CN101979501B - 表达猪链球菌2型表面抗原基因sao的重组猪霍乱沙门氏菌及疫苗与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌基因工程领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪链球菌2型表面抗原sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建、疫苗制备及应用。获得一株无抗性标记的表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/Pya-saoA，其保藏号为CCTCC NO：M2010156。该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌的asd基因，含有能在该菌株中表达asd和猪链球菌2型sao基因片段的质粒pYA-saoA。本发明还公开了该重组菌株与疫苗的制备方法以及在制备猪霍乱沙门氏菌-猪链球菌2型疫苗中的应用。

Description

表达猪链球菌2型表面抗原基因sao的重组猪霍乱沙门氏菌及疫苗与应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪链球菌2型表面抗原基因sao片段的重组猪霍乱沙门氏菌菌株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是当今危害养猪业的一种重要病原，是目前引起猪链球菌病的主要病原菌。也常作为猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪附红细胞体、猪传染性胸膜肺炎等病的并发或继发感染病原，严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，SS2)致病性强、流行广，亦是近年来临床分离频率最高的血清型。猪链球菌2型可引起脑膜炎以及败血症等，人通过特定的途径亦可感染该菌，是一种重要的人畜共患病原菌。疫苗免疫是控制该病最为有效的策略之一，灭活疫苗虽然可以有效地控制同源菌株的感染，但由于存在免疫效力低、副反应大等问题，因此，急需开发新型的猪链球菌疫苗，基因工程载体疫苗被认为是目前控制该病的有效策略之一。

随着分子生物学技术发展，人们开始关注使用减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原这一研究领域。应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多的优点：(1)产生细胞毒性T细胞的杀伤反应(CTL反应)；(2)减毒沙门氏菌因侵入淋巴***，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫；(3)通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发***和粘膜免疫反应；(4)具有免疫佐剂作用；(5)免疫具有持续性；(6)具有联合免疫作用，可以稳定表达原核和真核基因，本身不致病，而且也作为伤寒疫苗；(7)所表达的靶抗原不需提纯，制备简单可直接用于免疫保护试验，显著降低了疫苗的制作成本；(8)接种简单方便，易于操作等(Curtiss，R等，1996，Strategies for the use of live recombinant avirulentbacterial vaccines for mucosal immunization，p.499-511，In H.Kiyono and M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials ofmucosal immunology，Academic Press，San Diego等，2006.Rational design of Salmonella-based vaccinationstrategies.Methods 38：133-143；Sirard J等，1999.Live attenuated Salmonella：a paradigm of mucosal vaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。

如今，人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗***，如将外源抗原稳定整合到沙门氏菌染色体，或用不需要抗生素的质粒平衡***(Balanced-lethal Plasmid Stabilisation System)。其中，应用最多的***是asd质粒载体平衡致死***。沙门氏菌的asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶(aspartateL-semialdehyde dehydrogenase)，是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解。将目的基因***含asd的质粒，转化asd^-宿主菌后可形成互补，asd质粒丢失的asd^-沙门氏菌在体内死亡，只有含有asd质粒的沙门氏菌才能存活，并稳定的在体内体外表达外源抗原。由于用asd质粒载体平衡致死***代替了抗生素抗性标记，因此也更加安全(Nakayama，K等，1988.Constructionof an Asd⁺expression-cloning vector：stable maintenance and high level expression of cloned genes in aSalmonella vaccine strain.Bio/Technology 6：693-697；Kang，H等，2002，Immune responses to recombinantpneumococcal PspA antigen delivered by live attenuaed Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Infect.Immun.，70：1739-1749)。

我国在60年代初，房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后，选出一株免疫原性好的弱毒株，被命名为C500(房晓文等，仔猪副伤寒弱毒菌苗的研究，畜牧兽医学报，1981(2)：29～36)。C500菌株在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制(黄昌炳等，仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究，中国农业科学，1981(6)：89～94；康凯，仔猪副伤寒活疫苗，中国兽药杂志，2003(37)37-49)。基于C500良好的免疫原性，运用分子生物学技术构建C500的asd质粒载体平衡致死***被用于多种猪病基因工程载体疫苗的研究，表明了该套***疫苗巨大的应用的潜力(赵战勤等，猪霍乱沙门氏菌AasdC500株的生物学特性及作为活疫苗表达载体的应用，生物工程学报，2009，25(1)：29-36)。

asd质粒载体平衡致死***具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化、无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达猪链球菌2型保护性抗原基因的重组活疫苗具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术缺陷，获得一种免疫原性优和安全性好的表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株。

本发明的第二个目的是利用表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株制备猪霍乱沙门氏菌-猪链球菌2型二联基因工程疫苗。

本发明的第三个目的是表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株在制备猪霍乱沙门氏菌-猪链球菌2型二联基因工程疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种不含抗性标记的表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株，其分类命名为猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)asd^-C500/Pya-saoA，2010年6月24日保藏在湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2010156。

1.表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-saoA的构建步骤

重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-saoA的构建技术路线见图1。其步骤如下：

1)构建猪霍乱沙门氏菌株C500的asd基因缺失株asd^-C500。

2)猪链球菌2型表面抗原基因sao的克隆：以猪链球菌2型(Streptococcus suis2，SS2)基因组为模板，通过PCR方法扩增得到猪链球菌2型表面抗原基因sao的部分片段，命名为saoA，引物序列见实施例2，扩增片段核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3)原核表达质粒pYA-saoA的构建：将步骤2)得到得到saoA***原核表达载体pYA3493(asd+，pBRori，β-lactamace signal sequence，美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III惠赠)的BamH I和Pst I位点之间，构建得到表达质粒pYA-saoA。

4)重组菌株asd^-C500/pYA-saoA获得：将步骤3)的表达质粒pYA-saoA电转化猪霍乱沙门氏菌asd^-C500感受态细胞，用无抗生素的LB培养基筛选单个重组沙门氏菌，PCR方法筛选阳性克隆。

2.重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-saoA的疫苗制备

将本发明的重组菌株asd^-C500/pYA-saoA在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到1×10¹⁰CFU/mL。按细菌液∶明胶保护剂(体积∶体积)为7∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用10％铝胶生理盐溶解并进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

上述的表达猪链球菌2型sao基因片段的重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-saoA可用于研发新型动物基因工程活疫苗。

本发明的主要优点是：

1.本发明制备的基因工程重组菌株表达的猪链球菌2型表面抗原基因sao为猪链球菌2型重要的免疫原性基因片段，不仅具有良好的免疫保护性，且在各血清型种均保守存在。猪链球菌(Streptococcus suis)是当今危害养猪业的一种重要病原，是目前引起猪链球菌病的主要病原菌。也常作为猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪附红细胞体、猪传染性胸膜肺炎等病的并发或继发感染病原，严重危害着我国乃至世界养猪业的发展。因此，用本发明的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2.本发明制备的基因工程菌株衍生于在中国已经使用了多年的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，本发明的基因工程菌株毒力比C500稍弱，因而具有更好的生物安全性。

3.本发明制备的基因工程菌株无抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

图1：是本发明重组菌株构建的技术路线图。

图2：是本发明制备的转移质粒pREasd12的示意图谱。

图3：是本发明制备的转移质粒pREasd12的酶切鉴定结果。泳道M为15000bp的DNA分子marker，泳道1为pREasd12经Xba I+Kpn I酶切产物。

图4：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500的PCR检测电泳图谱。泳道M1为2000bp的DNA分子marker，泳道M2为15000bp的DNA分子marker，泳道1-7为筛选的缺失株asd^-C500，泳道8-12为亲本菌株C500对照，泳道13为pREasd12质粒对照，泳道14为H₂O对照。

图5：是本发明使用的报道的基因序列的登录号及其在链球菌05ZYH33中所处的位置(括号内显示为有下划线的为所述的抗原基因序列在Genebank的登录号，其后的冒号后的数字为该登录号所示基因序列在猪链球菌05ZYH33基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字为所述的猪链球菌的菌株号)。

图6：是本发明猪链球菌2型表面抗原基因saoA片段的PCR扩增图。泳道1为2000bp的DNA分子marker，泳道2为阴性对照，泳道3为扩增的目的基因saoA。

图7：是本发明使用的克隆载体pMD18-T质粒图谱。

图8：是本发明使用的表达载体pYA3493质粒图谱。

图9：是本发明构建的pYA-saoA双酶切鉴定图谱。泳道1为15000bp的DNA分子marker，泳道2为质粒酶切产物。

图10：是本发明重组菌株的PCR鉴定图谱。泳道1为2000bp的DNA分子marker，泳道2为asd^-C500/pYA3493株PCR产物，泳道3为重组菌asd^-C500/pYA-saoA的PCR产物。

图11：是本发明重组菌株的SDS-PAGE图谱。泳道1为蛋白分子量marker，泳道2为重组菌asd^-C500/pYA-saoA的裂解产物，泳道3为asd^-C500/pYA3493的裂解产物。

图12：是本发明重组菌的Western-blot分析图谱。泳道1为蛋白分子量marker，泳道2为asd^-C500/pYA3493的培养液上清，泳道3为重组菌asd^-C500/pYA-saoA培养液上清。

图13：是本发明重组菌的遗传稳定性PCR分析图谱。泳道1为2000bp的DNA分子marker，泳道2-7为重组菌asd^-C500/pYA-saoA原始代、10代、20代、30代、40代、50代的PCR产物。

图14：是本发明的重组菌免疫小鼠诱导的rSaoA抗体水平示意图。

具体实施方式

实施例1猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失菌株asd^-C500的构建

1.引物设计

参照已报道的鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因序列(GenBank No：AE008863)设计2对引物(pa1/pa2和pa3/pa4，见表1，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500(购自中国兽医药品监察所)基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1和asd2，扩增片段大小分别为2112bp和2069bp，上臂两端分别引入Xba I和BamHI酶切位点，下臂两端分别引入BamHI和Kpn I酶切位点。另设计1对引物(pa5/pa6见表1)进行C500亲本菌株和asd缺失菌株的鉴定。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1：PCR引物

2.asd基因上下游片段asd1(上臂)与asd2(下臂)的克隆

将冻干的猪霍乱沙门氏菌C500在LB固体平板上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)说明书提取基因组为PCR模板。

asd1和asd2扩增反应均在25μL的体系中进行，反应体系(PCR相关试剂均购自宝生物工程大连有限公司)如下：模板DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，2U/μL Taqase 0.5μL，双蒸水16μL。

asd1和asd2扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃ 1min，57℃ 1min，72℃2.5min。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为2112bp和2069bp。将得到的目的基因克隆到pMD18-T载体(购自大连宝生物工程有限公司公司)。

3.pREasd12转移质粒的构建

用XbaI和BamHI双酶切asd1和pBluescriptSK(+)载体(购自美国Stratagene公司)，回收纯化后用T4 DNA ligase(购自宝生物工程大连有限公司)连接，16℃水浴12h，转化DH5a感受态细菌(购自宝生物工程大连有限公司)，37℃在固体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，15g琼脂粉，加蒸馏水定容至1000mL，在121℃高压蒸汽灭菌25min)培养12h，挑菌到液体LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，加蒸馏水定容至1000mL，121℃高压蒸汽灭菌25min)，于37℃、225r/min振摇培养12h，使用质粒提取试剂盒(购自北京TIANGEN公司)小量制备质粒从而获得质粒pSKasd1。再用BamHI和KpnI双酶切asd2与质粒pSKasd1。回收后用T4 DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pSKasd12。用XbaI和KpnI双酶切转移质粒pSKasd12与***性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Miller，V.L.，Mekalanos J.J.1988.A novel suicide vector and its use inconstruction on insertion mutations：osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants inVibrio cholerae requires toxR.J.Bacteriol.170：2575-2583)，回收asd1+asd2片段和质粒pRE112，用T4DNAligase连接，16℃水浴12h，电转化(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)大肠杆菌χ7213(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards，R.A.，L.H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987Pfimbria gene expression.Gene 207：149-157)构建重组菌株χ7213/pREasd12，37℃培养12h挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得pREasd12转移质粒，其物理图谱见图2。鉴定结果证实构建的转移质粒pREasd12是正确的(见图3)。

4.asd基因缺失株的构建

以χ7213/pREasd12为供体菌，猪霍乱沙门氏菌C500为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，加蒸馏水至1000mL，经121℃高压蒸汽灭菌30min)洗两遍，调整菌浓度至OD595为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维滤膜贴于含二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP，购自美国Sigma公司)的固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，用无菌PBS洗两遍，涂布含氯霉素(Cm，终浓度30μg/ml)的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性接合子，提取基因组，用引物pa5/pa6扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，鉴定结果见图4。C500的asd基因缺失株由于缺失asd基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。结果表明，所构建的asd基因缺失株asd^-C500是正确的。

实施例2：猪链球菌2型表面抗原基因sao的克隆

1.基因分析与引物设计

参照报道的猪链球菌2型05ZYH33株(genebank NO.CP000407)sao基因序列；使用Tmpred(http://www.ch.emnet..org/software/tmpred_Form.html)及SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)软件对该基因所编码蛋白氨基酸序列分析；设计上游引物AAAGGATCCGCAACCTGATGGGGGAC与下游引物GGGCTGCAGTCATTACATTGCTTCCTTA用于扩增sao基因A段(saoA，777bp)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。05ZYH33株sao基因在genbank的位置如图5所示。

猪链球菌2型05ZYH33株(genebank NO.CP000407)sao基因全长1743bp，编码581个氨基酸。对Sao蛋白氨基酸序列使用Tmpred及SignalP软件分析，结果表明：Sao蛋白存在两个跨膜区(8-24aa，559-575aa)，分别对应N端信号肽序列及C端膜锚定序列；第29位氨基酸与第30位氨基酸之间为信号肽切割位点。该切割位点与Yuanyi Li等(2006)报道一致；并且据该文献所知，Sao蛋白C端膜锚定区之前存在氨基酸重复区域，对05ZYH33株Sao氨基酸序列分析表明该重复区位于300-550aa。综上，设计引物避开了信号肽序列及氨基酸重复区，扩增sao基因121bp-897bp，命名为saoA。

2.猪链球菌2型基因组制备

将猪链球菌2型菌种CVCC606株(购自中国北京，中国兽医药品监察所)接种于含有10％灭活新生牛血清的TSA固体培养基(购自Sigma公司)上，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基(购自Sigma公司)中，置于摇床中(150r/min)，37℃震荡培养过夜。

遵照TIANGEN细菌基因组提取试剂盒(购自武汉大风生物技术有限公司)，按照该试剂盒说明书提供的操作方法提取猪链球菌2型基因组DNA。

3.PCR扩增

本发明的PCR反应体系(25μL)如表1所示：

表1PCR反应体系组成

本发明的PCR条件为94℃、5min，1个循环；94℃、1min，52℃、30sec，72℃、1min，30循环；最后72℃延伸10min。用1.0％的琼脂糖胶电泳，进行鉴定回收。

PCR结果见图6，扩增的saoA核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

4.PCR产物回收

采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作步骤如下：

(1)用0.8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5ml灭菌离心管中。

(2)按每100mg琼脂糖胶加入400μl Binding Buffer，置50-60℃水浴中10min，使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。

(3)将UNIQ-10柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2min，室温8000rpm离心1min。

(4)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μl WashSolution，室温8000rpm离心1min。

(5)重复步骤4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室温12000rpm离心15sec。

(6)将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1.5ml离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子底部的膜中央加10～20μl Elution Buffer或ddH₂O，室温或37℃放置2min。

(7)室温12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

实施例3：原核表达质粒pYA-saoA的构建

1.猪链球菌型表面抗原基因saoA片段的TA克隆

将目的基因saoA的PCR回收产物和载体pMD18-T(购自宝生物工程(大连)有限公司)于16℃水浴过夜进行连接反应，转化DH5α感受态细胞，37℃在含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入含有氨苄青霉素(AMP，50μg/mL)的LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，将其命名为pMD-saoA。pMD18-T质粒图谱如图7所示。

2.χ6097感受态的制备(CaCl₂法)

采用CaCl₂法制备大肠杆菌χ6097(araΔ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2::Tn10]thiΦ580d/lacZΔM15，美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III惠赠)感受态细胞，具体实验步骤如下：从-70℃冰箱取出大肠杆菌χ6097后，手握解冻，用无菌铂丝直接蘸取χ6097菌种在含50μg/mL的二氨基庚二酸(DAP)的LB平板表面上，于37℃恒温倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至5mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃、230r/min恒温振荡培养过夜；按体积比1∶100比例将培养物接种至适量LB培养液(含50μg/mL DAP)中，于37℃、230r/min恒温振荡培养3-4h；取出100～200μL培养物检测OD600，当OD600介于0.3-0.4之间时，将培养物置于冰浴中30min，使培养物冷却到0℃；容纳后在4℃，5000-6000r/min下离心10min收集菌体，弃去培养液；加入约1/2-1/5培养物体积的冰浴CaCl₂溶液(100mmol/L，10％(V/V)甘油)，轻轻吹打，充分重悬细菌沉淀，冰浴15min；重复上述步骤洗涤沉淀2次；于4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；加入约1/50-1/25培养物体积的CaCl₂溶液(含100mmol/L CaCl₂，10％(V/V)甘油)，轻轻吹打，重悬细菌；将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管100μL，置于-70℃冰箱冻存备用。

3.表达质粒pYA-saoA的构建

对步骤1制备的质粒pMD-saoA使用限制性内切酶BamH I和Pst I进行酶切，回收酶切产物saoA与pYA3493(BamH I和Pst I酶切线性化)于16℃水浴连接过夜。连接产物转化步骤2制备的χ6097感受态细胞，于37℃在LB固体培养基上培养，从中随机挑选多个单菌落，分别放入LB液体培养基中37℃培养12小时后从中提取质粒，经酶切鉴定后筛选得到阳性重组质粒，并命名为pYA-saoA。pYA3493质粒图谱如图8所示，重组质粒pYA-saoA双酶切图谱见图9。

实施例3：重组沙门氏菌菌株asd^-C500/pYA-saoA的构建

1.沙门氏菌asd^-C500感受态细胞制备

从-70℃冰箱取出沙门氏菌asd^-C500菌种，手握解冻，用无菌铂丝直接蘸取菌种在LB平板(含50μg/mLDAP)表面划线接种，37℃恒温倒置培养16-18h；挑取1个直径约为2-3mm的单菌落接种至4mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃，180r/min恒温振荡培养过夜；按体积比1∶100比例将培养物接种至50mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃、230r/min恒温振荡培养2-3h；取出100-200μL培养物检测OD600，当OD600介于0.8-1.0之间时，将培养物置于冰浴中10min，使培养物冷却到0℃；然后在4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃去培养液；用2-5mL 10％浓度的灭菌甘油洗涤后离心，重复3次，再用10％浓度的灭菌甘油悬浮细菌，100-150μL/管分装，标明菌株、体积和日期，置-70℃冰箱冻存备用。

2.重组质粒的电转化

取2-3μL经过除盐的重组质粒pYA-saoA加入到感受态细胞asd^-C500中，混匀。

将混合液立即转移到预冷的0.2cm电转化杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRadGenePulser)样品槽中；按照以下电转条件进行转化：电压，2.0KV；电容，25μF；脉冲电阻，200Ω；时间，4ms。

电击后，马上取出电转杯，迅速加入37℃预热的LB培养基中(含50μg/mL DAP)，并将菌液转移到无菌的EP管中；37℃、120r/min震荡培养45-60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h。

3.重组菌株asd^-C500/pYA-saoA获得

将重组质粒pYA-saoA电转化asd^-C500感受态细胞构建的重组菌株恢复了在LB液体培养基上生长的能力，这说明重组质粒pYA-saoA在asd^-C500菌株内能够表达Asd蛋白并与后者的asd基因的缺失形成互补。与亲本株C500相同，重组菌株在加麦芽糖的麦康凯琼脂上呈红色菌落，在LB平板上长成无色、光滑、湿润的乳白色菌落。PCR鉴定表明各株重组菌均能扩增出沙门氏菌特异条带(580bp)和外源基因片段条带(777bp，见序列表SEQ ID NO：1所示)。PCR鉴定图谱见图10。

实施例4：重组菌株asd^-C500/pYA-saoA的生物学特性

1.重组菌株asd^-C500/pYA-saoA的表达特性

将重组菌asd^-C500/pYA-saoA接种于液体LB培养基中37℃振摇培养15～16h后，离心分别收集菌体和上清。加入适量PBS重悬沉淀，加入等体积2×SDS上样Buffer，煮沸10min，进行SDS-PAGE。按表2给出的数据分别配制分离胶和浓缩胶。

表2SDS-PAGE分离胶及浓缩胶配置方法

电泳完全后，将胶置于染色液中染色3小时，后经脱色液脱色并使用Quantity One软件分析表达情况。将上述步骤中采集到的培养上清经0.22um滤器过滤；取900μL滤液与100μL100％三氯乙酸混匀并冰浴30分钟，12000rpm离心5分钟后弃去上清；加入1mL预冷丙酮洗涤沉淀，离心去丙酮，重复2次彻底除去三氯乙酸；风干除去丙酮；沉淀用20μL SDS上样Buffer重悬后进行SDS-PAGE。SDS-PAGE分析图谱见图11。

当SDS-PAGE电泳将结束时，以蒸馏水淋洗石墨板，用不被吸收的纸巾擦干。戴上手套，剪6张3mm滤纸和1张硝酸纤维素滤膜。把硝酸纤维素滤膜漂浮于一盘去离子水的上面，先借毛细作用使膜从下往上润湿后，将膜完全浸没于水中，浸泡5min除去滤膜上残留的气泡，用软铅笔在滤膜一角做标记。在一托盘中加入少量电转缓冲液，把6张滤纸浸泡于其中。戴上手套安装转移装置，平放底部电极(阳极)，石墨一边朝上，在这一电极上放置3张浸泡过的滤纸，精确对齐，以玻璃棒赶出气泡，把硝酸纤维素滤膜放在滤纸上，保证对齐，没有气泡。从电泳槽上取下凝胶，转移到去离子水中略漂洗一下，然后精确平放于硝酸纤维素滤膜上，凝胶左下角与滤膜标记对齐，戴手套排除气泡。把最后3张滤纸放在凝胶上方，同样保证精确对齐不留气泡。将上方的电极(阴极)盖于夹层物上，石墨一边朝下，连接电源，根据凝胶面积按0.65～1.0mA/cm²接通电流，电转移2h。转印结束后，将NC膜置于TBST中漂洗一下，再放入封闭液中，4℃反应过夜。然后将膜取出，与TBST缓冲液稀释的一抗(猪链球菌2型免疫猪血清)37℃反应1h，TBST洗涤4-6次，每次5min，加入二抗(HRP标记羊抗猪IgG抗体，购自BIOTECK公司)37℃反应1h，TBST洗4-6次，每次5min，将膜置于干净的滤纸上吸干表面的水分。加入ECL底物液A、B(购自Ameresco公司)于干挣平皿中，把硝酸纤维素滤膜放入其中(避光)，置于Molecular Image station 2000MM(购自Kodak公司)显色并曝光3min，观察结果。Western-blotting分析图谱见图12。SDS-PAGE缓冲液配置：

5×Tris甘氨酸电泳缓冲液：Tris base 7.55g，甘氨酸(电泳级，pH8.3)47g，10％SDS(电泳级)25mL，加ddH₂O溶解，定容至500mL。

30％聚丙烯酰胺母液：将29g丙烯酰胺和1gN，N-亚甲基丙烯酰胺溶于60mL双蒸水(ddH₂O)中，加热至37℃溶解，定容至100mL，4℃避光保存备用。

2×SDS凝胶加样缓冲液：100mmol/L Tris-HCI(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油。

考马斯亮蓝染色液(100mL)：45mL甲醇，45mL ddH2O，10mL冰乙酸，0.25g考马斯亮蓝R250。脱色液(100mL)：45mL甲醇，45mL ddH₂O，10mL冰乙酸。

Western-blotting相关缓冲液配置：

电转缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％SDS(电泳级)，20％甲醇。配制1000mL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至总量为1000mL。

TBS(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl。

TBST：在TBS中加入终浓度为0.05％Tween-20即可。

封闭液：5g脱脂乳溶于100mLTBS中。

2.重组菌株asd^-C500/pYA-saoA的生长特性

将重组菌株asd^-C500/pYA-saoA划线接种LB平板，挑取单克隆分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液OD595值，取50μL接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定OD595值，结果如表3。重组菌asd^-C500/pYA-saoA在对数生长后期(10h以后)生长速度则略慢于C500及asd^-C500/pYA3493。

表3重组菌株培养不同时间段OD₅₉₅值

3.重组菌asd^-C500/pYA-saoA的遗传稳定性

将重组菌asd^-C500/pYA-saoA在LB液体培养基中连续传代，分别取第0代、10代、20代、30代、40代、50代菌液进行PCR鉴定。结果表明：各株重组菌的不同代次均能扩增出沙门氏菌特异条带(580bp)和外源基因片段条带。传代50代后挑取的单克隆测序结果与初代外源片段序列均一致，表明各重组质粒均能在asd^-C500/pYA-saoA中稳定遗传。遗传稳定性PCR结果见图13。

4.重组菌asd^-C500/pYA-saoA的致病力

重组菌的致病力，通过腹腔感染昆明系小鼠来评估。将梯度剂量的重组菌asd^-C500/pYA-saoA腹腔注射小鼠，观察21天并记录死亡情况。按照Reed-Muench法计算小鼠半数致死剂量(LD₅₀)，评价重组菌株与亲本菌株c500相比毒力是否减弱以及对小鼠是否安全。

高剂量均能在3天内致死全部5只老鼠；中等剂量未造成小鼠全部死亡，但能使大部分老鼠发病，表现为精神萎靡、行动迟缓、拒食，未死亡小鼠均能在10天之后恢复正常；低剂量不致死小鼠，也不造成小鼠发病。按照Reed-Muench法计算小鼠半数致死剂量LD₅₀，asd^-C500/pYA-saoALD₅₀约为4.7×10⁸CFU，相比较亲本株C5002.9×10⁸的LD₅₀，重组菌毒力明显下降。表明重组菌asd^-C500/pYA-saoA比较亲本株C500的致病力低，安全性更好。小鼠腹腔注射感染重组菌asd^-C500/pYA-saoA与亲本菌C500的安全性实验结果见表4。

表4重组菌株对小鼠半数致死剂量LD50的测定

实施例5：重组菌株asd^-C500/pYA-saoA疫苗的制备

将本发明的重组菌株asd^-C500/pYA-saoA在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到1×10¹⁰CFU/mL。按细菌液∶明胶保护剂(体积∶体积)为7∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用10％铝胶生理盐溶解并进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

实施例6：重组菌株疫苗asd^-C500/pYA-saoA对小鼠的免疫效力试验

1.小鼠的免疫程序

使用5-7周龄的昆明系小鼠作免疫效力评价，根据试验要求分为3组，分别为本发明制备的asd^-C500/pYA-saoA重组菌株疫苗组、asd^-C500/pYA3493对照组和PBS对照组。免疫途径为背部皮下注射0.2mL(含1.0×10⁹CFU活菌量)细菌悬液，14天后加强免疫1次。分别于首免后14天和28天检测重组蛋白rSaoA特异性抗体(ELISA方法参照柳忠辉等，免疫学常用实验技术，北京：科学出版社，2002)。

2.免疫小鼠血清抗体水平检测

各组小鼠在首免后14天及28天采血收集免疫血清，每组5只，用于ELISA检测。免疫血清的收集方法如下：小鼠断尾取血200μL，收集于1mL离心管中，37℃静置1h后，4℃过夜放置，3000r/min离心15min，收集上层血清，-20℃保存备用。小鼠血清抗体ELISA检测结果见图14，表明重组菌asd^-C500/pYA-saoA免疫组小鼠产生了较高水平的rSaoA特异性抗体。

3.免疫小鼠攻毒保护性实验

将5-7周龄沙门氏菌阴性昆明系小鼠40只，平均分为三组，即本发明制备的asd^-C500/pYA-saoA重组菌疫苗组、asd^-C500/pYA3493对照组、PBS对照组。首免后28天对免疫小鼠使用猪链球菌2型强毒株CVCC606进行腹腔注射攻毒，攻毒剂量为1.1×10⁹CFU。结果在该攻毒剂量下重组菌asd^-C500/pYA-saoA疫苗组15只小鼠全部保护无死亡例，asd^-C500/pYA3493对照组与PBS对照组全部死亡。攻毒保护结果见表5。

表5免疫小鼠CVCC606攻毒保护结果

实施例7：重组菌株疫苗asd^-C500/pYA-saoA对仔猪的免疫效力试验

1.仔猪的免疫程序

选择25-30日龄、沙门氏菌和猪链球菌阴性的仔猪12头，试验分3组，第1组为PBS对照组，第2组为asd^-C500/pYA3493疫苗对照组，第3组为本发明的asd^-C500/pYA-saoA重组菌疫苗组。

PBS对照组每头猪注射1mL PBS，asd^-C500/pYA3493疫苗对照组和本发明的重组菌疫苗asd^-C500/pYA-saoA组每只猪颈部肌肉注射1mL培养物菌悬液(3×10⁹CFU)，单次免疫。免疫后每周采血一次，分别用ELISA方法检测rSaoA特异性抗体(ELISA方法参照柳忠辉等，免疫学常用实验技术，北京：科学出版社，2002)。

2.免疫仔猪血清抗体水平检测

免疫后每周对猪群进行前腔静脉采血并分离血清，血清经稀释液1∶40稀释后采用ELISA方法检测各组猪群的rSaoA的特异性抗体水平。结果详见表6，表明本发明的asd^-C500/pYA-saoA重组菌疫苗能刺激仔猪产生较高水平的rSaoA的特异性抗体。

表6免疫仔猪rSaoA的特异性抗体水平

说明：ELISA判定标准：OD630＜0.4为阴性；OD630＞0.4为阳性。

3.免疫仔猪攻毒保护性实验

免疫后21天，对3组免疫猪群进行猪链球菌2型强毒株CVCC606耳静脉攻毒。攻毒后观察14天。结果如表6，对照asd^-C500/pYA3493组及PBS组仔猪攻毒24小时后开始出现临床症状，表现为体温骤然持续升高，跛行、趴卧、发颤、不进食、四肢划水并于攻毒后5天内全部死亡。本发明的asd^-C500/pYA-saoA重组菌疫苗免疫组只死亡1头，3头保护并无明显临床症状。见表7。

表7免疫仔猪CVCC606攻毒保护结果

Claims (2)

1.一株表达猪链球菌2型表面抗原基因sao的重组猪霍乱沙门氏菌株(Salmonellacholeraesuis)asd-C500/pYA-saoA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2010156，其特征在于：

1)该菌株基因组缺失了猪霍乱沙门氏菌生长必需的asd基因；

2)内含表达猪链球菌2型表面抗原基因sao的重组质粒pYA-saoA，其***的外源基因片段的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌-猪链球菌2型二联基因工程疫苗中的应用。

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