CN102732472A - 表达猪肺炎支原体p65蛋白的减毒猪霍乱沙门氏菌的构建与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白的重组减毒猪霍乱沙门氏菌株的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一株不含抗性标记表达猪肺炎支原体p65蛋白的减毒猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)，其保藏号为CCTCC NO：M2011107该减毒株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长所必需的asd基因，含有能在该菌株中表达asd基因和猪肺炎支原体p65基因的质粒。本发明还公开了利用该减毒株制备猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体疫苗，制备方法与应用。本发明制备的二价疫苗可刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体的免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体的感染。

Description

表达猪肺炎支原体p65蛋白的减毒猪霍乱沙门氏菌的构建与应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪肺炎支原体膜蛋白p65基因的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株及应用。

背景技术

沙门氏菌作为活疫苗载体能够携带多种细菌、病毒或寄生虫的免疫原性基因，从而成为沙门氏菌病和其它疾病的多价重组基因工程活疫苗。近几十年来，以减毒沙门氏菌作为活疫苗表达载体的研究受到广泛的关注。其中，利用基因工程方法致弱的沙门氏菌作为活细菌载体来表达外源基因，已广泛应用于肿瘤、病毒病、细菌病以及寄生虫病等的疫苗研究。

沙门氏菌作为疫苗载体已经受到医学与兽医学的广泛重视。其主要优点是沙门氏菌可采用口服或滴鼻等粘膜途径进行免疫，操作方便，对接种对象的刺激小，同时能够将质粒DNA特异性地传递入巨噬细胞、树突状细胞等抗原递呈细胞，从而有效激发相应的体液与细胞免疫应答^[1]。此外，沙门氏菌为胞内寄生菌，其在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时，诱导产生针对外源蛋白的特异性体液与细胞免疫反应，并同时诱导粘膜免疫与全身免疫。因此，减毒沙门氏菌既可以作为针对同源抗原的活疫苗，也可以作为诱导针对其他病原微生物产生保护性反应DNA疫苗的载体^[2]。鉴于此，以减毒沙门氏菌作为粘膜免疫用的基因工程活疫苗表达载体具有无可比拟的优越性。另外，沙门氏菌载体本身具有免疫佐剂的作用^[3]，其LPS作为一种内在佐剂，可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。

减毒沙门氏菌保留侵袭力，可穿过粘膜组织，侵入粘膜局部相关***和脾、肝、肾等处的淋巴组织，并在侵入部位表达外源抗原，从而不仅局部粘膜产生SIgA，也激发全身性的体液和细胞免疫。以减毒沙门氏菌为载体进行粘膜免疫，是一种继传统的灭活与减毒疫苗后新的免疫方式，它能呈递多种抗原，在多处粘膜产生免疫作用，并引发全身性的体液和细胞免疫。与其它活疫苗载体相比，致弱沙门氏菌载体还具有培养简便、繁殖迅速、制备和使用方便、免疫原性强、经济等优点。重组胞内寄生菌经口服或注射免疫后，可通过细菌感染的方式将质粒DNA直接导入诸如巨噬细胞、树突状细胞等专职递呈细胞，被运送至相关粘膜和淋巴组织，诱导细胞免疫和体液免疫反应^[4]，同时获得对载体菌的免疫。减毒沙门氏菌经口服途径免疫小鼠，不仅安全、高效，而且可激发产生黏膜反应，对同源病原和异源病原均表现出良好的保护力^[5]。

猪霍乱沙门氏菌C500是在含醋酸铊的培养基中传500代后致弱的具有良好免疫原性的菌株，实践也证明C500株具有免疫原性好，能激活全身、局部和远端粘膜免疫***的免疫作用，且有副作用低，安全性好的特点^[6]。其中，效果最稳定应用最多的是沙门氏菌Asd+平衡致死***。华中农业大学农业微生物学国家重点实验室徐引弟等构建C500株的asd基因缺失株ΔasdC500，经实验证实ΔasdC500缺失株进一步降低了C500的毒力，增强了疫苗的安全性。

猪支原体肺炎又称猪喘气病或猪地方流行性肺炎，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或者大理石样病变。

猪肺炎支原体是猪呼吸道疾病综合征的重要病原之一，可继发感染PRRSV、PCV2等，从而导致多种疫苗的接种失败。猪肺炎支原体可经空气传播，此外还易与其他细菌性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发，对养猪业造成重大的经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。这主要是因为猪肺炎支原体能够穿透黏膜层与纤毛粘在一起，破坏纤毛的完整性，并分泌一些有害因子，从而改变纤毛的游走性，致使纤毛大量脱落，这为其它细菌和病毒的入侵创造了条件，致使损失加剧。

猪肺炎支原体能在猪肺中长期滞留，治疗效果不佳，虽然该病引起的死亡率不高，但是流行的广泛性所造成的经济损失仍然是巨大的。据报道，猪肺炎支原体表面具有纤毛黏附因子，其感染猪的呼吸道后，能与黏膜上皮细胞纤维发生特异性结合，使猪肺炎支原体能够附殖并造成致病性。Raznis(1983)研究发现，猪肺炎支原体的致病力及免疫原性都与其细胞膜上的膜蛋白有关。Gear S J等(1985)从猪肺炎支原体菌株VPPll的细胞膜中分离得到了一种致病蛋白因子，发现其具有明显的免疫原性，并证实细胞膜蛋白是导致猪患猪支原体肺炎的主要因素。Jody L W后来也证实这一点。衣阿华大学Ross研究发现，猪肺炎支原体感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其它病原体更容易侵入。

对标准菌株和野外分离菌株的抗原分析表明，支原体肺炎含有几种主要免疫原：即胞内具LDH活性的蛋白(p36)，3种膜蛋白(p46、p65和p70)和粘附素(p97)。这些蛋白在急性或者初次感染肺炎支原体后，可刺激产生早期和特异抗体。

M F Kim等研究发现，p65蛋白是猪肺炎支原体的一个重要的免疫原，它的碳端是其主要的抗原区^[7]。P65蛋白是一种解脂酶(lipoiytic enzyme)，是猪肺炎支原体主要的具免疫原性的表面蛋白即膜蛋白之一^[8]，其功能可能是损害肺组织中表面活性剂，即一种由脂蛋白组成的物质，是由肺部的肺泡细胞分泌的，可以通过减小肺部表面的液体表面张力来维持肺组织的稳定性^[9]，还可以触发急性或首次感染猪肺炎支原体的断奶仔猪及生长猪的早期免疫应答。P65蛋白序列中也有1个TGA密码子，需要进行定点突变才能在大肠杆菌中表达。K.Cheikh Saad Bouh等将p46基因和p65基因克隆到载体上，并在大肠杆菌中对其进行原核表达，收获表达产物并对其进行复性后免疫BALB/c小鼠，从而获得相应的单克隆抗体，并对该单克隆抗体进行了交叉反应的研究，结果显示该蛋白具有很高的种间保守性和特异性^[10]。

传统上，一般用抗生素对其进行控制。然而，随着耐药株的普遍增多，猪再次感染肺炎支原体的几率也就增加。因此，除了使用抗生素和采用良好的动物管理程序，通过疫苗来防治猪支原体肺炎也是必要的。但由于早期检测的困难和缺乏有效的药物，猪支原体肺炎在控制方面至今未达到令人满意的效果。

目前，国内外预防猪支原体肺炎的疫苗主要是弱毒苗、灭活苗以及基因工程疫苗。然而进口的灭活苗成本较高，国内的弱毒疫苗虽然免疫效果较好，但需要进行胸腔接种，操作不方便，并且对已发病的猪群不能注射该疫苗，而近年来兴起的基因工程疫苗大都处于实验室研究阶段，尚未在临床得以广泛使用。

黏膜免疫***在抗原刺激后可产生黏膜免疫应答和体液免疫应答，而灭活疫苗免疫只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜免疫***，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内。由于黏膜表面与外界抗原直接接触，是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线，且绝大部分机体感染的主要途径是消化道、呼吸道等黏膜***，因而黏膜免疫在抵抗感染方面具有极其重要的作用。目前使用的黏膜免疫的疫苗中饮水的疫苗容易被消化道降解，抗原的吸收效率低，滴在鼻腔内半清除时间仅15min，致使疫苗不能有效进入机体激发有效的黏膜免疫，寻求高效的黏膜免疫疫苗已成为目前疫苗研究的热点。鉴于减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有运送效率高，免疫方法简单，免疫效果较好，能同时激发全身免疫和局部粘膜免疫等优点，有着良好的应用前景。

1990年翁仲男研究表明，猪支原体肺炎疫苗经肠道免疫后，受抗原刺激所产生的抗体可经循环***移至呼吸道，证实消化道与呼吸道之间的黏膜免疫机制是相通的。因此，猪支原体肺炎基因工程活疫苗采用口服方式刺激肠道免疫产生的抗体可通过黏膜移至呼吸道，从而抵御呼吸道疾病病原入侵，起到预防保护作用。因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。

重组沙门氏菌活疫苗自然感染或试验感染，诱导抗任何异源血清型沙门氏菌保护的同时，沙门氏菌因侵入淋巴***，能够更有效地激发宿主产生针对异源抗原的体液和细胞免疫反应。这样，重组弱毒活疫苗也许是解决当前猪支原体肺炎商品化疫苗不足之处的一种可行方法。构建重组沙门氏菌株的传统方法存在很多缺陷；如以前普遍采用携带抗性基因的表达质粒，因存在生物安全问题而不被人们所接受。asd质粒载体平衡致死***具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化以及无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达猪支原体肺炎主要免疫原性膜蛋白的重组活疫苗具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪肺炎支原体的主要免疫原性膜蛋白-p65蛋白的重组减毒猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)，该重组菌株p65蛋白基因中一个编码色氨酸的TGA密码子已定点突变为TGG，以便于该蛋白的原核表达。

本发明的第二个目的是利用上述猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)获得一种以减毒猪霍乱沙门氏菌制备的猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎二价基因工程活疫苗。

本发明的第三个目的是上述的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)在制备猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎二价基因工程活疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过基因工程的方法，获得一株表达猪支原体肺炎主要免疫原性膜蛋白-p65蛋白的重组减毒的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C500(pYA-65)，于2011年4月2日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2011107。

申请人提供了一种重组减毒的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的制备方法，它包括下列步骤：

1)构建重组质粒pGEX-65：用一对引物扩增猪肺炎支原体膜蛋白-p65蛋白的基因片断，将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG，构建重组质粒pGEX-65。所用引物对核苷酸序列如下所示：

正向引物：AAAGGATCCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)；

2)利用一对引物将猪肺炎支原体的p65蛋白基因片断633bp处的碱基A定点突变为碱基G，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5′→3′)，

反向引物：CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5′→3′)；

3)构建重组质粒pYA-65：将上述突变正确的p65基因片段以重组质粒pGEX-65为模板，用一对引物进行扩增并回收，酶切后连接质粒pYA3493，转化x7213筛选阳性克隆，所得的阳性质粒电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株，从而得到保藏编号为CCTCC NO：M2011107的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)。所用引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：AAAGTCGACCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)。

申请人获得一种能原核表达猪支原体肺炎主要免疫原性膜蛋白p65蛋白的基因片段，将其序列中633bp的碱基A定点突变为G，p65蛋白的基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

申请人利用所述重组减毒的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的菌液和明胶成功制备一种防治猪霍乱沙门氏菌和猪肺炎支原体二价基因工程疫苗。

上述的不含抗性标记表达猪肺炎支原体主要免疫原膜蛋白-p65蛋白的重组减毒的猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(GenBank号AE008863)(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能够正常生长和繁殖)，同时该重组菌株含有外源质粒pYA-65(含有asd基因)。猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-65能在该重组菌株中表达asd基因，且含有能够原核表达的猪肺炎支原体p65蛋白的基因(本发明命名为p65基因)。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成的相关成份，而p65蛋白的基因表达产物提供了良好的针对猪肺炎支原体的免疫原性。

本发明的不含抗性标记表达猪肺炎支原体主要免疫原膜蛋白-p65蛋白的重组减毒的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500。本发明的重组减毒的猪霍乱沙门氏菌株C500(pYA-65)，缺失了C500菌株基因组中的asd基因，同时添加了含有能原核表达的猪肺炎支原体p65蛋白基因的质粒pYA-65。由于质粒pYA-65的存在C500(pYA-65)才能存活，也就大大提高了质粒pYA-65(也就是p65蛋白的基因)在重组菌株中的稳定性。P65蛋白的基因在猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)中的稳定表达，使之具有针对猪肺炎支原体的免疫保护力。

本发明的基本构建方法是：利用本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室构建的asd基因缺失的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500Δcrp/Δasd缺失株(参见文献：徐引弟等，猪霍乱沙门氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体***的构建及鉴定.生物工程学报，2006，5(3)：366-371.)构建含有能够原核表达的猪肺炎支原体p65蛋白基因的质粒pYA-65。将质粒pYA-65转入asd基因缺失株C500，由于生长的需要质粒pYA-65与asd基因缺失株C500互补而稳定共存，形成我们发明的不含抗性标记的能表达猪肺炎支原体p65蛋白的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)。通过大量的生物学实验数据证明，本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎的二价基因工程疫苗。

本发明的主要优点是：

1、本发明的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)表达的猪肺炎支原体p65蛋白，具有良好的免疫保护性。由于猪支原体肺炎危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪支原体肺炎疫苗(主要是弱毒苗)存在胸腔接种难操作，副反应大等缺陷。因此，用该基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2、本发明的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。

3、本发明的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)可同时提供针对猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎两种病原的保护力。

4、本发明的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

更详细的技术方案见实施例所述。

附图说明

序列表SEQ IDNO：1是本发明克隆的猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p65的基因片段，序列全长为1803bp，存在一个A633-G633的人工碱基突变。

序列表SEQ ID NO：2是猪肺炎支原体免疫原性膜蛋白p65的基因片段编码的氨基酸序列，编码600个氨基酸。

图1：本发明制备猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的技术流程图。

图2：是本发明制备的能够原核表达的p65基因片段的流程图。

图3：是本发明制备的p65基因A633突变G633PCR鉴定图。

图4：是本发明制备的p65基因A633突变G633酶切鉴定图。

图5：是本发明制备的能够原核表达的p65基因的BLAST图。

图6：是本发明制备重组质粒pYA-65的PCR鉴定的电泳图片。

图中M1：DNA Marker(DL2000)1：pYA-65

图7：是本发明制备重组质粒pYA-65的酶切鉴定结果电泳图。

图中MI：DNAMarker(DL15000)1：pYA-65(SaII/HindIII)

图8：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的构建流程图。

图9：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的PCR鉴定图。

图中M1：DNA Marker(DL15000)1：C500(pYA-65)

图10：是用Western-blot检测C500(pYA-65)中Cpro-65的分泌表达。

图中M：Prestained Protein Ladder  1：融合表达蛋白Cpro-65

图11：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的生长曲线图。

图12：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)遗传稳定性结果。

图中M：DNA marker(DL 2000)1-10∶1-50代重组菌株-：C500(pYA3493)对照；

图13：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)免疫小鼠血清中抗猪肺炎支原体IgG抗体水平。

图14：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)免疫小鼠后所诱导的细胞免疫水平的分析结果。

图15：是本发明克隆的猪肺炎支原体免疫原膜蛋白p65基因片段。括号内显示的是突变的碱基的位置。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。本发明的技术流程如图1所示。

实施例1制备能够原核表达的猪肺炎支原体p65蛋白的基因片段

猪肺炎支原体p65蛋白基因片段的克隆方法见图2所示。

1、制备能够原核表达的p65基因片段所需的引物如表1所示。

表1制备能够原核表达的p65基因片段所需的引物

表1说明：引物下划线部分为酶切位点。

2、制备能够原核表达的p65基因片段

以猪支原体肺炎活疫苗(购自南京天邦生物科技有限公司，该活疫苗包含有猪肺炎支原体Mhp168株和佐剂)提取的基因组DNA(提取方法按照天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书操作)为模版，利用如表1所示的引物p65(BamH I)/p65(HindIII)PCR扩增p65基因片断，，扩增体系如下：

94℃预变性5min后，进行如下循环：94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸2min，扩30个循环，最后72℃10min。扩增完成后，取PCR产物8μL，加入1μL 10×Loading Buffer，用0.8％琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色，观察结果。电泳后参照BioFlux公司胶回收试剂盒说明书进行目的基因的纯化。将其克隆原核表达载体pGEX-KG(购自宝生物工程(大连)有限公司)，构建重组质粒pGEX-KG-65，并转化大肠杆菌DH5α。用表1所示的引物p65(a1)/p65(a2)同上体系和条件扩增重组质粒pGEX-KG-65，跑胶后利用胶回收试剂盒(购自美国BioFlux公司，按照该试剂盒的说明书操作)进行胶回收后，利用限制性内切酶Dpn I切除模板，回收后转化至大肠杆菌DH5d，挑取单菌落，经PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆，提取阳性克隆的质粒，转化大肠杆菌JM105，进行PCR和酶切鉴定并测序。原核表达的p65基因片段的制备流程如图2所示。PCR和酶切的鉴定结果如图3和图4所示；测序结果与p65原序列进行BLAST的结果如图5所示，由此可见，碱基A633已突变G633，得到能够原核表达的猪肺炎支原体的p65蛋白基因片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO：1和图15，图15所示序列的括号内为碱基突变位点)。

实施例2重组质粒pYA-65的构建与鉴定

1、构建重组质构建重组质粒pYA-65所需的引物

表2构建重组质粒pYA-65所需的引物

表2说明：引物下划线部分为酶切位点。

2、重组质粒pYA-65的构建与鉴定方法

由图8所示，以定点突变后能够原核表达猪肺炎支原体p65基因的质粒pGEX-KG-65为模板，用表2所示的引物p65(SaII)/p65(HindIII)进行PCR扩增并回收，将回收产物和穿梭质粒pYA3493(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)分别进行Sal I和HindIII双酶切，回收后连接，将连接产物电转化缺失asd基因的大肠杆菌x 7213(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)，筛选出阳性克隆，从而构建重组质粒pYA-65；提取pYA-65质粒进行PCR和酶切鉴定(见图6、7)，PCR体系和条件同实施例1。

实施例3表达Cpro-65融合蛋白的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的构建与鉴定

猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46)的构建方法如图8所示。将上述鉴定正确的重组质粒pYA-65电转化(参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200Ω)至asd基因缺失株的C500感受态细胞(参见文献：徐引弟等，猪霍乱沙门氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体***的构建及鉴定.生物工程学报，2006，5(3)：366-371.附关于向公众发放猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500ΔcrpΔasd缺失株的承诺证明1份)。猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的构建流程如图8所示。在DAP阴性平板上挑取单菌落并进行培养，用表2所示的引物p65(SalI)/p65(HindIII)进行PCR鉴定来筛选阳性克隆(见图9)；PCR体系和条件同实施例1。结果表明所获得的含有pYA-65质粒的重组减毒猪霍乱沙门氏菌构建是正确的，申请人将其命名为重组猪霍乱沙门氏菌株(Salmonella choleraesuis)C500(pYA-65)，于2011年4月2日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCCNO：M2011107。

实施例4表达Cpro-65融合蛋白的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的生物学特性

1、猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的表达特性分析

挑取猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的单菌落于TSB培养基中(购自美国BD公司)，37℃200r/min培养12h，4℃放置12h，按体积比1∶100的比例转接TSB液体培养基再培养6h，8000×g离心10min收集菌体，上清液经0.22μm滤膜过滤，加等体积冰冷20％三氯乙酸冰浴20min，12000r/min离心20min，沉淀用1mL无水乙醇洗涤，12000r/min离心5rnin，重复洗涤1次。将所得的蛋白用猪的抗猪肺炎支原体阳性血清(自行制备)作一抗，HRP标记羊抗猪IgG抗体(购自美国Southern Biotech公司)作为二抗，进行Western-blot鉴定(见图10)，结果显示本发明的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)能够分泌表达融合的蛋白，该融合蛋白能够与猪的猪支原体肺炎阳性血清抗体发生特异性反应。

2、猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的表型鉴定

分别将猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)、亲本来源菌株C500(购自北京中国兽医药监察所)以及CpYA(pYA3493)(来源于pYA3493(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠)电转化asd基因缺失株C500感受态细胞，制备过程同实施例3)划线接种于TSA平板，然后分别转接于***糖、半乳糖醇、甘露糖、麦芽糖、木糖、尿素、葡萄糖、乳糖、鼠李糖、蔗糖和硫化氢，进行生化反应。观察这些菌株能否利用这些碳源和硫化氢，从而判断重组菌株的表型是否变化。结果表明本发明猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)和CpYA(pYA3493)的生化特性与亲本菌株C500相一致：都能够利用甘露糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖为碳源，不能利用***糖、乳糖、蔗糖、尿素以及硫化氢，符合猪霍乱沙门氏菌的典型表型特征。

4、猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的生长特性分析

将猪霍乱沙门氏菌C46(pYA-65)接种到TSB培养基中，37℃培养过夜，以体积比为1∶100的比例转接TSB培养基，37℃200r/min培养，每隔1h取样测OD600，并绘出生长曲线。同样方法绘制亲本株C500、asd基因缺失株C500以及空质粒对照菌株CpYA(pYA3493)的生长曲线，比较他们的生长特性及快慢是否一致。从重组菌株的生长曲线(见图11)可以看出，重组菌株C500(pYA-65)、CpYA(pYA3493)以及亲本菌株C500的生长趋势一致，但猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的生长速度较CpYA和C500稍慢，C500^-则可能由于缺失asd基因增殖速度最慢。

5、猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的遗传稳定性

将猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)在TSA培养基(购自美国BD公司)平板上划线培养，挑取单菌落于TSB培养基中，37℃200r/min培养，按体积比1∶100的比例转接TSB液体培养基中培养12h，再次按体积比为1∶100的比例转接到TSB培养基中，连续进行50次转接。分别取含有相同CFU的第1、5、10、15、20、25、30、35、40、45以及50代的培养物为模板，用表2所示的引物p65(SalI)/p65(HindIII)进行PCR检测重组质粒在asd基因缺失株C500中的遗传稳定性。PCR的电泳结果(见图12)表明，每5代均能扩增出目的条带，其大小和亮度均没有差别，这说明猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)能够稳定遗传。实施例5利用猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)制备二价基因工程疫苗

将猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)在TSA固体培养基上进行培养后，挑取单菌落于TSB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到2.5×10¹⁰CFU/mL。将所得的C500(pYA-65)细菌液离心后按细菌液∶明胶保护剂(体积：体积)为2∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，于121℃高压灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用生理盐水溶解并进行活菌计数(CFU)，并且确保没有杂菌污染，置于-20℃保存备用，作为研制二价基因工程疫苗的疫苗菌株。

实施例6本发明的生物实验效果

将猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)以6×10⁸CFU/mL的浓度，通过肌注和口服三种免疫途径免疫6周龄雌性SPF级的BALB/c小白鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)。每隔2周免疫1次，共进行2次免疫。免疫剂量为200μL。检测免疫小鼠血清的猪肺炎支原体抗体以及IFN-γ和IL-4水平。猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)免疫小鼠后，可在血清中检测到抗p65蛋白的特异性IgG抗体，且肌注免疫的效果最好，与其他免疫组相比，差异显著(P＜0.05)。用纯化的p65抗原刺激免疫小鼠的脾细胞后分析结果显示：猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)肌注免疫组的IFN-γ和IL-4比口服免疫组均低一些，但与商品化疫苗相比，肌注免疫和口服免疫均要高，但差异不显著(P＞0.05)。血清中可检测到抗猪肺炎支原体特异性的IgG抗体，且口服免疫效果较好(见图13)。通过对IFN-γ和IL-4的检测来评价猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的细胞免疫水平，结果可见IFN-γ和IL-4水平均较高，且肌注免疫组的IFN-γ高于口服免疫组，而IL-4水平低于口服免疫组(见图14)。由此可见，本发明的二价疫苗免疫小鼠后产生了针对猪肺炎支原体的特异性抗体，说明该重组菌株能表达外源融合蛋白Cpro-46，具有免疫原性，且采用肌注方式效果最好。为了更加全面了解本发明猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-46)的免疫机制，特进行体液免疫和细胞免疫两个方面的监测。试验结果表明，本发明的二价基因工程疫苗在激活体液免疫的同时也激活了细胞免疫，且细胞免疫的效果尤为显著。

参考文献：

[1]Schoen C，Stritzker J，Goebel W，et al.Bacteria as DNA vaccine carriers for genetic immunization.Int J MedMicrobiol，2004，294：319-335

Fang X W.The Research of piglet Paratyphoid Attenuated Vaccine.Edition of Research.China Institute ofVeterinary Drug Control，1978：1-11.房晓文.仔猪副伤寒弱毒苗的研究.中国兽医药品监察所研究报告汇辑.1978：1-11.

[2]Helen L B，Kate F G，Steven M J，et al.Antibody responses to Yersinia pestis Flantigen expressed inSalmonella typhimurium aroA from in vivo-inducible promoters[J].Vaccine，2000，18：2668-2676

[3]Medina E，Guzman C A.Use of live bacterial vaccine vectors for antigen delivery：potential and limitations.Vaccine，2001，19(13-14)：1572-1580

[4]Dietrich G，Spreng S，Gentschev I et al.Bacterial systems for the delivery of eukaryotic antigen expressionvectors.Antisense Nucleic Acid Drug Dev，2000，10(5)：391-399.

[5]Bumann D，Hueck C，Aebischer T，et al.Recombinant live Salmonellas pp.for human vaccination againstheterologous pathogens[J].FEMS Immuology and Medical Microbiology，2000，27：357-364.

[6]Fang X W.The Research of Piglet Paratyphoid Attenuated Vaccine.Edition of Research.China Institute ofVeterinary Drug Control，1978：1-11.房晓文.仔猪副伤寒弱毒苗的研究.中国兽医药品监察所研究报告汇辑.1978：1-11

[7]Eileen L，Thacker DVM，Brad J，et al.Evaluation of local and systemic immune responses inducedbuintramuscular injection of a Mycoplasma hyopneumoniae bactterin to pigs[J].American Journal of VeterinaryResearch，2000，61(11)：1384-1389.

[8]Kim M.F，Heidari M.B，et al.Identification and mapping of an immunogenieregion of Mycoplasmahyopneumoniae P65 surface lipoprotein expressed in Escherichia coli from cloned genomic fragment.InfectImmun，1990，58：2637-2643.

[9]Jono A，Schmidt，Glenn F，et al.Mycoplasma hyopneumoniae p65 Surface Lipoprotein Is a Lipolytic Enzymewith a Preference for Shorter-Chain Fatty Acids[J].Journal of Bacteriology，2004，9(17)：5790-5798.

[10]Wise K.S.，Kim M.F.，Major membrane surface proteins of Mycoplasma hyopneumoniae selectivelymodified by coyalently bound lipid.J Bacteriol，1987，169(12)：546-555.

Claims (5)

1.一株表达猪肺炎支原体主要免疫原性膜蛋白-p65蛋白的减毒猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)C500(pYA-65)，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2011107。

2.一种减毒的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)的制备方法，它包括下列步骤：

1)构建重组质粒pGEX-65：用一对引物扩增猪肺炎支原体膜蛋白p65的基因片断，并将其亚克隆至原核表达载体pGEX-KG，构建重组质粒pGEX-65，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：AAAGGATCCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)；

2)利用一对引物将猪肺炎支原体的p65蛋白基因片断的633bp处的碱基A人工定点突变为碱基G，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：CCCTTGTAAATTGGCTTGTTAAA(5′→3′)，

反向引物：CCCCCAATTTACAATTTCATTAT(5′→3′)；

3)构建重组质粒pYA-65：以上述突变正确的重组质粒pGEX-65为模板，用一对引物进行PCR扩增，酶切后连接质粒pYA3493，转化x7213筛选阳性克隆，所得阳性质粒电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株，从而得到保藏编号为CCTCC NO：M2011107的猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-65)，所用引物对的核苷酸序列如下所示：

正向引物：AAAGTCGACCATGGCAAAAGAA(5′→3′)，

反向引物：CCCAAGCTTAATCCTGCTTGA(5′→3′)。

3.一种能够原核表达猪肺炎支原体的主要免疫原性膜蛋白-p65蛋白的基因片段，该片段的核苷酸序列如下所示：

ATGGCAAAAG AAATCATTTT AGGAATCGAC CTTGGAACAA CAAACTCAGT TGTTGCAATT

ATTGAAAATC AAAAACCTGT CGTTCTCGAA AATCCCAACG GAAAAAGAAC AACTCCATCC

GTTGTCGCTT TTAAAAACAA TGAAGAAATT GTCGGGGATG CAGCTAAAAG ACAACTTGAA

ACTAACCCAG AAGCAATCGC TTCAATTAAA AGATTAATGG GAACTGATAA AACAGTTCGT

GCAAATGAAA GAGATTATAA ACCTGAAGAA ATCTCGGCAA AAATTCTTGC TTATTTAAAA

GAATATGCTG AGAAAAAGAT TGGTCATAAA GTAACAAAAG CAGTAATTAC AGTACCTGCT

TATTTTGACA ATGCCCAACG TGAGGCAACA AAAAATGCCG GAAAAATCGC TGGATTACAA

GTAGAAAGAA TTATAAATGA ACCAACAGCG GCCGCACTTG CTTTTGGCCT TGATAAAACT

GAAAAAGAAA TGAAAGTTCT TGTCTATGAC TTAGGTGGGG GAACTTTTGA TGTCTCAGTT

TTAGAATTAT CCGGTGGAAC CTTCGAAGTT TTATCAACTA GTGGTGATAA TCATTTAGGT

GGGGATGACT GGGATAATGA AATTGTAAAT TG(A/G)CTTGTTA AAAAAATCAA AGAAGAATAT

GATTTTGATC CAAAAAGTGA TAAAATGGCG CTTACAAGAC TTAAAGAAGA GGCTGAAAAA

ACCAAAATTA ATCTTTCAAA TCAAAGTGTT TCTACAGTTT CTCTACCATT TTTAGGAATG

GGCAAAAACG GGCCGATTAA CGTTGAACTT GAACTTAAAA GATCAGAATT TGAAAAAATG

ACTGCCCATT TAATCGATAG AACTCGCAAA CCAATTGTTG ATGCTCTAAA ACAAGCAAAA

ATTGAGGCTT CAGATCTTGA TGAAGTTCTC CTTGTAGGTG GATCAACAAG AATGCCAGCT

GTTCAGTCAA TGATTGAGCA TACTTTAAAT AAAAAGCCAA ATCGTTCAAT TAATCCTGAT

GAGGTAGTCG CAATTGGTGC TGCAATTCAA GGGGGGGTTC TAGCTGGAGA GATCAGTGAT

GTTCTACTTT TAGATGTTAC TCCTTTAACT TTAGGAATTG AAACTTTAGG TGGAATTGCA

ACACCTTTGA TTCCAAGAAA TACAACAATT CCGGTAACAA AATCACAAAT TTTCTCAACA

GCTGAGGATA ATCAAACCGA AGTAACAATT TCTGTTGTCC AAGGTGAACG TCAACTTGCA

GCGGATAATA AAATGTTAGG TCGCTTTAAT TTATCAGGAA TTGAAGCTGC TCCACGAGGT

CTTCCCCAGA TTGAAGTTAG CTTTTCAATT GATGTCAACG GGATTACAAC GGTTTCAGCA

AAAGATAAAA AAACCGGCAA AGAACAAACA ATTACAATTA AAAATACTTC AACTTTATCA

GAAGAAGAAA TTAATAAGAT GATTCAGGAA GCCGAAGAAA ATCGTGAAGC TGATGCTCTT

AAAAAAGACA AAATCGAGAC AACAGTTCGT GCCGAAGGGC TTATTAATCA ACTTGAGAAA

TCAATAACTG ATCAAGGTGA AAAAATTGAT CCAAAACAAA AAGAATTACT TGAAAAACAA

ATTCAAGAAT TAAAAGATCT TCTAAAAGAA GAAAAAACTG ACGAATTAAA ATTAAAATTA

GACCAAATTG AAGCAGCTGC CCAATCTTTT GCGCAGGCAA CCGCGCAGCA AGCAAATACA

TCTGAATCTG ATCCAAAAGC TGATGATTCA AACACAATGG ATGCTGAAAT CAAGCAGGAT TAA

在上述序列表中，将633bp处的碱基A人工定点突变为碱基G。

4.包含权利要求1所述的减毒猪霍乱沙门氏菌的菌液以及明胶制备的猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎二价基因工程疫苗，按体积比计，所述的猪霍乱沙门氏菌的菌液与明胶的比例为2∶1。

5.权利要求1所述的减毒猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪支原体肺炎二价基因工程疫苗中的应用。

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