5-二氧杂吡咯烷-1-基]丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯
将9.82mg的4-{2-[甲基(2-甲基-2-巯基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶在50μlDMA中的溶液和6.8mg的N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-二氧杂-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯在50μlDMA中的溶液添加到3.3mg负载在树脂上的二异丙基乙胺(3.72mmol/g)。将得到的混合物在AT搅拌24h然后使用甲醇在DCM中的0至10%的梯度使其过滤通过二氧化硅(InterchromPuriflashSilica15/35U2G)。将包含所需产物的级分合并,在RP下浓缩然后通过快速色谱法在二氧化硅(InterchromPuriflashSilica15/35U2G)上使用MeOH在DCM中的0至10%的梯度纯化。将包含所需产物的级分合并并在RP下浓缩。由此得到1.16mg的N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{3-[3-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)-2,5-二氧杂吡咯烷-1-基]丙酰基氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯。LC/MS(E):rt=1.38min;[M+H]+:m/z1322。
1.3.4-{2-[甲基(2-甲基-2-巯基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉
吡啶
将40mg的三(2-羧基乙基)膦盐酸盐和36.6ng的NaHCO3在680μl水中的溶液添加到40mg的4-{2-[甲基(2-甲基-2-甲基二硫基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶在2.1ml甲醇和930μlDMF中的溶液中。将混合物在AT搅拌45min,然后在RP下浓缩并通过快速色谱法在二氧化硅(MerckSuperVarioFlash15g柱,Si6015-40μm)上使用MeOH在DCM/乙腈9∶1混合物中的0至10%的梯度纯化。将包含所需产物的级分合并和在RP下浓缩。由此得到21mg的4-{2-[甲基(2-甲基-2-巯基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶。LC/MS(E):rt=1.28min;[M+H]+:m/z809;[M+H2O+H]+:m/z827。
1.4.4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-
氧基甲基]吡啶
将19.6μl甲烷磺酰氯添加到冷却至-25℃的22mg4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶和53μlTEA在0.5mlDCM中的溶液中。搅拌30min之后,使混合物水解,用水洗有机相,然后用MgSO4干燥并在RP下浓缩。将由此获得的剩余物(22mg)添加到20mg茅屋霉素、以及30mgK2CO3和12mgKI在0.7mlDMF中的溶液中。将混合物在30℃搅拌2h,然后用4ml水进行水解。用水洗涤得到的沉淀物,在真空下干燥,然后溶解于DCM,在RP下浓缩并通过快速色谱法在二氧化硅(MerckSuperVarioFlash15g柱,Si6015-40μm)上使用MeOH在DCM中的0至5%的梯度纯化。将包含所需产物的级分合并,在RP下浓缩。由此得到8mg的4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶。1HNMR(500MHz,d-氯仿):1.28(s,6H);1.76(d,J=6.4Hz,6H);2.39(s,3H);2.43(s,3H);2.60(s,2H);2.91(s,2H);2.97(s,4H);3.91(d,J=4.2Hz,2H);4.00(s,6H);4.09(s,2H);4.27(s,4H);5.27(s,4H);5.61(q,J=6.4Hz,2H);6.85(s,2H);7.00(s,2H);7.56(s,2H);7.65(d,J=4.2Hz,2H)。LC/MS(A):rt=0.74min;[M+H]+:m/z855;[M-H]-:m/z853。
1.5.4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶
将365μl甲酸添加到冷却至0℃的322mg的4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基氨基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶在262μl甲醛中的混悬液中。将混合物在100℃加热小时。在回到环境温度之后,使混合物水解,然后添加5N氢氧化钠水溶液直至达到pH=12。用AcOEt萃取水相3次,将合并的有机相用MgSO4干燥并在RP下浓缩。由此得到310mgof4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(300MHz,d6-DMSO):1.26(s,6H);2.39(s,3H);2.40(s,3H);2.60(s,2H);2.88(t,J=5.7Hz,2H);4.13(t,J=5.7Hz,2H);4.45(d,J=6.0Hz,4H);5.31(t,J=6.0Hz,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.22min;[M+H]+:m/z333;[M+HCO2H-H]-:m/z377。
1.6.4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基氨基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶
将270μl的2-(甲基二硫基)异丁醛和730μl的异丙醇钛添加到390mg的4-[2-氨基乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶(在从WO07085930的第101页描述的4-(2-(叔-丁氧基羰基氨基)乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶将Boc基团脱保护之后制备)在2mlTHF中的混悬液中。在20min之后,添加另外270μl的2-(甲基二硫基)异丁醛和另外730μl异丙醇钛,将混合物在AT搅拌2h。然后将6ml乙醇添加到混合物中,将混合物在AT搅拌20min,然后将124mg氰基硼氢化钠添加到混合物中。在搅拌45min之后,添加另外124mg氰基硼氢化钠,搅拌1h之后,将混合物在RP下浓缩,将剩余物在AcOEt和水中稀释。过滤所得沉淀物,将其溶解于1MHCl水溶液中。用5M氢氧化钠水溶液使所得水相达到碱性pH,用DCM萃取三次,将合并的有机相在RP下浓缩。由此得到322mg的4-[2-(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基氨基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.26(s,6H);1.81(宽m,1H);2.39(s,3H);2.67(宽s,2H);2.94(宽t,J=5.7Hz,2H);4.11(t,J=5.7Hz,2H);4.45(d,J=5.5Hz,4H);5.32(t,J=5.5Hz,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.24min;[M+H]+:m/z347。
实施例2
2.1.制备共轭物
共轭物按照实施例1通过使hu2H11和N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯反应制备。使用4-{2-[甲基(2-甲基-2-巯基丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶的消光系数(e319nm=8848M-1cm-1,e280nm=8634M-1cm-1)和hu2H11的消光系数(e280nm=208380M-1cm-1),通过分光光度测量法定量确定得到的共轭物:确定平均5.6个茅屋霉素二聚物每个抗体分子。
2.1.N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉
吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯
将5.5mg的N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和15μl的DIPEA添加到12mg3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸在1mlTHF和1mlDCM中的溶液中。在AT保持3h之后,添加4mlDCM,用水洗涤所得有机相两次,用MgSO4干燥和在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(InterchromPuriflashSilica15/35U2G)上使用甲醇在DCM中的3至8%的梯度纯化。由此得到8mg的N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯。LC/MS(E):rt=1.36min;[M+2H2O+Na]+:m/z1270;[M+H2O+Na]+:m/z1252;[M+H2O+H]+:m/z1229;[M+H]-:m/z1211。
2.2.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四
基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
将17.5μl氢氧化锂水溶液和100μl水添加到18mg甲基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯在270μlTHF中的水溶液中。在2h之后,将混合物在DCM中稀释,添加磷酸盐缓冲液直至pH=3。所得水相用DCM萃取3次,合并的有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(InterchromPuriflashSilica15/35U2G)上使用甲醇在DCM中的3至15%的梯度纯化。由此得到11.5mg的3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸。LC/MS(D):rt=0.88min;[M+H2O+Na]+:m/z1154;[M+H2O+H]+:m/z1133;[M+H]+:m/z1115。
2.3.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-
基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯
根据实施例1由3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]甲基氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备:
LC/MS(D):rt=0.93min;[M+H2O+H]+:m/z1146;[M+H]+:m/z1128。
2.4.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯
将73.7mg3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯在1mlDMF和39μlDIPEA中的溶液添加到45mg的4-{2-[(2-巯基-2-甲基丙基)(甲基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶在1mlDMF中的溶液中。在AT保持24h之后,将混合物在RP下浓缩并通过快速色谱法在二氧化硅(AnalogixSuperFlashSiO2SF25-8g)上使用甲醇在DCM中的0至10%的梯度纯化。由此得到53mg3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.21(s,6H);2.40(s,3H);2.50至2.56(m,4H);2.87(t,J=5.8Hz,2H);3.15至3.23(m,4H);3.40(t,J=5.8Hz,2H);3.47至3.52(m,12H);3.59(s,3H);3.62(t,J=6.2Hz,2H);4.13(t,J=5.8Hz,2H);4.45(d,J=5.8Hz,4H);5.31(t,J=5.8Hz,2H);6.85(s,2H);7.98(t,J=5.8Hz,1H)。LC/MS(A):rt=0.35min;[M+H]+:m/z620;[M+2H]2+:m/z310.5(基峰);[M-H+HCO2H]-:m/z664。
2.5.3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯
将117.4mg的N-羟基琥珀酰亚胺基碘乙酸酯在3mlDCM中的溶液添加到100mg的3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸中。在AT保持2h之后,添加330μl的MeOH,将混合物冷却至0℃。添加360μl的2M三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的溶液。在1h之后,通过添加50μl乙酸来中和混合物,然后添加饱和NaHCO3水溶液直至达到pH=8。有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(InterchromPuriflashSilica15/35U10G)上使用甲醇在DCM中的0至10%的梯度纯化。由此得到132mg3-[2-(2-{2-[2-(2-碘乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):2.54(t,J=6.4Hz,2H);3.20(q,J=5.8Hz,2H);3.41(t,J=5.8Hz,2H);3.48至3.53(m,12H);3.60(s,3H);3.63(t,J=6.4Hz,2H);3.65(s,2H);8.27(宽t,J=5.8Hz,1H)。LC/MS(A):rt=0.54min;[M+H]+:m/z448;[M+HCO2H-H]-:m/z492。
2.6.4-{2-[(2-巯基-2-甲基丙基)(甲基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶
将198mg三(2-羧基乙基)膦氢氯化物在730μl水中的溶液添加到80mg的4-{2-[甲基(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶在1.95ml甲醇中的溶液中。在AT保持2h之后,将混合物在RP下浓缩,将剩余物溶解在10ml水中。通过添加氢氧化钠水溶液使水相达到pH=8,然后用AcOEt萃取2次。将合并的有机相用饱和NaCl水溶液洗涤和在RP下浓缩。得到68mg的4-{2-[(2-巯基-2-甲基丙基)(甲基)氨基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.28(s,6H);2.43(s,3H);2.54(s,2H);2.62(s,1H);2.91(t,J=5.7Hz,2H);4.15(t,J=5.7Hz,2H);4.45(d,J=5.8Hz,4H);5.30(t,J=5.8Hz,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.11min;[M+H]+:m/z301。
实施例3
3.1.制备共轭物
共轭物按照实施例1通过使hu2H11和N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯反应制备。
使用1-(1-甲基-1-(甲基二硫基)乙基)-3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]苯的消光系数(e319nm=8460M-1cm-1和e280nm=10531M-1cm-1)和hu2H11的消光系数(e280nm=208380M-1cm-1),通过分光光度测量法定量确定得到的共轭物:确定平均4.2个茅屋霉素衍生物每个抗体分子。
3.2.N-羟基琥珀酰亚胺基3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-
苯基-4-基)-1-甲基乙基硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯
按照实施例2由3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基乙基硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸制备:
LC/MS(F):rt=1.27min;[M+H]+:m/z1123。
3.3.3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢-
硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸
按照实施例2由3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]苯基-4-基)-1-甲基-乙基硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯制备:
LC/MS(F):rt=1.19min;[M+H]+:m/z1026。
3.4.3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢
硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯
按照实施例2由3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双(羟基甲基)苯基)-1-甲基乙基硫基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯制备:
LC/MS(F):rt=1.28min;[M+H]+:m/z1040。
3.5.3-(2-{2-[2-(2-{2-[1-(3,5-双(羟基甲基)苯基)-1-甲基乙基硫基]-乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯
按照实施例2由3,5-双(羟基甲基)-1-(1-巯基-1-甲基乙基)苯制备:
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.64(s,6H);2.53(t,J=6.2Hz,2H);2.93(s,2H);3.15(q,J=6.0Hz,2H);3.37(t,J=6.0Hz,2H);3.49(m,12H);3.59(s,3H);3.62(t,J=6.2Hz,2H);4.49(d,J=5.6Hz,4H);5.13(t,J=5.6Hz,2H);7.14(s,1H);7.32(s,2H);7.84(t,J=6.0Hz,1H)。LC/MS(B):rt=2.98min;[M+H]+:m/z532;基峰:m/z354;[M-H+HCO2H]-:m/z576。
3.8.3,5-双(羟基甲基)-1-(1-巯基-1-甲基乙基)苯
将43mg的5-羟基甲基-1-(1-巯基-1-甲基乙基)-3-[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯在1ml乙酸/THF/水(3/1/1)混合物中的溶液在AT搅拌4.5h和在RP下浓缩,然后将剩余物溶解在3ml水中。通过添加10%的Na2CO3水溶液使水相的pH达到7,然后用AcOEt萃取水相。有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩。由此得到18mg的3,5-双(羟基甲基)-1-(1-巯基-1-甲基乙基)苯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.76(s,6H);3.19(s,1H);4.48(d,J=5.9Hz,4H);5.14(t,J=5.9Hz,2H);7.13(s,1H);7.36(s,2H)。MS(C):CI:[M+NH4]+:m/z230。
3.9.5-羟基甲基-1-(1-巯基-1-甲基乙基)-3-[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯
将114μl肼水合物添加到336mg的1-{3-[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]-5-(羟基甲基)苯基}-1-甲基乙基硫代乙酸酯在3.7ml乙腈中的溶液中。在AT保持3h之后,将混合物在RP下浓缩,将剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(Biotage25+M)上使用AcOEt在庚烷中的0至55%的梯度纯化。由此得到230mg的5-羟基甲基-1-(1-巯基-1-甲基乙基)-3-[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):0.08(s,6H);0.92(s,9H);1.76(s,6H);3.19(s,1H);4.48(d,J=5.7Hz,2H);4.71(s,2H);5.14(t,J=5.7Hz,1H);7.10(s,1H);7.33to7.42(m,2H)。MS(C):CI:[M+NH4]+:m/z344.
3.10.1-[3-[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]-5-(羟基甲基)苯基]-1-甲基乙基硫代乙酸酯
将404μl硫代乙酸和376mg碘化锌添加到1g的1-(1-羟基-1-甲基乙基)-3,5-双[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯在4.7ml1,2-二氯乙烷中的溶液中。将混合物在50℃加热40min。在回到AT之后,通过过滤移除盐,有机相在RP下浓缩,将剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(Biotage40+M)上使用AcOEt在庚烷中的0至30%的梯度纯化。由此得到248mg的1-[3-[(叔-丁基)二甲基硅烷氧基甲基]-5-(羟基甲基)苯基]-1-甲基乙基硫代乙酸酯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):0.08(s,6H);0.91(s,9H);1.79(s,6H);2.17(s,3H);4.48(d,J=5.6Hz,2H);4.70(s,2H);5.16(t,J=5.6Hz,1H);7.11(s,1H);7.33(s,1H);7.35(s,1H)。LC/MS(A):rt=1.23min;[M+Na]+:m/z391。
3.11.1-(1-羟基-1-甲基乙基)-3,5-双[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯
将10.5mln-BuLi以在庚烷中的1.6M溶液逐滴添加到4.32g1-溴-3,5-双[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯(G.T.CrispandP.D.Turner,Tetrahedron,2000,56(42),8335)在150ml冷却至-71℃的THF中的溶液中。在1h30之后,逐滴添加4.27ml丙酮。使混合物回到AT,然后用饱和NH4Cl水溶液水解。水相用100ml的AcOEt萃取,合并的有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(Biotage65+M)上使用AcOEt在庚烷中的0至20%的梯度纯化。由此得到2.48g的1-(1-羟基-1-甲基乙基)-3,5-双[(叔-丁基)二甲基硅烷基氧基甲基]苯。
1HNMR(400MHz,d-氯仿):0.11(s,12H);0.96(s,18H);1.59(s,6H);1.69(s,1H);4.76(s,4H);7.21(s,1H);7.33(s,2H).LC/MS(B):rt=6.43min;[M+Na]+:m/z447;基峰:m/z407。
实施例4
4.1.制备共轭物
共轭物按照实施例1通过使hu2H11和N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯反应制备。得到的共轭物通过分光光度测量法使用对于茅屋霉素二聚物消光系数为e320nm=7876M-1cm-1和e280nm=4334M-1cm-1以及对于hu2H11消光系数为e280nm=208380M-1cm-1定量确定:确定平均3.13个茅屋霉素二聚物每个抗体分子。
4.2.N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-
基]-吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]-乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯:
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸制备
LC/MS(B):rt=3.27min;[M+H]+:m/z1309;[M+2H]2+:m/z655。
4.3.3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-
基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备
LC/MS(B):rt=3.16min;[M+H]+:m/z1212;[M+2H]2+:m/z606。
4.4.3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基
基氧基)乙基]-哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]-乙氧基}丙酸甲基酯
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)-乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备
1HNMR(500MHz,d6-DMSO):1.22(s,6H);1.69(m,8H);2.37(m,2H);2.40(m,2H);2.48(m,2H);2.53(t,J=6.1Hz,2H);2.72(m,2H);2.92(m,2H);3.04(m,2H);3.11(s,2H);3.19(q,J=5.4Hz,2H);3.39(t,J=5.4Hz,2H);3.42(m,4H);3.49(m,12H);3.59(s,3H);3.62(t,J=6.1Hz,2H);3.86(s,6H);3.88(m,2H);4.10(m,4H);4.22(m,2H);5.17(d,J=13.0Hz,2H);5.22(d,J=13.0Hz,2H);5.55(m,2H);6.94(s,2H);7.09(s,2H);7.38(s,2H);7.77(d,J=3.9Hz,2H);8.01(t,J=5.4Hz,1H)。LC/MS(B):rt=3.30min;[M+H]+:m/z1225;[M+2H]2+:m/z613(基峰)。
4.5.3-{2-[2-(2-{2-[2-(4-{4-[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基]哌嗪-1-基}-1,1-二甲基-4-氧代丁基硫基)乙酰氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯
根据实施例2由4-(2-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶制备
1HNMR(500MHz,d6-DMSO):所有的信号为宽的,其中1.22(s,6H);1.71(m,2H);2.20至2.58(部分掩蔽m,8H);2.75(m,2H);3.12(m,2H);3.19(m,2H);3.47至3.53(m,18H);3.60(m,5H);4.18(m,2H);4.46(m,4H);5.31(m,2H);6.86(s,2H);8.00(m,1H)。LC/MS(B):rt=2.20min;[M+H]+:m/z717;[M-H+HCO2H]-:m/z761。
4.6.4-(2-[4-(4-巯基-4-甲基戊酰基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶
根据实施例2由4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酰基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶制备
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.32(s,6H);1.76(m,2H);2.36至2.53(部分掩蔽m,6H);2.66(s,1H);2.75(t,J=5.5Hz,2H);3.40to3.52(m,4H);4.18(t,J=5.5Hz,2H);4.46(s,4H);5.30(非常宽的m,2H);6.86(s,2H)。LC/MS(B):rt=0.76min;[M+H]+:m/z398;[M-H]-:m/z396。
4.7.4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酰基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶
向600mg4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶在12mlDMF中的溶液中首先添加344μL的TEA,然后在搅拌10min之后,添加748mg4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酸,417μl二异丙基碳二酰亚胺和69mg1-羟基苯并***水合物。在AT保持15h之后,将混合物在RP下浓缩,添加15ml水,用AcOEt进行2次萃取。合并的有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(AnalogixSuperFlashSiO2SF25-80g)上使用MeOH在DCM中的2至10%的梯度纯化。由此得到390mg的4-(2-[4-(4-甲基-4-(甲基二硫基)戊酰基)哌嗪-1-基]乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.26(s,6H);1.79(m,2H);2.36(m,2H);2.39(s,3H);2.40至253(部分掩蔽m,4H);2.75(t,J=5.6Hz,2H);3.45(m,4H);4.18(t,J=5.6Hz,2H);4.46(d,J=5.9Hz,4H);5.30(t,J=5.9Hz,2H);6.86(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.42min;[M+H]+:m/z444;[M-H+HCO2H]-:m/z488。
4.8.4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶
将19ml的HCl在二烷中的4M溶液添加到2.3g4-(2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶在33ml二烷中的溶液中。在AT保持12h之后,所得沉淀物通过在烧结玻璃漏斗上过滤回收,将其溶解于MeOH,然后在RP下浓缩,将剩余物在40ml的MeOH/水1/1混合物中稀释。使所得溶液在MegaBE-SCX,25GM150ML(Varian)上沉积。在用MeOH洗涤该相之后,将有用的产物用2N氨在甲醇中的溶液稀释。将MeOH/NH3相在RP下浓缩。由此得到1.6g的4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):2.40(m,4H);2.68(m,6H);4.15(t,J=5.7Hz,2H);4.44(m,4H);5.29(m,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.10min;[M+H]+:m/z268;[M+2H]2+:m/z134.5;基峰:m/z113。
4.9.4-(2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶
将779mg硼氢化钠和2.29gCaCl2添加到3.1g4-[2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶-2,6-二羧酸二乙基酯在105mlEtOH中的溶液中。在AT保持3h之后,将混合物水解和在RP下浓缩。将水添加到所得剩余物中,用AcOEt萃取所得水相4次。合并的有机相用饱和NaCl水溶液洗涤然后在RP下浓缩。由此得到2.4g4-(2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基)-2,6-双(羟基甲基)吡啶。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.39(s,9H);2.43(m,4H);2.73(t,J=5.6Hz,2H);3.30(部分掩蔽m,4H);4.17(t,J=5.6Hz,2H);4.45(d,J=5.9Hz,4H);5.30(t,J=5.9Hz,2H);6.86(s,2H)。LC/MS(A):rt=0.24min;[M+H]+:m/z368。
4.10.4-[2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶-2,6-二羧酸二乙基酯
将4.5ml的TEA和然后2ml甲烷磺酰氯添加到冷却0℃的5g1-(叔-丁氧基羰基)-4-(2-羟基乙基)哌嗪在102mlDCM中的溶液中。在1h之后,使混合物回到AT。在搅拌另外1h之后,将混合物水解,和用水洗涤有机相2次,然后用MgSO4干燥和在RP下浓缩。将140mlDMF添加到由此获得的剩余物(6.7g)中和使混合物达到60℃。然后添加190mg白屈氨酸的二乙酯(ScriminP.,TecillaP.,TonellatoU.andVendrameT.J.,Org.Chem.,1989,54,5988)和549mgK2CO3,将混合物在80℃加热20h。在RP下浓缩之后,将混合物水解并用AcOEt萃取3次,合并的有机相用NaCl饱和溶液洗涤和在RP下浓缩,将剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(AnalogixSuperFlashSiO2SF25-150g)上使用AcOEt在庚烷中的60至85%的梯度纯化。由此得到3.1g4-[2-(4-(叔-丁氧基羰基)哌嗪-1-基)乙氧基]吡啶-2,6-二羧酸二乙基酯。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.34(t,J=7.2Hz,6H);1.39(s,9H);2.44(m,4H);2.76(t,J=5.7Hz,2H);3.30(部分掩蔽m,4H);4.34(t,J=5.7Hz,2H);4.38(q,J=7.1Hz,4H);7.74(s,2H)。LC/MS(B):rt=2.81min;[M+H]+:m/z452;[MH+HCO2H]-:m/z496。
实施例5
5.1.4-{2-[4-(2-甲基-2-(甲基二硫基)丙基)哌嗪-1-基]乙氧基}-2,6-双(羟基甲基)吡啶
根据实施例1由4-[2-(哌嗪-1-基)乙氧基]-2,6-双(羟基甲基)吡啶制备。
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.25(s,6H);2.39(s,3H);2.40(s,2H);2.44至2.57(部分掩蔽m,8H);2.69(t,J=5.7Hz,2H);4.14(t,J=5.7Hz,2H);4.45(d,J=5.7Hz,4H);5.29(t,J=5.7Hz,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(B):rt=0.51min;[M+H]+:m/z402。
实施例6
6.1.制备共轭物
共轭物按照实施例1通过使hu2H11和N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯反应制备。使用茅屋霉素二聚物的消光系数(e319nm=7789M-1cm-1和e280nm=4362M-1cm-1)和hu2H11的消光系数(e280nm=208380M-1cm-1),通过分光光度测量法定量确定得到的共轭物:确定平均2.90个茅屋霉素二聚物每个抗体分子。
6.2.N-羟基琥珀酰亚胺基3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉
吡啶-4-基氧基)-乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸酯
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸制备:
LC/MS(F):rt=1.02min;[M+H]+:m/z1225;[M+H2O+H]+:m/z1243
6.3.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四
基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四氢吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂-5-酮-8-基氧基甲基]吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备:
LC/MS(F):rt=0.97min;[M+H]+:m/z1129
6.4.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双[(S)-2-乙-(E)-叉-7-甲氧基-1,2,3,11a-四
基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备:
1HNMR(500MHz,d6-DMSO):吸收是宽的,其中1.20(s,6H);1.58至1.73(m,6H);2.38(s,3H);2.52至3.07(m,13H);3.36至3.63(m,23H);3.67至3.91(m,8H);4.06至4.26(m,6H);5.02至5.26(m,4H);5.33至5.60(m,2H);6.39至7.42(m,6H);7.76(m,2H)。
LC/MS(A):rt=0.77min;[M+H]+:m/z1142;[M+2H]2+:m/z571.5(基峰)。
6.5.3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{[2-(2,6-双(羟基甲基)吡啶-4-基氧基)乙基](甲基)氨基}-1,1-二甲基乙基硫基)乙酰基(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯:
根据实施例2由3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙酰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯制备:
1HNMR(400MHz,d6-DMSO):50/50旋转异构体的拆分,其中:1.22(s,3H);1.24(s,3H);2.41(s,3H);2.53(t,J=6.2Hz,2H);2.56(m,2H);2.80(s,1H);2.88(t,J=5.9Hz,2H);3.05(s,2H);3.35至3.58(m,18H);3.59(s,3H);3.62(t,J=6.2Hz,2H);4.13(t,J=5.9Hz,2H);4.45(d,J=5.9Hz,4H);5.29(t,J=5.9Hz,2H);6.85(s,2H)。LC/MS(B):rt=2.18min;[M+H]+:m/z634;[M-H+HCO2H]-:m/z678。
6.6.3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙酰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯
将117.4mgN-羟基琥珀酰亚胺基碘乙酸酯在6.5mlDCM中的溶液添加到215mg3-(2-{2-[2-(2-(甲基氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯中。在AT保持2h之后,将混合物在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(AnalogixSuperFlashSiO2SF25-24g)上使用MeOH在DCM中的0至6%的梯度纯化。由此得到210mg3-{2-[2-(2-{2-[(2-碘乙酰基)(甲基)氨基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸甲基酯。1HNMR(400MHz,d6-DMSO):55/45旋转异构体的拆分,其中2.54(t,J=6.2Hz,2H);2.83(s,1.35H);3.02(s,1.65H);3.36至3.55(m,16H);3.60(s,3H);3.63(t,J=6.2Hz,2H);3.83(s,1.1H);3.88(s,0.9H)。LC/MS(A):rt=0.62min;[M+H]+:m/z462。
6.7.3-(2-{2-[2-(2-(甲基氨基)环氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸甲基酯
将3ml的HCl在二烷中的4M溶液添加到390mg3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯在5.3ml二烷中的溶液中。在AT保持12h之后,将混合物在RP下浓缩和将剩余物溶解在最少的甲醇中并使其沉积在MegaBE-SCX,10GM60ML(Varian)上。在用MeOH洗涤该相之后,将有用的产物用2N氨在甲醇中的溶液洗脱。甲醇/NH3相在RP下浓缩。由此得到270mg甲基3-(2-{2-[2-(2-(甲基氨基)乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸酯。1HNMR(400MHz,d6-DMSO):2.28(s,3H);2.54(t,J=6.2Hz,2H);2.59(t,J=5.9Hz,2H);3.44(t,J=5.9Hz,2H);3.47至3.54(m,12H);3.60(s,3H);3.63(t,J=6.2Hz,2H)。LC/MS(A)(ELSD):rt=0.30min;[M+H]+:m/z294。
6.8.3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯
将2ml三甲基甲硅烷基重氮甲烷在己烷中的2M溶液添加到冷却至0℃的500mg3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸在4.8mlMeOH中的溶液中。在2h之后,混合物通过添加120μl乙酸中和,然后在RP下浓缩,剩余物通过快速色谱法在二氧化硅(AnalogixSuperFlashSiO2SF25-40g)上使用甲醇在DCM中的0至5%的梯度。由此得到400mg3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸甲基酯。1HNMR(400MHz,d6-DMSO):1.38(s,9H);2.54(t,J=6.2Hz,2H);2.80(宽s,3H);3.29(部分掩蔽t,J=5.9Hz,2H);3.45至3.55(m,14H);3.59(s,3H);3.63(t,J=6.2Hz,2H)。LC/MS(A):rt=0.84min;[M+Na]+:m/z416(基峰);LC/MS(A):rt=0.84min;[M+Na]+:m/z416(基峰)。
6.9.3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸
将85.4mgNaH逐份添加到冷却至0℃的520mg3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸在14mlTHF中的溶液中。在搅拌5min之后,添加150μl碘甲烷。然后将混合物在AT搅拌2h,然后添加另外150μl碘甲烷。在AT保持12h之后,将混合物水解,然后通过在0℃添加乙酸水溶液使其达到酸性pH。水相用AcOEt萃取3次,合并的有机相用MgSO4干燥和在RP下浓缩,使得到的粗产物根据相同方法与85mgNaH和176μl碘甲烷再次反应另外2h。由此得到500mg的3-[2-(2-{2-[2-((叔-丁氧基羰基)(甲基)氨基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸。LC/MS(F):rt=1.01min;[M+H]+:m/z380。
评价其中Z
b
R
b
=-OMe和Y=Y’=-OMe的式(IA)的化合物对MDA-MB-231、MDA-A1和HCT116细胞系的增殖的抑制作用
使处于指数生长阶段的MDA-MB-231、MDA-A1或HCT116细胞受胰蛋白酶作用并重新悬浮在它们各自的培养基中(对于MDA细胞为DMEM/F12Gibco#21331,10%FCSGibco#10500-056,2nM谷氨酰胺Gibco#25030;对于HCT116细胞为DMEMGibco#11960,10%FCSGibco#10500-056,2mM谷氨酰胺Gibco#25030)。将细胞混悬液以5000细胞/孔的密度(MDA-MB-231,MDA-A1,HCT116)在包含血清的完全培养基中接种到Cytostar96-孔培养平板(GEHealthcareEurope,#RPNQ0163)。在培养4小时之后,将茅屋霉素二聚物的连续稀释物添加到孔中,对于各浓度,重复三次。将细胞在37℃在包含5%CO2的气氛下在细胞毒素剂存在下培养3天。在第4天,将10μl的14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔,PerkinElmer#NEC56825000)添加到各孔中。在实验开始96小时之后,使用MicroBeta放射性计数器(PerkinElmer)测量14C-胸苷的结合。通过确定用细胞毒素剂处理的细胞所得到的计数和对照孔(单独用培养基处理)的细胞所得到的计数之间的比率,将数据按存活率%的形式表示。
表II
发现,其中ZbRb=-OMe的测试化合物具有强大的抗癌活性;这使得可以认为,特征在于另一个ZbRb基团的类似化合物往往表现出同样的活性。
评价hu2H11-细胞毒素剂共轭物对MDA-MB-231细胞系的增殖的抑制作用
使处于指数生长阶段的MDA-MB-231细胞受胰蛋白酶作用并重新悬浮在它们各自的培养基中(DMEM/F12Gibco#21331,10%FCSGibco#10500-056,2nM谷氨酰胺Gibco#25030)。将细胞混悬液以5000细胞/孔的密度在包含血清的完全培养基中接种到Cytostar96-孔培养平板(GEHealthcareEurope,#RPNQ0163)。在培养4小时之后,将抗体-细胞毒素剂免疫共轭物的连续稀释物按从10-7至10-12M的降序浓度添加到各孔中(对各浓度,重复三次)。将细胞在37℃在包含5%CO2的气氛下在抗体-细胞毒素剂免疫共轭物存在下培养3天。在第4天,将10μl的14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔,PerkinElmer#NEC56825000)添加到各孔中。在实验开始96小时之后,使用MicroBeta放射性计数器(PerkinElmer)测量14C-胸苷的结合。通过确定用免疫共轭物处理的细胞所得到的计数和对照孔(单独用培养基处理)的细胞所得到的计数之间的比率,将数据按存活率%的形式表示。在某些实验*中,在实验开始时,将裸抗体hu2H11以1μM的浓度添加到孔中,并按照以上描述测量对增殖的抑制作用。
表III
非可断裂的茅屋霉素二聚物共轭物的单体稳定性
用描述于国际申请WO09016516的实施例3和5的茅屋霉素二聚物制备的非可断裂的hu2H11共轭物在3-5℃储存几个月之后倾向于经历它们的单体纯度随时间下降。具体地,这些共轭物(在pH6.5具有组氨酸浓度为10mM且包含10%蔗糖和5%NMP的含水缓冲液中配制,表现平均3至3.5个茅屋霉素二聚物每个抗体分子,初始单体纯度的量级为约97.5%)在6至8个月内单体纯度可能下降6至15%。这种现象在具有平均3.5个茅屋霉素二聚物每个抗体分子的实施例3的共轭物中未观察到,该共轭物在相同的储存条件下在4个月内保持单体纯度大于99%,由此表明该特定共轭物的较好的稳定性。在共轭物的领域中通常期望的目标是能够得到随时间保持单体纯度的共轭物。
评价hu2H11-细胞毒素剂共轭物对携带后期人乳腺癌MDA-MB-231的雌性SCID小鼠的抗肿瘤活性
对于皮下移植在雌性SCID小鼠上的可测量的乳腺肿瘤MDA-MB-231,以4个剂量水平评价相同抗体hu2H11的两种共轭物,表示为C1(用国际申请WO09016516的实施例5中描述的茅屋霉素二聚物制备)和C2(实施例3的共轭物)。对照组未处理。两种共轭物的剂量按μg茅屋霉素二聚物/kg的形式给出。对于C1在第13天通过静脉注射(IV)大丸剂型以80、40、20和10μg/kg对它们进行给药,对于C2则在第24天进行。
关于评价共轭物的抗肿瘤活性,每天称重动物,使用卡尺每周测量肿瘤两次。抗肿瘤活性在最大耐受量(MTD)评价。认为产生最低20%的重量损失或10%(或更大)与共轭物相关的死亡率的剂量是毒性的。动物的身体重量包括肿瘤的重量。肿瘤的重量根据下式计算:重量(mg)=[长度(mm)×宽度(mm)2]/2。功效参数是ΔT/ΔC、恢复的平均百分比、部分恢复和完全恢复(PR和CR)和在研究结束时无肿瘤小鼠的数目(TFM)。
针对各肿瘤,各处理的小鼠(T)和对照小鼠(C)的肿瘤体积的变化通过研究开始那天的肿瘤体积减去指定观察那天的肿瘤体积而计算。平均ΔT针对各处理组计算,平均ΔC针对对照组计算。然后计算比率ΔT/ΔC并将其表示为百分比:ΔT/ΔC=(deltaT/deltaC)x100。
当ΔT/ΔC小于40%时,认为剂量是有治疗活性的,当ΔT/ΔC小于10%时,认为剂量是非常有治疗活性的。当ΔT/ΔC小于0时,认为剂量是高度活性的,然后计算恢复的百分比(根据PlowmanJ.,DykesD.J.,HollingsheadM.,Simpson-HerrenL.andAlleyM.C.,HumantumorxenograftmodelsinNCIdrugdevelopment:FeibigH.H.BA,editor.Basel:Karger.;1999,pp.101-125)。
肿瘤恢复的百分比定义为处理的组在指定观察那天的肿瘤体积与其在处理的第一天的体积相比降低的百分比。针对各动物和在具体时间t,计算肿瘤恢复的百分比。然后针对该组计算恢复的平均百分比。
部分恢复(PR):当肿瘤体积的降低量达到处理开始时肿瘤体积的50%时,该恢复定义为部分恢复。
完全恢复(CR):当肿瘤的体积=0mm3时,得到完全恢复(当肿瘤的体积无法测量时,认为存在CR)。
TFM:无肿瘤小鼠定义为在研究结束时未表现出可察觉的肿瘤(超过100天的处理)。
根据单-剂量给药方案,针对该项研究中这两种共轭物所测试的最高剂量(80μg/kg)被证实有毒性,这导致重量损失和死亡率。
在MTD(40μg/kg),C1是非常有治疗活性的,并且导致重量损失最低为9.6%、ΔT/ΔC为7%和5只SCID小鼠中有3只部分恢复(PR)。在20和10μg/kg的较低剂量也观察到抗肿瘤活性,未产生部分恢复。
在MTD(40μg/kg),C2是高度活性的,并且导致重量损失最低为5%,肿瘤恢复率为96.2%以及6只小鼠中6只部分恢复(PR),包括1只TFM。其在20μg/kg的较低剂量也是非常有治疗活性的,肿瘤恢复率为66.4%,6只小鼠中有4只部分恢复(PR)。在10μg/kg的最低剂量也观察到抗肿瘤活性,但是,未导致恢复或PR。
总之,发现C2表现出强的抗癌活性,并对于在MTD的肿瘤恢复、PR和TFM,C2显示出比C1好的活性,而C1在相同剂量未观察到这些。
Claims (38)
1.式(IA)或(IB)的化合物:
其中:
·Y和Y’相同或不同,彼此独立地表示H或C1-C4烷氧基基团;
·M表示CH或N;
·L表示:
-L1-L2-基团,其中L1经ALK或OALK基团与包含M的芳环连接,表示下列基团之一:
-ALK-S-
-O-ALK-NR3-ALK-S-
和L2表示经-CH2C(=O)-与L1连接的-CH2C(=O)-NR3-(CH2CH2O)i-ALK-基团;
·R3表示H或(C1-C6)烷基基团;
·ALK表示(C1-C6)亚烷基;
·i表示整数1至40;
·Zb表示单键、-O-或-NH-,和Rb表示H或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基基团,或者Zb表示单键和Rb表示卤素;
其中所述芳基为苯基或萘基基团,且所述杂芳基为吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基或***基基团。
2.根据权利要求1的化合物,其中i表示整数1至20。
3.根据权利要求1的化合物,其中i表示整数1至10。
4.根据权利要求1至权利要求3中任一项的化合物,其中Y和Y’表示C1-C4烷氧基基团。
5.根据权利要求1至权利要求3中任一项的化合物,其中Y和Y’表示甲氧基基团。
6.根据权利要求1至权利要求3中任一项的化合物,其中L选自以下:
-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2-;
-O-ALK-NR3-ALK-S-CH2C(=O)-NH-(CH2CH2O)i-CH2CH2;
-O-ALK-NR3-ALK-S-(CH2CH2O)i-CH2CH2-。
7.根据权利要求1的化合物,其中L选自以下:
8.根据权利要求1的化合物,其中L选自下列:
9.根据权利要求1至权利要求8中任一项的化合物,其中-COZbRb表示-COOH,-COO(C1-C6)烷基,-COOCH3,-COOCH2CH=CH2, 基团,或其中基团为
10.根据权利要求1的化合物,选自下列之一:
11.制备共轭物的方法,包括:
(i)使结合剂的任选地添加缓冲液的水溶液和权利要求1至10中任一项定义的化合物的溶液接触并使其反应;
(ii)然后任选地将步骤(i)中形成的共轭物与式(I)的化合物和/或与未起反应的结合剂和/或与可能形成的聚集体分离。
12.根据权利要求11的方法,其中所述-C(=O)ZbRb基团对于结合剂上存在的化学基团具有反应性,从而确保式(I)的化合物与结合剂通过形成共价键而连接。
13.根据权利要求11的方法,其中所述-C(=O)ZbRb基团对于抗体上存在的氨基基团具有反应性,从而确保式(I)的化合物与结合剂通过形成共价键而连接。
14.根据权利要求11至13中任一项的方法,其中步骤(ii)包括:
-将在步骤(i)中形成的共轭物与未反应的结合剂和与可能存在于溶液中的聚集体分离;
或者
-将步骤(i)的共轭物仅与未反应的式(I)的化合物和与可能形成的聚集体分离和将可能未发生反应的结合剂留在溶液中。
15.根据权利要求11至13中任一项的方法,其中所述结合剂是配体,蛋白质,抗体,蛋白质或抗体片段,肽,寡核苷酸或寡糖。
16.根据权利要求15的方法,其中所述抗体是单克隆抗体。
17.根据权利要求11至权利要求13中任一项的方法,其中所述反应在20至40℃的温度进行和/或该反应的持续时间为1至24h。
18.根据权利要求11至13中任一项的方法,其中,在步骤(i)或(ii)之后,使共轭物的溶液经受超滤和/或渗滤的步骤(iii)。
19.能够通过根据权利要求11至18中任一项的方法得到的共轭物。
20.根据权利要求19的共轭物,其中所述结合剂是抗体,特征在于平均DAR为1至10,
该DAR通过方程DAR=cD/cA计算
其中:
cD=[(eALO1xALO2)-(eALO2xALO1)]/[(eDLO2xeALO1)-(eALO2xeDLO1)]
cA=[ALO1–(cDxeDLO1)]/eALO1
ALO1和ALO2表示所述共轭物的水溶液在波长LO1和LO2的吸光率,在SEC谱的相应峰上测得,
eDLO1和eDLO2分别表示共轭之前吡咯并[1,4]苯并二氮杂二聚物在两个波长LO1和LO2的摩尔吸光系数;
eALO1和eALO2分别表示裸抗体在两个波长LO1和LO2的摩尔吸光系数,
LO1=280nm和LO2=320nm。
21.根据权利要求20的共轭物,其中所述结合剂是单克隆抗体。
22.根据权利要求20或21的共轭物,其中平均DAR为1.5至7。
23.根据权利要求1至10中任一项的化合物在制备结合剂中的用途,其中下式的二聚物在M的对位共价连接于所述结合剂:
24.根据权利要求23的用途,其中所述结合剂是抗体。
25.根据权利要求24的用途,其中所述结合剂为单克隆抗体。
26.根据权利要求23至25中任一项的用途,其中Y和Y’表示C1-C4烷氧基。
27.根据权利要求26的用途,其中Y和Y’表示甲氧基。
28.结合剂,其中在权利要求1至10中任一项定义的化合物与所述结合剂反应之后,下式的二聚物在M的对位共价连接于所述结合剂:
29.根据权利要求28的结合剂,其对于位于与肿瘤相关的癌细胞或基质细胞的抗原或抗原群具有亲和力。
30.根据权利要求28至权利要求29中任一项的结合剂,其为抗体。
31.根据权利要求30的结合剂,其中所述结合剂为单克隆抗体。
32.能够通过根据权利要求11至18中任一项的方法得到的共轭物的溶液。
33.药物组合物,其包含根据权利要求1至10中任一项的化合物或根据权利要求19至22中任一项的共轭物和至少一种赋形剂。
34.式P2的化合物
或下式的化合物
作为中间体在制备权利要求1至10中任一项定义的式(I)的化合物中的用途,
其中L*选自:
-ALK-SH;
-O-ALK-NR3-ALK-SH;
其中在这些式中:
■L、M、ALK、ALK’、R3、Zb和Rb如权利要求1至10中任一项所定义,其中ALK和ALK’彼此独立地表示(C1-C6)亚烷基;
■E和E’彼此独立地表示-OH基团或离去基团,其中所述离去基团选自卤素原子或甲磺酸酯基团、甲苯磺酸酯基团、对硝基苯磺酸酯基团或-OPPh3 +基团。
35.选自下列之一的化合物作为中间体在制备权利要求1至10中任一项定义的式(I)的化合物中的用途:
应理解,该-COOH端基官能团可以由-COOC1-C6烷基端基官能团替代,该-SH端基官能团可以由二硫化物官能团替代,其中二硫化物官能团是-SSMe官能团。
36.根据权利要求35的用途,其中-COOC1-C6烷基端基官能团是-COOMe端基官能团。
37.根据权利要求1至10中任一项的化合物在制备抗癌剂中的用途。
38.根据权利要求19至22中任一项的共轭物在制备抗癌剂中的用途。
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KR20180019592A (ko) | 2015-06-23 | 2018-02-26 | 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 | 마크로시클릭 벤조디아제핀 이량체, 그의 접합체, 제조법 및 용도 |
MA43345A (fr) | 2015-10-02 | 2018-08-08 | Hoffmann La Roche | Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation |
GB201601431D0 (en) | 2016-01-26 | 2016-03-09 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines |
GB201602359D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
GB201602356D0 (en) | 2016-02-10 | 2016-03-23 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
EP3433278A4 (en) | 2016-03-25 | 2019-11-06 | Seattle Genetics, Inc. | PROCESS FOR THE PREPARATION OF PEGYLATED MEDICINE LINKS AND INTERMEDIATES THEREOF |
GB201607478D0 (en) | 2016-04-29 | 2016-06-15 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine Conjugates |
KR20190038579A (ko) | 2016-08-09 | 2019-04-08 | 시애틀 지네틱스, 인크. | 개선된 물리화학적 특성을 갖는 자기 안정화 링커를 구비한 약물 접합체 |
GB201617466D0 (en) | 2016-10-14 | 2016-11-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
JP7244987B2 (ja) | 2016-12-14 | 2023-03-23 | シージェン インコーポレイテッド | 多剤抗体薬物コンジュゲート |
EP3574016A2 (en) | 2017-01-24 | 2019-12-04 | Innate Pharma | NKp46 BINDING AGENTS |
US20200023071A1 (en) | 2017-02-06 | 2020-01-23 | Innate Pharma | Immunomodulatory antibody drug conjugates binding to a human mica polypeptide |
GB201702031D0 (en) | 2017-02-08 | 2017-03-22 | Medlmmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepine-antibody conjugates |
PT3544636T (pt) | 2017-02-08 | 2021-05-04 | Medimmune Ltd | Conjugados de anticorpos-pirrolobenzodiazepinas |
US11730822B2 (en) | 2017-03-24 | 2023-08-22 | Seagen Inc. | Process for the preparation of glucuronide drug-linkers and intermediates thereof |
WO2018192944A1 (en) | 2017-04-18 | 2018-10-25 | Medimmune Limited | Pyrrolobenzodiazepine conjugates |
KR20190141666A (ko) | 2017-04-20 | 2019-12-24 | 에이디씨 테라퓨틱스 에스에이 | 항-axl 항체-약물 접합체로의 병용 요법 |
AU2018285562B2 (en) | 2017-06-14 | 2024-01-18 | Adc Therapeutics Sa | Dosage regimes for the administration of an anti-CD19 ADC |
ES2906965T3 (es) | 2017-08-18 | 2022-04-21 | Medimmune Ltd | Conjugados de pirrolobenzodiazepina |
TW202404648A (zh) | 2017-09-29 | 2024-02-01 | 日商第一三共股份有限公司 | 抗體-吡咯并苯二氮呯衍生物複合體 |
WO2019092148A1 (en) | 2017-11-10 | 2019-05-16 | Innate Pharma | Antibodies with functionalized glutamine residues |
GB201803342D0 (en) | 2018-03-01 | 2018-04-18 | Medimmune Ltd | Methods |
GB201806022D0 (en) * | 2018-04-12 | 2018-05-30 | Medimmune Ltd | Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof |
EP4036149A4 (en) | 2019-09-26 | 2023-10-25 | NOF Corporation | HETEROBIFUNCTIONAL MONODISPERSPERED POLYETHYLENE GLYCOL WITH PEPTIDE LINKER |
BR112022020332A2 (pt) | 2020-04-10 | 2022-12-13 | Seagen Inc | Composto conjugado anticorpo-droga, composição, método de tratamento de câncer e de um distúrbio autoimune |
JP2024501121A (ja) | 2020-11-25 | 2024-01-11 | イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム | 癌の処置 |
JP2024511360A (ja) | 2021-03-18 | 2024-03-13 | シージェン インコーポレイテッド | 生体活性化合物の内部移行複合体からの選択的薬物放出 |
WO2022198231A1 (en) | 2021-03-18 | 2022-09-22 | Seagen Inc. | Selective drug release from internalized conjugates of biologically active compounds |
WO2023227660A1 (en) | 2022-05-25 | 2023-11-30 | Innate Pharma | Nectin-4 binding agents |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993018045A1 (en) * | 1992-03-09 | 1993-09-16 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Anti-cancer pyrrolobenzodiazepine derivatives |
WO2000012508A3 (en) * | 1998-08-27 | 2000-09-21 | Univ Portsmouth | Pyrrolbenzodiazepines |
WO2009016516A2 (en) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Sanofi-Aventis | Cytotoxic agents comprising new tomaymycin derivatives and their therapeutic use |
CN101374846A (zh) * | 2006-01-25 | 2009-02-25 | 赛诺菲-安万特 | 含有新茅屋霉素衍生物的细胞毒素药物和它们的治疗用途 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1516743A (fr) | 1966-04-01 | 1968-02-05 | Rhone Poulenc Sa | Nouvel antibiotique et son procédé de préparation par culture de streptomyces croceus |
GB8307865D0 (en) * | 1983-03-22 | 1983-04-27 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Benzimidazole derivatives |
KR19990029749A (ko) * | 1997-09-17 | 1999-04-26 | 미우라 아끼라 | 2가 반응성 수용성 고분자 유도체 및 이들을 함유하는 복합체 |
GB9818731D0 (en) | 1998-08-27 | 1998-10-21 | Univ Portsmouth | Compounds |
CN1514843A (zh) * | 2001-06-08 | 2004-07-21 | �о���Ӧ�ÿ�ѧЭ��ɷ�����˾ | 生长激素释放抑制因子-多巴胺嵌合类似物 |
US6716821B2 (en) | 2001-12-21 | 2004-04-06 | Immunogen Inc. | Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same |
US7230101B1 (en) | 2002-08-28 | 2007-06-12 | Gpc Biotech, Inc. | Synthesis of methotrexate-containing heterodimeric molecules |
AU2003285878B2 (en) | 2002-11-07 | 2011-04-28 | Immunogen, Inc. | Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same |
BRPI0410748B8 (pt) | 2003-05-20 | 2021-05-25 | Immunogen Inc | compostos de maitansinóides, suas composições farmacêuticas, métodos de esterificação de maitansinóides, bem como métodos para a sua produção, e conjugado de maitansinóide-agente de ligação celular |
JP2007503202A (ja) | 2003-07-21 | 2007-02-22 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | Ca6抗原特異的な細胞毒性コンジュゲートおよびその使用方法 |
AU2004284075A1 (en) | 2003-10-22 | 2005-05-06 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto |
EP1723152B1 (en) * | 2004-03-09 | 2015-02-11 | Spirogen Sàrl | Pyrrolobenzodiazepines |
EP1669358A1 (en) | 2004-12-07 | 2006-06-14 | Aventis Pharma S.A. | Cytotoxic agents comprising new taxanes |
CA3005835C (en) | 2004-12-22 | 2023-01-31 | Ambrx, Inc. | Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides |
AU2006311485B2 (en) * | 2005-11-08 | 2012-09-27 | Immunogen, Inc. | Processes for preparation of maytansinol |
EP1832577A1 (en) | 2006-03-07 | 2007-09-12 | Sanofi-Aventis | Improved prodrugs of CC-1065 analogs |
US8212083B2 (en) | 2006-04-27 | 2012-07-03 | Intezyne Technologies, Inc. | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) containing acid-labile amino protecting groups and uses thereof |
EP1864682A1 (en) | 2006-06-09 | 2007-12-12 | Sanofi-Aventis | Leptomycin derivatives |
JP5622390B2 (ja) | 2006-07-18 | 2014-11-12 | サノフイ | 癌治療用対epha2アンタゴニスト抗体 |
EP1914242A1 (en) * | 2006-10-19 | 2008-04-23 | Sanofi-Aventis | Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer |
WO2009026274A1 (en) | 2007-08-22 | 2009-02-26 | Medarex, Inc. | Site-specific attachment of drugs or other agents to engineered antibodies with c-terminal extensions |
AU2009243009B2 (en) * | 2008-04-30 | 2014-09-11 | Immunogen, Inc | Potent conjugates and hydrophilic linkers |
SG10201706294VA (en) * | 2009-02-05 | 2017-09-28 | Immunogen Inc | Novel benzodiazepine derivatives |
TW201117814A (en) * | 2009-10-02 | 2011-06-01 | Sanofi Aventis | New maytansinoids and the use of said maytansinoids to prepare conjugates with an antibody |
FR2963007B1 (fr) * | 2010-07-26 | 2013-04-05 | Sanofi Aventis | Derives anticancereux, leur preparation et leur application therapeutique |
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2013
- 2013-06-05 CL CL2013001609A patent/CL2013001609A1/es unknown
- 2013-06-21 US US13/923,544 patent/US20140155590A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993018045A1 (en) * | 1992-03-09 | 1993-09-16 | Cancer Research Campaign Technology Limited | Anti-cancer pyrrolobenzodiazepine derivatives |
WO2000012508A3 (en) * | 1998-08-27 | 2000-09-21 | Univ Portsmouth | Pyrrolbenzodiazepines |
CN101374846A (zh) * | 2006-01-25 | 2009-02-25 | 赛诺菲-安万特 | 含有新茅屋霉素衍生物的细胞毒素药物和它们的治疗用途 |
WO2009016516A2 (en) * | 2007-07-19 | 2009-02-05 | Sanofi-Aventis | Cytotoxic agents comprising new tomaymycin derivatives and their therapeutic use |
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