CN102746990A - 由微藻类制造高含量淀粉的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于培养微藻类的培养基，其包括NaNO3、K2HPO4、MgCl2·6H2O、Na2CO3、CaCl2、乙二胺四乙酸、柠檬酸和Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。本发明的培养基可以用于培养具有高淀粉含量的微藻类，因此可以低制造成本获得生物质材料，从而导致成本效益。因此，可以用得自于生物质的材料替代传统的基于石油的聚丙烯材料，其供应于汽车的内部和外部材料。因此，考虑到近来油价走高的趋势，可以减少对基于石油的产品的依赖，并且可以大大减少内部和外部材料的制造成本。

Description

由微藻类制造高含量淀粉的方法
技术领域
本发明涉及一种用于培养具有高淀粉含量的微藻类的培养基(medium)，以及用该培养基培养具有高淀粉含量的微藻类的方法。
背景技术
20世纪发生了快速的工业化进程，其归因于化石燃料，特别是石油的消耗，而快速的工业化进程和人口增加反过来驱使了对于石油的增长性需求。然而，石油不是可再生的资源，在自然界的储备是有限的。而且，化石燃料燃烧引起的二氧化碳排放被责备为全球变暖的主要原因。正因如此，近来在对能量效率的改善和对于石油的替代品上投入了大量的关注以减少二氧化碳的排放。
化石燃料的替代品之一是植物来源的生物质聚合物，其通过化学或生物的方法从例如玉米、大豆、甘蔗和木材的可再生植物资源制备而来。这种形式的燃料对环境的影响较小，因为它在具有可生物降解性之外，还能减少二氧化碳的排放。在生物质聚合物中，聚乳酸是线性脂肪族聚酯，其通过将玉米或土豆的淀粉发酵或者将由植物纤维素糖基化和发酵得到的糖单体进行聚合而制备得到。同时它也是碳中性、环境友好的热塑性聚合物的资源。然而，保证廉价的生物质和糖类资源对于大规模的生物材料制备是很重要的。
在各种生物质材料中，微藻类受到越来越多的关注，因为微藻类是一种有前景、可持续的来源，其能快速增长、具有高含量的脂质、且不与食物资源竞争。在作为化石燃料替代品的生物质材料中，藻类被视为具有前景、且即将到来的替代品，并且其不与食物资源竞争。
具体地，微藻类是光合自养生物，其能够通过太阳能由水和二氧化碳生成有机化合物。一般而言，大体将藻类分为微藻类和大型藻类(macroalgae)。在微藻类的许多物种中，具有高脂质含量的微藻类得以积极的研究用于生产电能和生物燃料。
作为一种生物质，微藻类被用于通过酯交换反应来制造生物柴油，通过发酵来制备乙醇或甲烷，通过气化来制造甲烷或氢，通过热解来制造气体/液体燃料，以及通过燃烧来制造热或电力。实际上，通过对生物质中含有的脂质进行酯交换而制造的生物柴油已经完全在全球范围内得以充分的商业化。然而，通过糖基化来回收碳水化合物(戊糖、己醣)需要能够培养具有高淀粉含量的微藻类的技术，而该技术相比较而言还处于初级阶段。
除了例如氮和磷的必需元素之外，藻类的生长通常还需要硅、少量的无机材料、维他命等，而它们的生长范围由各元素的合适梯度决定。见Schindler 1974、Han，2000、Lund，1950。实际上，绿藻类在高比例的氮/磷条件下活跃生长，而例如小球藻(Chlorella)的小的球形细胞在高比例的硝酸盐或氨条件下活跃生长。小球藻是一种小的单细胞的浮游植物，且为直径大约3-10微米的球形细胞。它也能在包括弱光和低温的较差生长条件下快速生长。
现已有大约30种不同类型的用于培养小球藻的培养基。到目前为止，用于小球藻的最广为人知的培养基是具有高含量氮和磷的Allen’s培养基。开发该培养基仅仅是为了促进藻类的生长，但是还没有研究来开发可用来使微藻类的淀粉含量最大化的培养基。
以上在背景部分公开的信息仅为了加强对本发明背景的理解，因而可能包含本国家该领域内的普通技术人员已知的但不形成现有技术的信息。
发明内容
本发明提供了一种特定的用于培养微藻类以使微藻类中的淀粉含量最大化的培养基。在说明性实施方式中，本发明中用于培养微藻类的培养基包括NaNO3、K2HPO4、MgCl2·6H2O、Na2CO3、CaCl2、乙二胺四乙酸、柠檬酸和Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。另外，本发明也提供了使用该培养基来培养微藻类的方法。
本发明的其他方面和优选的实施方式在下文中进行讨论。
附图说明
以上的和本发明的其他特征将参考其中的某些示例性实施方式进行详细说明，这些示例性实施方式在附图中说明且仅以说明的方式在下文中给出，因而不限制本发明，其中：
图1为示出用实施例1的培养基培养的微藻类的照片。
应该理解的是，附图不必要成比例，而是对说明本发明基本原理的各种优选特征的略微简化的呈现。在本文公开的本发明的特定设计特征，包括，例如，特定的尺寸、朝向、放置点和形状将部分地由特定意向的应用和使用环境所决定。
具体实施方式
接下来将详细参考本发明的多个实施方式，其实施例在附图中说明并在下文中进行描述。虽然本发明将结合示例性实施方式进行说明，应该理解的是本发明无意于用那些示例性实施方式来限制本发明。相反，本发明意在不仅涵盖示例性实施方式，还有多种替代方式、修饰方式、等同方式和其他实施方式，而这些都可以包括在用所附权利要求限定的本发明的精神和范围内。
本发明涉及用于培养微藻类的培养基，其包括大约80-90重量％的NaNO3、大约2.0-3.0重量％的K2HPO4、大约4.0-8.0重量％的MgCl2·6H2O、大约1.0-2.0重量％的Na2CO3、大约1.0-2.0重量％的CaCl2、大约1.0-4.0重量％的乙二胺四乙酸、大约0.3-0.5重量％的柠檬酸和大约0.3-0.6重量％的Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。
微藻类优选为微藻类小球藻，其为最广泛研究的聚集型(colony-type)藻类，且具有广泛的工业应用范围。细胞进行无性生殖并***成4、8或16个细胞，并在海水或淡水中生长。有若干物种是本领域技术人员所熟知的。尽管存在种间差异，小球藻的生长和增殖大体上依赖于在光合生长和增殖期间提供的温度和光照强度。因此，光周期和温度在很大程度上影响小球藻的产量。有机氮或碳来源的浓度也和温度及pH控制一起是重要的因素。基于不同的条件，小球藻的化学组成有很大的变动。基于培养条件，组成中蛋白质的变化范围在大约50-60％，糖大约在15-25％，脂质大约在2-65％。特别地，脂质的含量是高度可变的。
在本发明中，控制培养基中的特定成分，以调节个体数量的增加。具体地，为了防止个体数目的增加，调节培养基中的硫含量。当前的结果显示，硫含量的减少是非常有效的。随着硫含量的减少，细胞***显著地减少，因此在每个细胞内的碳氢化合物不会被用作能量来源，从而导致了淀粉含量的增加。
用于培养微藻类的培养基具有以下组成。
NaNO3(硝酸钠)是氮的来源。和磷一起，NaNO3需要作为必需营养素供给非固氮藻类，因此是培养基组成的必需元素。其优选含量是大约80-90重量％。即使当氮含量少于大约80重量％时，生长也不会受影响。然而，该氮含量对于富集培养是必需的。另一方面，氮过量会导致藻类过度生长，从而导致变形或坏死。
K2HPO4(磷酸氢二钾)被用作磷的来源，是合成胞质蛋白和核苷酸所必需的，因此和氮一起是构成培养基组成的必需元素。其优选含量为大约2.0-3.0重量％，而且应该低于过营养化参数(25，相对于氮)。然而，如果磷含量过高，生长会受到抑制，特别地，在混合培养中，不希望有的藻类的生长速率会超过所需藻类的生长速率。
在此使用MgCl2·6H2O代替通常使用的MgSO4·7H2O。其取代MgSO4·7H2O作为镁的来源，也会抑制细胞的***，而因为不含硫酸根，其不影响胞质蛋白、氨基酸和叶绿素的合成。也就是说，MgCl2·6H2O提供镁，但不提供硫酸根，因此各个细胞内的碳氢化合物不作为能量来源，从而造成淀粉含量的增加。特别地，其优选含量是大约4.0-8.0重量％。
Na2CO3(碳酸钠)在穿越细胞膜的抽吸作用(pumping action)中也起重要作用，且作为碳的来源，因此是构成培养基组分的必需元素。优选含量是大约1.0-2.0重量％，其过量可能会造成氢离子浓度的改变，从而导致坏死。
CaCl2(氯化钙)是钙的主要来源，其涉及通过细胞膜的代谢以及膜酶的活性，因此是构成培养基组分的必需元素。优选含量是大约1.0-2.0重量％。然而，如果含量太低，能量代谢的效率或膜酶的活性可能会降低。如果含量太高，则会积聚在细胞内并造成细胞老化。
乙二胺四乙酸(EDTA)结合天然水或人工水中的金属离子，以提供其用于细胞的新陈代谢。然而，其过量对细胞代谢和细胞壁有害，并使金属离子，例如矿物质的效果变差。因此，优选含量为大约1.0-4.0重量％。
柠檬酸作为培养基组成中的碳来源是的有条件的元素(conditionalelement)，但是对于培养绿藻是必需的。其优选的含量是大约0.3-0.5重量％，然而，其过量会造成改变培养基pH的问题。
Na2SiO3·9H2O(九水偏硅酸钠)是硅的来源，且可以以大约0.3-0.6重量％的量来使用。如果没有包括该成分，另外可选地可以用大约0.3-0.6重量％的相同含量的柠檬酸铁作为铁来源。
除了以上的培养基组成外，还可以包括一种或多种选自H3BO3(硼酸)、MnCl2·4H2O(四水氯化锰)、ZnSO4·7H2O(七水硫酸锌)、Na2MoO4·2H2O(二水钼酸钠)、CuSO4·5H2O(五水硫酸铜)和Co(NO3)2·6H2O(六水硝酸钴)的水合物，且优选含量为大约0.01-0.5重量％。
本发明还进一步涉及使用以上培养基来培养微藻类的方法。具体地，微藻类可以在大约33-37℃和大约770-790μmol/(m2S-1)的日间条件以及大约13-17℃和大约13-17μmol/(m2S-1)的夜间条件下进行培养。特别地，微藻类可以是微藻类小球藻。
实施例
在下文中，本发明将结合实施例进行详细说明。然而，无意于将本发明的范围限制于这些实施例。
实施例
使用小球藻Chlorella vulgaris Beijerinck(韩国海洋微藻类培养中心(Korean Marine Microalgae Culture Center)，FC-015)。将其在日间光照强度为780μmol/(m2S-1)、夜间光照强度为15μmol/(m2S-1)的条件下进行培养，且温度保持在日间温度大约35℃，夜间温度大约15℃。
培养基根据下列表1中的组成进行制备。
[表1]
  重量％   实施例1   实施例2   比较例1   比较例2   比较例3
  NaNO3   86.8   87.3   86.8   87.3   85.3
  K2HPO4   2.0   2.0   2.0   2.0   2.0
  MgCl2·6H2O   4.5   4   -   -   -
  MgSO4·7H2O   -   -   4.5   4   6
  Na2CO3   1.3   1.3   1.3   1.3   1.3
  CaCl2   1.8   1.8   1.8   1.8   1.8
  EDTA   2.5   2.5   2.5   2.5   2.5
  柠檬酸   0.5   0.5   0.5   0.5   0.5
  Na2SiO3·9H2O   0.5   0.5   0.5   0.5   0.5
  H3BO3   0.1   0.1   0.1   0.1   0.1
测试例
用实施例所示的方法培养30小时后，以下列方式测定干重和淀粉含量。结果显示在下列表2中。
[分析方法]
①干重的分析
取大约5cc的培养基，用蒸馏水进行洗涤，之后进行离心。接下来，将得到的物质置于100℃下干燥12小时，然后测定其重量。
淀粉含量的测定
取大约5cc经培养的微藻类并离心。接下来，将微藻类在-20℃下冷冻，然后将其磨成细粉。将其与5倍的80体积％的乙醇混合，然后萃取出色素。然后，将30体积％的高氯酸加到残余物中，进行混合并离心。重复该萃取过程，直到共得到10cc萃取物。取其中的0.5cc，并与蒽酮溶液(2g蒽酮溶于1L 72体积％的硫酸中)混合，并在100℃的水浴中停留10分钟。等温度降到室温时，用UV-VIS分光光度计测定625nm下的吸光度。生成葡萄糖校正曲线。
[表2]
如结果所示，培养30小时之后，比较例在干重(％)中存在有大约16％的淀粉含量，但是实施例则有大约60重量％，这表明在实施例中细胞的最终数目中的总淀粉含量是比较例的两倍或更多。
发明效果
本发明的培养基可以用于培养具有高淀粉含量的微藻类，因此可以用低成本制备生物质材料，从而提供费用低廉的选择。因此，可以用得自于生物质的材料来替代传统的基于石油的聚丙烯材料，其可以应用于汽车内部和外部材料。因此，考虑到近来油价走高的趋势，可以减小对以石油为基础的产品的依赖，而且用于内部和外部材料的制造成本也可以大大减少。
已经参考本发明中的优选实施方式对本发明进行了详细说明。然而，本领域的技术人员应该意识到可以对这些实施方式进行改变而不脱离本发明的原理和精神，本发明的范围由所附的权利要求及其等同方式限定。

Claims (7)

1.一种用于培养微藻类的培养基，其包括NaNO3、K2HPO4、MgCl2·6H2O、Na2CO3、CaCl2、乙二胺四乙酸、柠檬酸和Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。
2.如权利要求1所述的培养基，其中所述培养基包括80-90重量％的NaNO3、2.0-3.0重量％的K2HPO4、4.0-8.0重量％的MgCl2·6H2O、1.0-2.0重量％的Na2CO3、1.0-2.0重量％的CaCl2、1.0-4.0重量％的乙二胺四乙酸、0.3-0.5重量％的柠檬酸和0.3-0.6重量％的Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。
3.如权利要求1所述的培养基，其中所述培养基还包括0.01-0.5重量％的一种或更多种选自H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O和Co(NO3)2·6H2O的水合物。
4.一种使用培养基培养微藻类的方法，包括：
使用含有NaNO3、K2HPO4、MgCl2·6H2O、Na2CO3、CaCl2、乙二胺四乙酸、柠檬酸和Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁的培养基来培养微藻类。
5.如权利要求4所述的方法，还包括在33-37℃和770-790μmol/(m2S-1)的日间条件以及13-17℃和13-17μmol/(m2S-1)的夜间条件下培养微藻类。
6.如权利要求4所述的方法，其中所述培养基还包括80-90重量％的NaNO3、2.0-3.0重量％的K2HPO4、4.0-8.0重量％的MgCl2·6H2O、1.0-2.0重量％的Na2CO3、1.0-2.0重量％的CaCl2、1.0-4.0重量％的乙二胺四乙酸、0.3-0.5重量％的柠檬酸和0.3-0.6重量％的Na2SiO3·9H2O或柠檬酸铁。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述培养基还包括0.01-0.5重量％的一种或更多种选自H3BO3、MnCl2·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O和Co(NO3)2·6H2O的水合物。
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