CN101173215A - 用于小球藻异养培养的低磷培养基 - Google Patents

用于小球藻异养培养的低磷培养基 Download PDF

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曲春波
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Abstract

本发明涉及一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，属生物技术领域。本发明组份及其浓度含量(mg/l)：Glucose·H2O 5000－50000，KH2PO4 10－1000，KNO3 300－7500，MgSO4·7H2O 1000－1250，EDTA 500－625，H3BO3 114.2－142.75，CaCl2·2H2O 111－138.75，FeSO4·7H2O 49.8－62.25，ZnSO4·7H2O 88.2－110.25，MnCl2·4H2O 14.2－17.75，MoO3 7.1－8.875，CuSO4·5H2O 15.7－19.625，Co(NO3)2·6H2O 4.9－6.125。在小球藻培养中应用本发明提供的低磷培养基，KH2PO4的用量仅为原Basal配方的1.6％－16％，但小球藻培养的接种量、比生长速率、生物量产量、生物量对葡萄糖转化率、生长趋势、培养时间达到原Basal培养的相当水平。

Description

用于小球藻异养培养的低磷培养基
技术领域
本发明涉及的是一种生物工程技术领域微藻培养基，具体是一种小球藻异养培养的低磷培养基。
背景技术
小球藻是一种单细胞微藻，含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、维生素和小球藻生长因子等多种营养及活性成份，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力和预防心血管疾病等生理功能。小球藻的培养目前以开放式光照自养培养方式为主，其缺点是占地面积大、受自然条件和季节气候的影响和限制、产量质量难以维持稳定、生长速度慢、生物量低(在小球藻自养培养中，细胞浓度通常为200-600mg细胞干重/l)、易受到异种生物的污染或吞食而造成培养的失败、小球藻的收获成本较高等。与自养培养方式相比，异养培养方式具有以下优点：不受环境和气候等条件的限制；可保持纯培养，保证产品质量的稳定和均一性；能够获得较高的细胞浓度和生产效率，降低生产成本；可借鉴和利用比较成熟的工业发酵技术和生产设备等，因而近年来日益受到国内外学者的关注。
磷是细胞生长所必需的营养元素，与细胞的ATP、核酸以及其它细胞组份的合成密切相关，因而是培养基中的重要组分。但长时间以来，关于小球藻对磷的吸收利用，尤其是异养培养条件下小球藻对磷的吸收利用报道很少。
Basal培养基自1958年以来被广泛应用于培养微藻，但研究结果显示，在绝大多数培养条件下，该培养基中的磷浓度均远高于小球藻生长所需。例如，研究结果表明，在10g起始葡萄糖/l浓度下，Basal培养基中的PO4 3--P浓度为小球藻异养生长实际需求量的6.25-62.5倍，造成培养结束后培养基中的磷残留。较高浓度的磷残留不仅是一种资源浪费，而且可能造成湖泊及其它天然水体的富营养化。因此，确定培养基中合适的磷浓度范围，不仅可以降低生产成本，而且可以有效减少排放废水中的磷含量，减轻废水处理压力，利于环境保护。
目前关于小球藻异养培养的培养基研究主要集中在碳和氮方面，而关于小球藻对磷元素吸收利用的研究则多在自养条件下进行，包括小球藻对废水中磷的去除、对磷的超量吸收、氮磷比对小球藻生长的影响等。
经对现有技术的文献检索发现，史贤明等在《Process Biochemistry》(生物化学进展，1999；34：341-347)上发表的《Production of biomass and luteinby Chlorella protothecoides at various glucose concentrations inheterotrophic cultures(不同葡萄糖浓度下异养培养原壳小球藻生物量和叶黄素的生产)》一文，文中提出在异养培养条件下，培养基中不同葡萄糖浓度对小球藻生物量和叶黄素产量的影响，具体技术内容为：葡萄糖浓度在10，20，30，40，50，60，70，80和100g/l的摇瓶培养条件下，10和40g/l的发酵罐培养条件下，其对小球藻生物量和叶黄素产量的影响，并给出了适合的动力学模型。其不足在于：(1)未研究异养培养条件下小球藻对磷的吸收特性，和碳磷比值对小球藻生长和生物量的影响；(2)按照文中给出的技术方案，Basal培养基中的磷含量严重过量，培养结束后在培养基中残留较高浓度的磷，造成资源浪费和环境污染。
发明内容
本发明的目的在于改进现有技术的不足，提供一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，使其用于小球藻异养培养，相对原Basal培养基，在不降低小球藻异养培养产量水平的前提下，减少了磷用量，可直接降低生产成本、减少污染源。
本发明是通过以下技术方案实现的，在Basal培养基的基础上，依据小球藻生长消耗的碳磷、碳氮比值，参照Basal培养基，小球藻异养培养的低磷培养基组份及其浓度含量(mg/l)：Glucose·H2O 5000-50000，KH2PO4 10-1000，KNO3300-7500，MgSO4·7H2O 1000-1250，EDTA 500-625，H3BO3 114.2-142.75，CaCl2·2H2O 111-138.75，FeSO4·7H2O 49.8-62.25，ZnSO4·7H2O 88.2-110.25，MnCl2·4H2O 14.2-17.75，MoO3 7.1-8.875，CuSO4·5H2O 15.7-19.625，Co(NO3)2·6H2O 4.9-6.125。
根据上述的组份及组份浓度，准确称量培养基各组份，用水溶解定容，调节pH到6.1-6.5，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下，即获得用于小球藻异养培养的低磷培养基产品。
本发明用自来水，或自来水和啤酒废水按一定比例配合溶解使用。
本发明的基本原理是根据小球藻培养过程中所消耗的碳磷、碳氮比值，按物质摩尔比计算，碳磷比值为206/1-2060/1，碳氮比值为20/1-51/1，通过以上方案调整配方组份含量，降低培养基中磷、氮含量，以达到在不降低小球藻异养培养产量水平的前提下，消除培养结束后培养液中的磷残留，减少污染源和对环境危害，直接降低生产原料投入，提高生产效益。
与现有技术相比，在小球藻培养中应用本发明提供的低磷培养基，KH2PO4的用量仅为原Basal配方的1.6％-16％，但小球藻培养的接种量、比生长速率、生物量产量、生物量对葡萄糖转化率、生长趋势、培养时间达到原Basal培养的相当水平，经济和环保效益显著，体现了小球藻的生态化生产。
附图说明
图15g起始葡萄糖/l，2.28mg起始磷酸根磷/l，19-l发酵罐中进行的小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中：□，生物量；△，葡萄糖；×，磷酸根磷。
图2 10g起始葡萄糖/l，22.8mg起始磷酸根磷/l，19-l发酵罐中进行的小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中：□，生物量；△，葡萄糖；×，磷酸根磷。
图3 40g起始葡萄糖/l，22.8mg起始磷酸根磷/l，19-l发酵罐中进行的小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中：□，生物量；△，葡萄糖；×，磷酸根磷。
图4 50g起始葡萄糖/l，228mg起始磷酸根磷/l，19-l发酵罐中进行的小球藻异养分批培养试验的曲线示意图。
其中：□，生物量；△，葡萄糖；×，磷酸根磷。
图5 10g起始葡萄糖/l，4.56mg起始磷酸根磷/l，19-l发酵罐中进行的小球藻异养流加培养试验的曲线示意图。
其中：□，生物量；△，葡萄糖；×，磷酸根磷。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下列实施例中未注明的具体实验方法，通常按照常规条件，例如生化实验方法和技术(高等教育出版社，1997)，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 5000，KH2PO4 10，KNO3 300，MgSO4·7H2O 1000，EDTA 500，H3BO3 114.2，CaCl2·2H2O 111，FeSO4·7H2O49.8，ZnSO4·7H2O 88.2，MnCl2·4H2O 14.2，MoO3 7.1，GuSO4·5H2O 15.7，Co(NO3)2·6H2O4.9。
用于19-l发酵罐小球藻异养分批培养，培养基用自来水溶解配制，装量12l，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量8％(v/v)，pH6.5，温度28℃，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50％。
5g起始葡萄糖/l，2.28mg起始磷酸根磷/l，小球藻生长迅速，最大细胞浓度为2.6g/l，说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中PO4 3--P基本耗尽(图1)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施低浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例2：
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 10000，KH2PO4 100，KNO3 1250，MgSO4·7H2O 1000，EDTA 500，H3BO3 114.2，CaCl2·2H2O 111，FeSO4·7H2O49.8，ZnSO4·7H2O 88.2，MnCl2·4H2O 14.2，MoO3 7.1，CuSO4·5H2O 15.7，Co(NO3)2·6H2O4.9。
用于19-l发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12l，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量10％(v/v)，pH6.5，温度28℃，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50％。
培养至48小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为5.5g/l，说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中PO4 3--P基本耗尽(图2)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施中浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例3：
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 40000，KH2PO4 100，KNO3 5000，MgSO4·7H2O 1000，EDTA 500，H3BO3 114.2，CaCl2·2H2O 111，FeSO4·7H2O49.8，ZnSO4·7H2O 88.2，MnCl2·4H2O 14.2，MoO3 7.1，CuSO4·5H2O 15.7，Co(NO3)2·6H2O4.9。
用于19-l发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12l，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量10％(v/v)，pH6.5，温度28℃，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50％。
培养至84小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为21g/l，说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中PO4 3--P基本耗尽(图3)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施高浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例4：
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 50000，KH2PO4 1000，KNO3 7500，MgSO4·7H2O 1250，EDTA 625，H3BO3 142.75，CaCl2·2H2O 138.75，FeSO4·7H2O 62.25，ZnSO4·7H2O 110.25，MnCl2·4H2O 17.75，MoO3 8.875，CuSO4·5H2O19.625，Co(NO3)2·6H2O 6.125。
用于19-l发酵罐小球藻分批异养培养，培养基用自来水溶解配制，装量12l，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量10％(v/v)，pH6.5，温度28℃，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50％。
培养至95小时左右，小球藻细胞浓度达到最大值，最大细胞浓度为26g/l，说明培养基中的磷浓度满足其生长所需，且培养基中PO4 3--P基本耗尽(图4)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施高浓度碳的发酵罐分批培养。
实施例5：
小球藻流加培养的前期低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 10000，KH2PO420，KNO3 1000，MgSO4·7H20 1000，EDTA 500，H3BO3 114.2，CaCl2·2H2O 111，FeSO4·7H2O 49.8，ZnSO4·7H2O 88.2，MnCl2·4H2O 14.2，MoO3 7.1，CuSO4·5H2O15.7，Co(NO3)2·6H2O 4.9。
用于19-l发酵罐小球藻流加培养的前期，培养基用自来水溶解配制，装量12l，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量10％(v/v)，pH6.5，温度28℃，搅拌速度与培养液氧饱和浓度相关联，控制氧饱和浓度大于50％。
补料培养液配方(mg/l)：Glucose·H2O 417000，KH2PO4 834(PO4 3--P190)，KNO3 52125，MgSO4·7H2O 41700，EDTA 20850，H3BO3 4762.14，CaCl2·2H2O 4628.7，FeSO4·7H2O 2076.66，ZnSO4·7H2O 3677.94，MnCl2·4H2O 592.14，MoO3 296.07，CuSO4·5H2O 654.69，Co(NO3)2·6H2O 204.33。用自来水溶解配制，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下待用。
补料方案为：0-31.5h，0 l/24h，31.5-55.5h，0.29 l/24h，55.5-79.5h，1.13 l/24h；79.5-127.5h，1.54 l/24h。
培养结束后小球藻最大细胞浓度达到70g/l左右，说明培养基中的磷浓度能满足其生长所需，且培养基中PO4 3--P基本耗尽(图5)，结果证明应用本发明的培养基，可成功实施小球藻高浓度流加培养。
实施例6：
某啤酒公司一段工序废水：CODcr：5020mg/l BOD5：1976mg/l NO3 1--N：18mg/l PO4 3--P：10mg/l。
小球藻异养培养的低磷培养基配方(mg/l)：Glucose·H2O 10000，KH2PO420，KNO3 300，MgSO4·7H2O 1000，EDTA 500，H3BO3 114.2，CaCl2·2H2O 111，FeSO4·7H2O49.8，ZnSO4·7H2O 88.2，MnCl2·4H2O 14.2，MoO3 7.1，CuSO4·5H2O 15.7，Co(NO3)2·6H2O4.9。
培养基用啤酒废水溶解，用250ml锥形瓶，装量100ml，初始pH为6.1，121℃灭菌20分钟，冷却到30℃以下。培养条件：接种量8％(v/v)，28℃，180rpm，无光培养。
用啤酒废水代替自来水进行小球藻的异养培养，能得到相同的培养产量，且最终排放废水中的BOD、氮、磷都有很大程度(80％以上)的降低。结果证明应用本发明的培养基，利用啤酒废水部分代替自来水进行小球藻异养培养是可行的。
在上述培养基配方中，用本发明低磷培养基进行小球藻异养培养，相对原Basal培养基，在不降低小球藻异养培养产量水平的前提下，减少了磷用量，提高了经济效益。

Claims (3)

1.一种用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征在于，组份及其浓度含量mg/l：Glucose·H2O 5000-50000，KH2PO4 10-1000，KNO3 300-7500，MgSO4·7H2O1000-1250，EDTA 500-625，H3BO3 114.2-142.75，CaCl2·2H2O 111-138.75，FeSO4·7H2O 49.8-62.25，ZnSO4·7H2O 88.2-110.25，MnCl2·4H2O 14.2-17.75，MoO3 7.1-8.875，CuSO4·5H2O 15.7-19.625，Co(NO3)2·6H2O 4.9-6.125。
2.根据权利要求1所述的用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征是，所述的培养基，按物质摩尔比计算，碳磷比为206/1-2060/1，碳氮比为20/1-51/1。
3.根据权利要求1所述的用于小球藻异养培养的低磷培养基，其特征是，所述培养基用自来水，或自来水和啤酒废水配合溶解。
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