CN101880647A - 重组猪霍乱沙门氏菌及二价基因工程疫苗与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一株不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌C500(pYA-2SLN)，其保藏号为CCTCC NO：M 209189，该菌株缺失了猪霍乱沙门氏菌生长必需的asd基因，并含有能在该菌株中表达asd基因，猪传染性胃肠炎病毒A、D和N₃₂₁抗原位点基因的质粒。本发明还公开了利用该重组菌株制备猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎疫苗的方法及其应用。本发明制备的重组疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎病毒的保护性免疫反应，有效防止猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎病毒的感染。

Description

重组猪霍乱沙门氏菌及二价基因工程疫苗与应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点基因的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的构建及应用。

背景技术

猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，感染猪后引起以急性败血症、慢性坏死性肠炎、顽固性下痢等典型症状，常引起断奶仔猪大批发病，如伴发或继发感染其它疾病或治疗不及时，死亡率较高，造成重大损失。动物生前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生学上也具有重要意义。

人们最早用灭活的全菌疫苗来预防沙门氏菌引起的伤寒，由于灭活苗具有容易引起全身及局部反应、只能激发体液免疫、不能提供交叉保护、需多次加强免疫等缺点，此类疫苗的应用受到限制。随后，人们发现弱毒沙门氏菌在诱导体液和细胞免疫反应方面比灭活的或亚单位疫苗更为有效。于是，各种沙门氏菌弱毒苗在世界范围内得到了广泛应用，取得了良好的预防效果。我国在60年代初，房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌强毒株接种含有醋酸铊的培养基中传数百代后，选出一株免疫原性好的弱毒株，命名为C500。C500在全国推广使用，使我国仔猪副伤寒得到有效控制(黄昌炳，冯文达，薛民权，张绪基，杨少章，杨绍钧，窦荫梅，贾顺庚.仔猪副伤寒弱毒通气培养冻干苗口服免疫研究.中国农业科学，1981，6：89~94；康凯.仔猪副伤寒活疫苗.中国兽药杂志，2003，37：49)。

近30年来，人们开始关注使用减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原以预防重大人、畜传染病这一研究领域。应用各种基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多价疫苗等已成为该领域的研究热点。减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多的优点：(1)产生细胞毒性T细胞的杀伤反应(CTL反应)；(2)减毒沙门氏菌因侵入淋巴***，能更有效地激发宿主的体液和细胞免疫；(3)通过自然感染途径如口服或鼻内接种，可以激发***和粘膜免疫反应；(4)具有免疫佐剂作用；(5)免疫具有持续性；(6)具有联合免疫作用，可以稳定表达原核和真核基因，本身不致病，而且也作为伤寒疫苗；(7)所表达的靶抗原不需提纯，制备简单可直接用于免疫保护试验，显著降低了疫苗的制作成本；(8)接种简单方便，易于操作等(Curtiss，R.，III，T.Doggett，A.Nayak，and J.Srinivasan.1996.Strategies for the use of live recombinant avirulent bacterial vaccines formucosal immunization，p.499-511.InH.Kiyono and M.F.Kagnoff(ed.)，Essentials of mucosalimmunology.Academic Press，San Diego，Calif；S.Spreng，G.Dietrich and G.Weidinger.2006.Rational design of Salmonella-based vaccination strategies.Methods 38：133-143；Sirard，J.C.，F.Niedergang，and J.P.Kraehenbuhl.1999.Live attenuated Salmonella：a paradigm of mucosalvaccines.Immunol.Rev.171：5-26)。重组沙门氏菌疫苗的发展常常需要使用选择标记，由于以前普遍采用携带抗性基因的表达质粒，抗性基因成为体外转化筛选转化子和质粒在体外遗传的的主要标记。但是，抗生素是临床上治疗细菌感染的主要药物，由此引起的最大恐慌是抗性基因在环境病原微生物中传播，从而减弱治疗这些病原感染的药物效果。因此，抗生素抗性质粒选择***不被人们所接受。如今，人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗***，如将外源抗原稳定整合到沙门氏菌染色体，或用能筛选选择重组菌但不需要抗生素的质粒平衡***(Balanced-lethal Plasmid Stabilisation System)。其中，应用最多的***是asd质粒载体平衡致死***。沙门氏菌的asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶(aspartate L-semialdehyde dehydrogenase)，是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。由于哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解。将目的基因***含asd的质粒，转化asd宿主菌后可形成互补，asd质粒丢失的asd沙门氏菌在体内死亡，只有含有asd质粒的沙门氏菌才能存活，并稳定的在体内体外表达外源抗原。由于用asd质粒载体平衡致死***代替了抗生素抗性标记，因此也更加安全。(Nakayama，K.，S.M.Kelly，and R.Curtiss III.1988.Coe N E and R L Wood.The effect of exposure to aΔcrpΔcya mutant of Salmonella typhimurium on the subsequent colonization of swine by thewild-type parent strain.Vet Microbiol，1992，31：207-220.Hassan，J O，and R Curtiss III.Controlof colonization by virulent Salmonella typhimurium by oral immunization of chickens withavirulentΔcrpΔcya S.typhimurium.Res.Microbiol，1990，141：839-850.Kelly S M，BoseckerB A.Curtiss R III.Characterization and protective properties of attenuated mutants of Salmonellacholeraesuis.Infect Immun，1992，60：4881-4890Construction of an Asd+expression-cloning vector：stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain.Bio/Technology 6：693-697；Kang，H.Y.，J.Srinivasan，and R.Curtiss III.2002.Immune responsesto recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by live attenuated Salmonella enterica serovarTyphimurium vaccine.Infect.Immun.70：1739-1749.)。

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis of pigs，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的猪的一种以呕吐、水样腹泻为主要特征的高度接触性传染病(Leman et al，1992)。TGEV主要存在于猪的空肠和十二指肠，其次为回肠。各龄猪均易感染，由于仔猪肠道内尚未建立稳定的微生态***，自身抵抗力较低，对外界刺激敏感，易受各种病原微生物的侵袭和各种应激因素的影响，因此，常因脱水死亡，尤以10日龄内的仔猪发病率、死亡率最高，死亡率高达100％。5周龄以上仔猪死亡率较低，成年猪几乎没有死亡，但常常造成生产性能下降，饲料报酬率降低，经济损失较大(Sirinarumitr et al，1998；Jones et al，1997)。尽管TGE早已存在，但人们对其认识是逐步发展的过程，Doyle和Hutchings(1946)首次报道美国于1945年发生了本病，1956年发生于日本(Sasahara et al，1958)、1957年发生在英国(Goodwin和Jennings，1958)，从那时起，世界上大多数国家都有该病发生的报道。

TGEV基因组为不分段的单股正链RNA，具感染性，平均分子量为6.8×10⁶ku，基因组全长约28.6kb(标准株为28.586kb)。基因结构、复制过程以及病毒蛋白的表达都与其它冠状病毒类似(Laude et al，1990，1993；Enjuanes et al，1995)，3’端具有Poly(A)尾，5’端帽子结构与一个短引导序列相连，整个基因组的结构顺序为5’-ORF1a-ORF1b-S-ORF3a-ORF3b-sM-M-N-7-3’(Sune et al，1990；Cavanaghet al，1994)。

完整的TGEV包含四种结构蛋白：一个大的表面糖蛋白(Spike或S)；一个小的蛋白(sM)，一个完整的膜糖蛋白(M)，以及一个核壳蛋白(N)(Garwes et al，1979；Godet et al，1992)，分别在病毒进入宿主细胞、病毒粒子的形态发生以及病毒的释放过程中发挥作用，比列在不同的毒株有所不同。

S糖蛋白形成典型的花瓣状囊膜突起，长20nm，突出于病毒粒子表面，使整个病毒粒子在电镜下观察像皇冠状。S糖蛋白的抗原结构可分为抗原位点(sites)、抗原亚位点(subsities)和抗原决定簇(epitoes)。单克隆抗体标定显示抗原位点分A、B、C、D共4个(Gebauer et al，1991)，Correa等(Correa et al，1990)的研究证明4个抗原位点都位于S糖蛋白N-端约1/2的543个氨基酸区域内，由S基因5’端仅占2.2kb的基因片段编码(Delmas et al，1990)。不同分离株的A、B和D位点高度保守，C位点则有一些变化。体外实验证明，A、D位点在诱导产生中和抗体中起重要作用，并且氨基酸是保守的，还可能在病毒的繁殖中起作用。在S基因中若编码A、D位点的序列缺失，其表达产物则不能产生中和抗体。而其他位点(B、C)也能诱导中和抗体(Simkins et al，1992，1993；Correa et al，1990；Delmaset al，1990；Gebauer et al，1991)。用抗TGEV单克隆抗体的变异株证实四个主要抗原位点的A位点可分为Aa、Ab、Ac3个亚位点(Correa et al，1990)，S蛋白共有11个抗原决定簇，其中5个是与中和作用相关的重要抗原决定簇。应用抗原决定簇扫描定位亚位点对应的氨基酸残基证实，氨基酸残基538、591和543为对A位点的Aa、Ab、Ac3个亚位点的形成分别起着关键作用，而残基586位同时影响Aa、Ab亚位点的形成，这些结果说明A位点具有复杂的空间结构。537-MKRSGYGQPIA-547肽链是亚位点Ac的主要部分，它在3个冠状病毒群中高度保守，因此在制备病毒诊断试剂和亚单位疫苗方面具有重要意义。D位点存在与378-395残基区，第385位的甘氨酸(Gly)残基在D位点中构成重要的抗原表位，糖基化对D位点的抗原性影响不大，与A位点一样，D位点也是主要诱导中和抗体产生的抗原位点。

N蛋白是一种磷酸化的酸性蛋白，存在于病毒粒子的内部，含有382个氨基酸残基，其分子质量为47ku，以核糖核蛋白复合体的形式存在。N蛋白与TGEV的基因组RNA紧密结合在一起，形成一个螺旋状核糖核蛋白复合物，组成病毒的核衣壳，是核衣壳形成螺旋形结构的基础。这种结构与蛋白M形成一个球状亚病毒的内部核心(Risco et al，1996)。N蛋白有3个主要的T细胞抗原位点，分别为N48(46-60残基区)、N272(272-286残基区)和N321(321-335残基区)。其中N321T细胞抗原位点能够最强烈的T细胞反应，而且能够和TGEV中不同蛋白的B细胞表位协同发挥作用(Anton，1995)。

人们从1946年发现本病就开始研究免疫控制技术，大致经历人工感染强毒、灭活苗、弱毒活疫苗和基因工程疫苗四个阶段[3]。当前，可得到的商业化疫苗是以灭活或减毒的病毒为基础的，这些疫苗可以在免疫动物外周血中产生中和抗体，在小肠诱发分泌型IgA抗体的产生和细胞介导的免疫，但是不能对该并提供有效的保护(Brim et al.，1994；Park et al.，1998；Saif and Wesley，1999；Changming Liuet al.，2001)。随着分子生物学的发展，人们探索用基因工程疫苗来预防TGE的研究越来越多，原理是通过重组蛋白并以病毒、细菌或植物为载体表达TGEV的主要免疫原蛋白(大多数为S蛋白)，从而在动物体内产生免疫抗体(David et al.，1991；Godet et al.，1991；Pulford and Britton，1991；Torreset al.，1996；Tuboly et al.，2000)。然而这些策略到目前为止尚未能实现是因为所表达的重组蛋白未能够在猪体内诱导产生充分的保护性免疫(C.Liu et al.，2001)。因此，开发更加安全、高效、廉价的新型疫苗是世界养猪业的迫切需要。

重组沙门氏菌活疫苗自然感染或试验感染诱导抗任何异源血清型沙门氏菌保护的同时，沙门氏菌因侵入淋巴***，能更有效地激发宿主产生针对异源抗原的体液和细胞免疫反应等优点。这样，重组弱毒活疫苗也许是解决当前猪传染性胃肠炎病毒商品化疫苗不足的一种可行方法。构建沙门氏菌重组菌株的传统方法存在很多缺陷。如以前普遍采用携带抗性基因的表达质粒，因存在生物安全问题而不被人们所接受。asd质粒载体平衡致死***具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因的重组活疫苗具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株，该重组菌含有两个柔性的Linker序列连接的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的两个主要的产生中和抗体的A、D抗原位点和N₃₂₁抗原位点的多肽。

本发明的第二个目的是利用上述的重组菌获得一种猪霍乱沙门氏菌株制备猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎病毒二价基因工程疫苗；

本发明的第三个目的是上述重组菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎病毒二价基因工程疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过基因工程的方法，获得一种不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组的猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choloraesuis)C500/pYA-2SLN，该菌株于2009年8月31日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M209189。

一种重组猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN的制备方法，它包括下列步骤：

1)人工合成猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因片段SLN：通过两个柔性的Linker序列把猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的两个主要的产生中和抗体的A、D抗原位点和N321抗原位点按照顺序为：D抗原位点→Linker→N321抗原位点→Linker→A抗原位点顺序连接起来，合成猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因片段SLN，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

2)构建重组质粒pET-2SLN：将合成后的SLN序列亚克隆至pET-28a载体后，采用SalI和XhOI对质粒pET-SLN进行酶切和连接，构建得到2个拷贝的SLN片段；

3)构建重组质粒pYA-2SLN：将构建好的2个拷贝的SLN基因片段从重组质粒pET-2SLN酶切连接质粒pYA3493后，电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株，得到保藏编号为CCTCC NO：M209189的重组猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN。

申请人获得一种合成的猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的基因片段SLN(核苷酸序列)，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示(其制备方法见实施例所示)。

申请人利用所述的重组猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN菌液和明胶制备成功一种防治猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎的二价基因工程疫苗。

上述的不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成相关基因asd基因(需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能正常生长、繁殖)，同时该重组菌株含有外源质粒pYA-2SLN(含有asd基因)，该重组菌株保留了亲本菌株C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-2SLN能在该菌株中表达asd基因与猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点基因(本发明命名为SLN)。其中，asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成相关成份。A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点基因表达产物提供良好的针对猪传染性胃肠炎病毒的免疫原性。

本发明的不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株C500/pYA-2SLN，该基因工程菌株C500/pYA-2SLN衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500。所述的本发明的重组猪霍乱沙门氏菌株C500/pYA-2SLN，缺失了C500菌株基因组中的asd基因，同时添加了含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点基因的质粒pYA-2SLN。由于需要pYA-2SLN的存在重组菌株才能存活，因此大大提高了质粒pYA-2SLN(也就是A、D抗原位点和N321抗原位点基因)在重组菌株中的稳定性。A、D抗原位点和N321抗原位点基因在重组菌株中的稳定表达，使之具有针对猪传染性胃肠炎病毒很好的免疫保护力。

本发明的基本构建方法是：利用本申请人所在的农业微生物国家重点实验室构建好的asd基因缺失的猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500ΔcrpΔasd缺失株(参见文献：徐引弟等，猪霍乱沙门氏菌C500株ΔcrpΔasd缺失株平衡致死载体***的构建及鉴定.生物工程学报，2006，5(3)：366-371)，同时构建含有猪传染性胃肠炎病毒S蛋白(GenBank No：DQ443743)中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点基因的质粒pYA-2SLN。将质粒pYA-2SLN转入C500asd基因缺失株中，由于生长的需要质粒pYA-2SLN与C500asd基因缺失株互补而稳定共存，形成我们发明的不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组C500(pYA-2SLN)菌株。通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎病毒的二价基因工程疫苗。

本发明的主要优点是：

1、本发明的重组菌株表达的猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中的A、D抗原位点和N蛋白中的N321抗原位点是猪传染性胃肠炎病毒重要的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。由于猪传染性胃肠炎病毒危害日益严重，而目前市场上各种商品化猪传染性胃肠炎疫苗(主要是佐剂灭活苗)免疫效果普遍较差。因此，用该基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2、本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，该重组菌株毒力比C500稍弱，具有更好的生物安全性。

3、本发明的重组菌株可以同时提供针对猪霍乱沙门氏菌和传染性胃肠炎病毒两种病原的保护力。

4、本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

更详细的技术方案见实施例所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明合成的猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的基因片段SLN(单拷贝)。

图1：是本发明制备的重组质粒pYA-2SLN的物理图谱。

图2：是本发明制备的重组质粒pYA-2SLN的PCR鉴定电泳图谱。

图中M：DNA Marker(DL2000)1：pYA-2SLN    2：pYA3493

图3：是本发明制备的重组质粒pYA-2SLN的酶切鉴定结果。

图中M1：DNA Marker(DL2000)，M2：DNA marker(DL 15,000)1：pYA-2SLN/EcoR I+Hind III

2：pYA3493/EcoR I+Hind III

图4：是本发明中一种不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株的遗传稳定性实验结果。图中M：DNA marker(DL 2,000)；7为C500(pYA3493)对照；1-6为1-50代重组菌株

图5：是本发明制备的转移质粒pYA-SLN构建的流程图。

图6：是本发明中一种不含抗性标记的表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌活疫苗菌株C500(pYA-2SLN)的SDS-PAGE和Western-blot分析结果。

图6A是用SDS-PAGE方法检测融合蛋白Cpro-2SLN，图中1为C500(pYA3493)；2为重组菌株C500(pYA-2SLN)；箭头所示为融合表达蛋白Cpro-2SLN。

图6B是用Western-blot方法检测融合蛋白Cpro-2SLN，图中1为C500(pYA3493)；2为重组菌株C500(pYA-2SLN)

图7：是本发明中重组沙门氏菌所用载体的图谱。

图8：是猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中的3个抗原位点序列。

图9：是拼接、合成的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)主要抗原位点序列，图中：加粗部分为Linker序列，字符边框为酶切位点，下划线部分为点突变位点。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明。

实施例1含猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因片段的合成

1、主要抗原位点的选择

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白含有A、B、C、D共4个抗原位点，其中A和D抗原位点在诱导产生中和抗体中起重要作用，并且A抗原位点为一主要的B细胞抗原表位。猪传染性胃肠炎病毒含有4个主要的T细胞表位，其中N蛋白上的N₃₂₁(321-335残基区)细胞抗原位点能够最强烈的T细胞反应，而且能够和TGEV中不同蛋白的B细胞表位协同发挥作用。

2、S和N基因引物的设计及其同源性的比较

参照已报道的猪传染性胃肠炎病毒S和N(GenBank No：DQ443743)基因序列设计2对引物，分别从含有猪传染性胃肠炎病毒的病料中通过RT-PCR方法扩增出S基因和N基因。扩增目的片段大小分别为2331bp和1440bp，pS1和pS2分别引入EcoR I和Sal I酶切位点，pN1和pN2分别引入EcoR I和Sal I酶切位点。引物序列如下：

pS 1：5’-GGGGAATTCATGAAAAAACTATTTGTGG-3’(EcoRI)

pS2：5’-ACTGTCGACGGCTTGTGCGCTTAC-3’(SalI)S片段2331bp

pN1：5’-CATGAATTCATGGCCAACCAGG-3’(SalI)

pN2：5’-GCCGTCGACGTTAGTTCGTTACC-3(Hind III)N片段1440bp

通过RT-PCR扩增出S和N基因后连接T-载体后，进行测序。测序结果显示，本室所保存的TGEV的S和N基因与国内外的8株TGEV(Purdue(美国)，NC-002306(西班牙)，Purdue P115(美国)，MillerM60(美国)，MillerM6(美国)，TS(中国农业科学院兰州兽医研究所)，SC-Y(四川农业大学)和TH-98(东北农业大学)的同源性在97％-99％之间。其中在A、D和N₃₂₁抗原位点上，与国内的SC-Y和TH-98株的同源性为100％。

3、SLN序列的设计与合成

通过两个柔性的Linker序列把TGEV的两个主要的产生中和抗体的A、D抗原位点和N321抗原位点连接起来(顺序为D抗原位点序列→Linker→N321抗原位点→Linker→A抗原位点序列)，并把该序列命名为SLN。对厌恶密码子进行点突变(GTG→GTa)，但不改变其编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点(AAC→Aat，ATC→Att，ACA→ACt)进行点突变，但不改变其编码的氨基酸。在SLN的上游和下游分别引入SalI酶切位点和NotI酶切位点。具体序列见图9.

将设计好的SLN序列送往上海invitrogen公司进行合成。

实施例2重组质粒pYA-2SLN的构建

1、SLN基因的克隆

将含有SLN基因序列的重组菌(DH5α/pET-2SLN)按照体积比为1∶100转接到含3mL LB培养基的细菌瓶中，37℃、200rpm/min过夜培养8h。按细菌质粒提取试剂盒(购自北京BioFlux公司)说明书提取质粒为酶切模板。

用EcoRI和NotI双酶切SLN与pET-28a载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)，回收纯化后用T4DNA ligase连接，16℃水浴12h，转化DH5α感受态细菌，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、200rpm/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pET-SLN(见图5)。

2、串联多拷贝SLN基因的构建及引物设计

利用pET-SLN上SalI和XhOI是一组同尾酶的性质，将部分pET-SLN质粒进行SalI和SmaI双酶切，另一部分pET-SLN质粒进行XhOI和SmaI双酶切。每组质粒双酶切后都产生两个片段，将含有SLN基因序列的，即SalI和SmaI双酶切组中选小片段，XhOI和SmaI双酶切组中选大片度进行回收纯化。SalI酶切后产生3’-GCTG，能够与XhOI酶切后产生的粘性末端进行配对。通过连接，可以构建出含有2个SLN基因序列的重组质粒，此时连接处的SalI和XhOI酶切位点消失，保证了pET-2SLN上SalI和XhOI酶切位点的独一性(见图5)。

在此基础上可以构建出含有3或4个拷贝SLN基因的重组质粒。

用于检测pET-2SLN的引物序列如下：

pSLNI(上游引物)：5’-ACTGTCGACCTTCTGTAAGTGATTCGAGC-3’

pSLNII(下游引物)：5’-TTAAGCGGCCGCTCGTGCAG-3’

3、重组质粒pYA-2SLN的构建与鉴定

用EcoRI和XhOI双酶切pET-2SLN质粒，用EcoRI和Sal I穿梭质粒pYA3493(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Kang，H.Y.，J.Srinivasan，and R.Curtiss III.2002.Immune responsesto recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by live attenuated Salmonella enterica serovarTyphimurium vaccine.Infect.Immun.70：1739-1749)，回收纯化后用T₄DNA ligase连接，16℃水浴12h，电转化大肠杆菌x 6097(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Nakayama，K.，S.M.Kelly，and R.Curtiss III.1988.Construction of an Asd+expression-cloning vector：stablemaintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain.Bio/Technology 6：693-697)感受态细胞，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、200rpm/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pYA-2SLN，其物理图谱见图5。鉴定结果证实构建的重组质粒pYA-2SLN是正确的(见图6)，重组质粒pYA-2SLN构建流程如图7所示。回收纯化后用T₄DNA ligase连接，16℃水浴12h，将连接产物转化至大肠杆菌DH5_α感受态细胞于37℃下培养12h后挑取单菌落到LB液体培养基上，于37℃、200rpm/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pYA-2SLN，其物理图谱见图5。鉴定结果证实本实施例构建的转移质粒pYA-2SLN是正确的(见图6)，转移质粒pYA-2SLN构建流程如图7所示。

用于检测pYA-2SLN的引物序列如下：

pYASLNI：5’-GCTGAAGAATTCGAGCTCCGTCGACCTTC-3’

pYASLNII：5’-CTTGGGAGCTTGGCTGCAGGTCGAG-3’

实施例3表达SLN基因片段的猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN重组菌株的构建

将重组穿梭质粒pYA-2SLN(来源见实施例2)电转化(参数：电压2.0KV，时间4ms，电容25μF和脉冲电阻200欧姆)至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株，在DAP阴性平板上进行筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，并用引物pYASLNI/pYASLNII进行PCR鉴定(PCR反应体系(25μL)：10×Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl₂ 2μL，2μmol/L dNTPs 1μL，10μg/mL上、下游引物各1μL，2U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，无菌水16μL，模板1μL。PCR反应条件：94℃变性4min；然后进入25个循环，94℃30s、56℃30s、72℃60s；最后72℃延伸10min。PCR产物在1.0％琼脂糖凝胶上80V电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像***扫描照相)，其结果分别见图8A、图8B和图8C所示。结果表明获得含有pYA-2SLN质粒的沙门氏菌C500的重组菌株是正确的，申请人将其命名为猪霍乱沙门氏菌株(Salmonellacholeraesuis)C500/pYA-2SLN并送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)用于专利程序的保藏(保藏信息见《发明内容》所述)。

实施例4表达SLN基因片段的重组菌株C500/pYA-2SLN的生物学特性

1、SLN基因片段大肠杆菌表达产物鼠抗血清的制备

将pET28a-2SLN质粒进行序列测定，证实克隆正确后，转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含有卡那霉素(Kan，终浓度为50μg/mL)平板上挑取阳性转化子到液体LB培养基，37℃、200rpm/min培养至对数生长期(OD＝0.6-1.0)加入IPTG(终浓度1mM)进行诱导表达4h，按厂家操作说明书，使用组氨酸融合蛋白提取试剂盒HIS-Bind Purification Kit(该试剂盒购自美国Qiagen公司)对pET28a-2SLN表达产物进行纯化，获得浓度为230μg/mL的融合表达蛋白，命名为2SLN-Pro。将100μg表达产物2SLN-Pro与等体积弗氏完全佐剂均匀混合，皮下注射BALB/C小鼠，分别在3周(二免)和5周(三免)后各加强免疫1次(使用弗氏不完全佐剂)。在3免后10d采血，提取血清，0.22μm滤膜过滤除菌，置-20℃备用。

2、C500(pYA-2SLN)重组菌株的表达特性分析

挑取重组菌株C500/pYA-2SLN的单菌落在LB液体培养基中，37℃、200rpm/min培养16h，8,000r/min离心收集菌体，进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，方法参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版)，并使用鼠抗HIS-SLN血清进行Western-blotting分析(方法参照J.萨姆布鲁克等[美]，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2003年，第三版)。结果表明本发明制备的C500/pYA-2SLN能表达大小分别为37.67kDa的重组蛋白(命名为Cpro-2SLN)，且表达的重组蛋白具有良好的免疫学反应原性(见图9)。

3、重组菌株C500/pYA-2SLN的表型鉴定

将重组菌株C500/pYA-2SLN与亲本株C500划线接种于LB平板，然后转接麦芽糖、葡萄糖、乳糖、蔗糖、鼠李糖、甘露糖、***糖等碳源及H₂S等生化鉴定管进行生化反应。结果表明重组菌株C500(pYA-2SLN)的生化特性与亲本株C500一致。两者均不能产生H₂S，不能利用乳糖、蔗糖、***糖和尿素，但是能够利用麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖、和甘露糖为唯一炭源。结果表明重组菌株C500(pYA-2SLN)的生化特性与亲本菌株C500一致，符合猪霍乱沙门氏菌的典型表型特征。

4、重组菌株C500/pYA-2SLN的生长特性分析

将重组菌株C500/pYA-2SLN在LB平板37℃培养12h，菌落其直径约为1.8mm，较亲本比C500株(2.1mm)稍小。亲本株C500与C500/pYA-2SLN重组菌株从10⁶CFU/ml开始培养，每1h取样，并进行活菌计数。结果显示，重组菌株C500/pYA-2SLN生长速度稍慢于亲本株C500，其平均世代间隔(Mean generation time)为30.3min，较亲本株(27.9min)延长2.4min。

5、重组菌株C500/pYA-2SLN的遗传稳定性

将本发明制备的C500/pYA-2SLN重组菌株在LB固体平板上划线培养，挑取单菌落到LB液体培养基中，37℃，200r/min培养16h，按体积比1∶1,000的比例转接到LB液体培养基中培养12h，再次按1∶1,000的比例转接到LB液体培养基中，连续进行10次转接。用引物pSLNI/pSLNII进行PCR扩增，扩增质粒在重组菌中的遗传情况。结果(见图10)表明，每次扩增的结果均无可见差别，表明本发明制备的C500/pYA-2SLN重组菌株能够稳定遗传。

实施例5利用重组菌株C500/pYA-2SLN制备二价基因工程疫苗

将获得的C500/pYA-2SLN重组菌株进行鉴定，每代接种于LB培养基上，利用引物pSLNI/pSLNII进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经20次传代后发现仍然能扩增出大小分别为980bp片段，遗传性稳定。通过Western-blotting检测发现，Cpro-2SLN重组蛋白可以在重组菌株C500/pYA-2SLN中稳定表达，并具有良好的免疫学反应原性。该重组菌株C500/pYA-2SLN在LB固体培养基上培养，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，直到活菌浓度达到2.5×10¹⁰CFU/mL。将细菌液离心后按细菌液(本发明的重组菌菌液C500/pYA-2SLN)：明胶保护剂(体积∶体积)为2∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，用生理盐水溶解并进行活菌计数(CFU)，并确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

实施例6重组菌株C500/pYA-2SLN在小鼠体内的免疫效力检测

1、小鼠的免疫程序：

使用5-6周龄的BALB/c小鼠作为免疫效力评价，根据试验要求分为3组，分别为本发明制备的重组菌株C500/pYA-2SLN疫苗组、C500亲本菌株疫苗组和非免疫空白对照组。免疫途径为口服0.2mL(含2.5×10⁹CFU活菌量)细菌液或LB培养基，14天后加强免疫1次。分别于免疫前0天、首免后14天和28天检测沙门氏菌血清抗体(ELISA，操作方法参照徐引弟.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致死***的构建及应用.[博士学位论文].武汉：华中农业大学图书馆，2006.)。同时以实施例4中制备的组氨酸融合表达产物2SLN-Pro为抗原(1750ng/孔)包被ELISA板，按间接ELISA方法(方法参照柳忠辉和吕昌龙，免疫学常用实验技术，北京：科学出版社，2002)检测Cpro-2SLN重组蛋白IgG和IgA抗体水平。

2、免疫小鼠体液免疫抗体水平检测

小鼠免疫前分离小肠，第二、三次分离小肠分别在首免后14、28天进行，每组选取5只经分离小肠，加入PBS，研磨后离心取上清。分别检测抗沙门氏菌抗体、Cpro-2SLN特异性IgA抗体取平均值。结果见表3。从表3中可以看出，首免后第2周本发明的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗组和C500亲本菌株组沙门氏菌抗体的OD630值为1.30和1.28，二免后2周(即首免后4周)，本发明的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗组和C500亲本菌株组沙门氏菌抗体的OD630值分别升至在1.83和1.76。首免2周本发明的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗组CPro-2SLN特异性抗体的OD630值为0.81，二免后2周，本发明的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗组Cpro-2SLN抗体的OD630值上升到1.26。而同步进行的对照C500亲本菌株组和PBS对照组一免和二免的抗体OD630值分别为0.36到0.41和0.24到0.23。上述结果表明本发明制备的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗免疫小鼠后能诱导机体产生特异性的抗沙门氏菌和猪传染性胃肠炎的体液免疫应答。

表3本发明制备的重组菌C500/pYA-2SLN疫苗免疫小鼠肠道IgA抗体检测(ELISA法)

实施例7重组菌C500/pYA-2SLN二价基因工程疫苗在猪体内的免疫效力

自2009年1月份以来，先后在A、B、C和D猪场口服免疫约2.9万头份的重组疫苗。A场未用该苗前，仔猪病死率约为60％。口服本发明的二价基因工程疫苗后，存活率为99％。发病的仔猪口服疫苗后，在24-48小时内腹泻等症状消失。其他各场口服本发明的二价基因工程疫苗后，也收到与A场相似的效果。

序列表

<110>华中农业大学

<120>表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌株及应用

<130>

<141>2009-09-10

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>441

<212>DNA

<213>猪传染性胃肠炎病毒

<220>

<221>gene

<222>(1)..(441)

<223>

<400>1

actgtcgacc ttctgtaagt gattcgagct ttttcagtta cggtgaaatt ccgttcggcg    60

taactgatgg accacggtac tgttacggtg gcggtggctc tggcggaggt gggagcggcg    120

gtggtggcag ccaattcctt cagcagatta atgcctatgc tcgtccatca gaagtagcaa    180

aagaacagag aaaaagaaaa tctcgtggtg gtggcggttc tggcggaggt ggcagcggcg    240

gtggcggttc tggtatgaag cgtagtggtt atggtcaacc catagcctca acattaagta    300

atattactct accaatgcag gatcacaaca ccgatgtata ctgtattcgt tctgaccaat    360

tttcagttta tgttcattct acttgcaaaa gtgctttatg ggacaatatt tttaagcgaa    420

actgcacgag cggccgctta a                                              441

Claims (5)

1.一株表达猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的重组猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholoraesuis)C500/pYA-2SLN，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M209189。

2.一种重组猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN的制备方法，它包括下列步骤：

1)人工合成猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因片段SLN：通过两个柔性的Linker序列把猪传染性胃肠炎病毒的两个主要的产生中和抗体的A、D抗原位点和N321抗原位点按照顺序为：D抗原位点→Linker→N321抗原位点→Linker→A抗原位点顺序连接起来，合成猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点基因片段SLN，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；

2)构建重组质粒pET-2SLN：将合成后的SLN序列亚克隆至pET-28a载体后，采用SalI和XhOI对质粒pET-SLN进行酶切和连接，构建得到2个拷贝的SLN片段；

3)构建重组质粒pYA-2SLN：将构建好的2个拷贝的SLN基因片段从重组质粒pET-2SLN酶切连接质粒pYA3493后，电转化至猪霍乱沙门氏菌C500ΔcrpΔasd缺失株，得到保藏编号为CCTCC NO：M209189的重组猪霍乱沙门氏菌C500/pYA-2SLN。

3.一种合成的猪传染性胃肠炎病毒主要抗原位点的基因片段SLN，其特征在于，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

4.包含权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌菌液和明胶的猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎二价基因工程疫苗。

5.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌和猪传染性胃肠炎二价基因工程疫苗中的应用。

Images