CN102727495A - 血根碱盐酸盐的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及血根碱盐酸盐的新用途,具体涉及血根碱盐酸盐在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。经体内、外抗甲状腺癌试验,确认本品体外对甲状腺癌细胞具有抑制或杀灭作用,对人类***状甲状腺癌细胞IHH-4、人未分化甲状腺癌细胞ASH-3生长的IC50分别为1.44μmol/L、2.62μmol/L,可使甲状腺癌细胞存活率降低至10%以下;裸鼠体内抗癌实验中,血根碱盐酸盐对移植瘤的抑制率可达80.81%。
Description
技术领域
本发明涉及医药用途领域,具体涉及血根碱盐酸盐在制备治疗癌症方面的新用途。
背景技术
甲状腺癌(Thyroid cancer)是由数种不同生物学行为以及不同病理类型的癌肿组成,主要包括***状腺癌、滤泡状癌、未分化癌、髓样癌四种类型。它们的发病年龄、生长速度、转移途径、预后都明显不同,如***状腺癌术后10年生存率将近90%,而未分化癌变程很短,一般仅生存几月。
甲状腺癌大约占所有癌症的1%,在地方性结节性甲状腺肿流行区,甲状腺癌特别是低分化甲状腺癌的发病率也很高。据国际癌症学会资料统计,各国甲状腺癌的发病率逐年增加。我国上海市1960年发病率为1.02/10万,1978年已升高对3.80/10万。据上海医科大学附属中山、华山医院统计,两院于1975-1985年共收治甲状腺疾患6432例,其中甲状腺肿瘤4363例,甲状腺癌占435例,为甲状腺全部肿瘤的10.1%。
甲状腺癌以女性发病较多,男女之比1∶2.58,以年龄计,从儿童到老年人均可发生,但与一般癌肿好发于老年人的特点不同,甲状腺癌较多发生于青壮年,其平均发病年龄为40岁左右。
由于甲状腺癌有多种不同的病理类型和生物学特性,其临床表现也因此各不相同。它可与多发性甲状腺结节同时存在,多数无症状,偶发现颈前区有一结节或肿块,有的肿块已存在多年而在近期才迅速增大或发生转移。有的患者长期来无不适主拆,到后期出现颈***转移、病理性骨折、声音嘶哑、呼吸障碍、吞咽困难甚至Horner综合征才引起注意。局部体征也不尽相同,有呈甲状腺不对称结节或肿块,肿块或在腺体内,随吞咽而上下活动。待周围组织或气管受侵时,肿块即固定。
从病理角度分,甲状腺癌主要有以下几种:
1、***状腺癌:
***状腺癌是甲状腺癌中最常见的类型,约占70%。大小不一。一般分化良好,恶性程度低。癌组织脆软易碎,色暗红;但老年患者的***壮癌一般较坚硬而苍白。***状癌的中心常有囊性变,囊内充满血性液。有时癌组织可发生钙化,切面呈砂粒样。上述囊性变和钙化与癌肿的恶性程度与预后无关。
显微镜下见到:癌瘤由柱状上皮***状突起组成,有时可混有滤泡样结构,甚至发现***状向滤泡样变异的情况。***状腺癌叶有完整的包膜,到后期同样可以穿破包膜而侵及周围组织,途径主要是淋巴道,一般以颈***转移最为常见,约在80%的儿童和2%的成年患者可扪及***,其次是血液转移到肺或骨。
2、滤泡状腺癌:
较***状腺癌少见,约占甲状腺癌的20%,居第二位,其患者的平均年龄较***状癌者大。癌肿柔软,具弹性,或橡皮样,呈圆形、椭圆形或分叶结节形。切面呈红褐色,可见纤维化、钙化、出血及坏死灶。
分化良好的滤泡状腺癌在镜下可见与正常甲状腺相似的组织结构,但有包膜、血管和***受侵袭的现象;分化差的滤泡状腺癌则见不规则结构,细胞密集成团状或条索状,很少形成滤泡。播散途径虽可经淋巴转移,但主要是通过血液转移到肺、骨和肝。有些滤泡状腺癌可在手术切除后相隔很长时间才见复发,但其预后不及***状腺癌好。
3、甲状腺髓样癌:
占甲状腺癌的2~5%。此病由Hazard于1959年首先描述,具有分泌甲状腺降钙素以及伴发嗜铬细胞瘤和甲状腺腺增生(II型多发性内分泌肿瘤,MEN II)的特点。髓样癌源自甲状腺胚胎的鳃后体(ultimobranchial body),从滤泡旁明亮细胞(C细胞)转变而来。滤泡旁细胞是来源于神经嵴的内分泌细胞,这些内分泌细胞具有一种共同的功能,即能摄取5-羟色胺和多巴胺等前体,并经其中的脱羧酶予以脱羧,所以也称为胺前体摄取脱羧细胞(amine precursor uptake anddecarboxylation),简称APUD细胞。肿瘤多为单发结节,偶有多发,质硬而固定,有淀粉样沉积,很少摄取放射性碘。癌细胞形态主要由多边形和梭形细胞组成,排列多样化。
4、甲状腺未分化癌:
占甲状腺癌的5%,主要发生于中年以上患者,男性多见。肿块质硬而不规则,固定,生长迅速,很快弥漫累及甲状腺,一般在短期内就可浸润气管、肌肉、神经和血管,引起吞咽和呼吸困难。肿瘤局部可有触痛。
显微镜下见癌组织主要由分化不良的上皮细胞组成,细胞呈多形性,常见核***相。颈部可出现***肿大,也有肺转移。该病预后差,对放射性碘治疗无效,外照射仅控制局部症状。
在过去的几年里,出现了多种新的诊断和治疗方法。其中,大剂量放射性碘治疗和维甲酸诱导再分化治疗较为有效。尽管许多分化型甲状腺癌有一个相对良性的病程,但那些丧失积聚放射性碘能力的癌症患者的治疗仍是一个难题。
血根碱(Sanguinarine,SAN),如式II所示,异名为假白屈菜季铵碱,其CAS登录号为2447-54-3,分子式为C20H14NO4,分子量为332。血根碱主要存在于白屈菜的全草、紫堇的块根、博落回的全草、血水草的地上部分。
血根碱盐酸盐(Sanguinarine Chloride),又称为血根氯铵,氧化血根碱,氯化血根碱。如式I所示,CAS登录号为5578-73-4,分子式为:C20H14ClNO4,分子量:367.78。
由于血根碱广泛的药理作用,已经被中医和北美的传统医学使用了几个世纪。
血根碱通常作为中药用于治疗各种疾病,其中包括如下癌症:
胰腺癌:Duke(1985)研究发现,血根碱对于胰腺癌有治疗作用,试验证明,血根碱能显著抑制胰腺癌细胞AsPC-1和BxPC-3的生长、发育,及其菌落的形成能力;Haseeb Ahsan(2007)也证实,血根碱可以通过调节Bcl-2蛋白的途径达到诱导人胰腺癌细胞AsPC-1和BxPC-3的凋亡;
人口腔上皮细胞癌:Hang等(2007)研究表明,经过24h的暴露,和对照组相比,添加2pM和3pM血根碱组表现出了对于KB癌细胞(人口腔上皮细胞)的毒性作用,MTT分别降低至83%和52%;血根碱还能抑制KB癌细胞的菌落形成和生长能力。另外,添加2pM和3uM血根碱组明显表现出诱导KB细胞凋亡的作用;
黑色素瘤:K1735-M2细胞为黑色素瘤细胞,被认为是转移性黑色素瘤的一个好的模型,Teresa L等(2008)发现,血根碱可以杀死K1735-M2细胞和阻碍其增殖;
乳腺癌:Holy J等(2006)证明血根碱通过裂解MCF-7细胞周期蛋白的核质运输的途径来抑制乳腺癌;
肝癌:黄馨慧等(2001)试验发现,血根碱能抑制SMM C-7721人肝癌细胞增殖,对肝癌细胞具有明显的杀伤作用;CN200810105012.5公开了5μg/ml的血根碱对人肝癌细胞HEPG-2的抑制率为98%。
曾有报道,乙氧基血根碱(ethoxysanguinarine)具有较好的抗菌、抗炎作用,尤对***疗效显著。对***、甲状腺肿瘤等亦显示了一定疗效。
目前,国内外尚未发现血根碱盐酸盐在制备治疗甲状腺癌药物中应用的报道。
发明内容
本发明目的在于提供血根碱盐酸盐的新用途。
具体的,本发明提供了血根碱盐酸盐在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。
优选地,甲状腺瘤为***状腺癌或未分化甲状腺癌。
所述血根碱盐酸盐,在应用时,可与药学上可接受的载体或稀释剂组成制剂。
所述制剂选自片剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、控释剂、微囊剂、脂质体、混悬剂、乳剂、注射液、大输液或冻干制剂等常规剂型。
所述药学上可接受的载体或稀释剂选自淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、氯化钠、葡萄糖、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁或滑石粉中的一种或几种。
本发明应用于人体剂量拟定约为0.01~1g/日。
本发明的优点在于:
1)提供了血根碱盐酸盐的新用途,拓展了血根碱盐酸盐的治疗领域;
2)本发明的产品原料来源丰富,制备工艺简单,可做成常规制剂,如片剂、胶囊、注射剂等,使用方便;
3)经体内、外抗甲状腺癌试验,确认本品体外对甲状腺癌细胞具有抑制或杀灭作用,对人类***状甲状腺癌细胞IHH-4、人未分化甲状腺癌细胞ASH-3生长的IC50分别为1.44μmol/L、2.62μmol/L,可使甲状腺癌细胞存活率降低至10%以下;裸鼠体内抗癌实验中,血根碱盐酸盐对移植瘤的抑制率可达80.81%;
4)裸鼠体内抗癌实验中,血根碱盐酸盐对移植瘤的抑制率可达80.81%;
5)药效实验同时证实:血根碱盐酸盐的抗甲状腺癌的效果优于乙氧基血根碱。
附图说明:
图1:1.5μmol/L血根碱盐酸盐处理不同时间对IHH-4细胞和ASH-3细胞存活率的影响(n=6);
图2不同浓度血根碱盐酸盐处理后IHH-4细胞和ASH-3细胞克隆形成的影响,与对照组比,*P<0.05。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。实施例1:血根碱盐酸盐片
1、处方:血根碱盐酸盐30g、淀粉60g,硬脂酸镁2g。
2、制备方法:按照处方量称取原辅料,按照等量递加法混匀,直接压片,制成1000片。
3、用法用量:口服,每次1片,每日3次。
实施例2:血根碱盐酸盐胶囊
1、组方:血根碱盐酸盐30g、10%羟丙甲基纤维素32ml(10%是10g/100ml)。
2、制备方法:称取于原辅料,制粒、整粒,灌装,制成1000粒胶囊。
3、用法用量:口服,每次1粒,每日3次。
实施例3:血根碱盐酸盐大容量注射液
1、血根碱盐酸盐40mg,氯化钠2.25g,制成血根碱盐酸盐氯化钠注射液,其规格为250ml;
称取原辅料,加入100ml注射用水,充分搅拌使溶解,加入5-10g活性炭加热煮沸15-30分钟,将药液循环降温至40-50℃,脱炭过滤;调节pH至6.3-8.3,加注射用水至250ml,灌装,灭菌,灯检,即得。
2、血根碱盐酸盐40mg,葡萄糖12.5g,制成血根碱盐酸盐葡萄糖注射液,其规格为250ml:
称取原辅料,加入100ml注射用水,充分搅拌使溶解,加入5-10g活性炭加热煮沸15-30分钟,将药液循环降温至40-50℃,脱炭过滤;调节pH至6.0-8.0,加注射用水至250ml,灌装,灭菌,灯检,即得。
3、用法用量:静脉注射,每次1瓶,每日一次。
实施例4:血根碱盐酸盐注射液
1、组成:血根碱盐酸盐20g、注射用水的20g、甘露醇3g。
2、制备方法:取血根碱盐酸盐20g,加适量的注射用水,用碳酸钠调pH值至7,搅拌溶解,再加相当于取血根碱盐酸盐10-15%量注射用的甘露醇,除菌滤过,测定含量,分装1000支,20mg/支,封口,即得。
3、用法用量:静脉注射,每次40mg,每日一次。
以下是对血根碱盐酸盐进行的药效实验研究。
实施例5:体外抗癌实验
采用抗癌物质活性的改良MTT法及克隆法测定细胞克隆形成。
1、材料:
癌细胞株:IHH-4:人***状甲状腺癌细胞;ASH-3:人未分化甲状腺癌。
血根碱盐酸盐:采用实施例4制备的药物,由申请人提供;
乙氧基血根碱:购自长沙上禾生物科技有限公司,20mg/支。
2、细胞培养:
IHH-4细胞系和ASH-3细胞系应用RPM I1640培养基进行单层培养:
培养基中添加10%(v/v)的胎牛血清(FBS)、50U/mL青霉素和50U/mL链霉素,将生长于对数生长期的IHH-4细胞系和ASH-3细胞系通过0.25%胰酶-EDTA消化液进行消化,收获细胞,并且重悬于培养基中,细胞的终浓度为1×105/mL;将细胞悬液(每孔200μl)均匀接种于96孔细胞培养板中,在37℃含5%CO2的环境下培养24h。
3、MTT法检测血根碱盐酸盐对癌细胞生长的影响
3.1在同一时间不同浓度血根碱盐酸盐对癌细胞生长的影响
两种细胞分别加入浓度分别为0、0.1、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.5和5.0μmol/l的血根碱盐酸盐,并以5.0μmol/l乙氧基血根碱作对照。每一浓度设6复孔。然后在细胞继续培养24h后,加入20μl浓度为5mg/ml的MTT,再培养4h后轻轻吸掉培养基。加入100μl DMSO,振荡溶解10min。在酶标仪上选取570nm波长测定吸光度值,对照组细胞存活率设为100%,其余各组细胞存活率=(各浓度组吸光度值/对照组吸光度值)×100%。
3.2同一浓度血根碱盐酸盐在不同时间对细胞生长的影响
细胞同上法培养24h后,加入1.5μmol/l的血根碱盐酸盐和乙氧基血根碱后分别于12、24、36、48和60h时测定细胞存活率,其他实验步骤同3.1中所述。
4、克隆形成法检测细胞存活率
对数生长期细胞制备单细胞悬液,调整细胞浓度至1×106个/ml,将IHH-4细胞和ASH-3细胞分别接种于直径为60mm的培养皿中,培养24h后加入0、0.1、0.5、1.0、2.0和3.0μmol/l的血根碱盐酸盐,每一浓度设3个复孔。继续培养24h后用胰酶消化制备单细胞悬液,以500个细胞/皿接种至60mm的培养皿,每个计量点设3个平行样,培养14d后经PBS漂洗、甲醇固定、Gimsa染色。在显微镜下计数,含50个细胞以上的细胞集落作为一个克隆计数。
5、统计学处理
所有实验均重复3次以上,结果均以表示。采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析;组间比较采用方差分析。
6、实验结果(见表1和图1、2):
6.1不同浓度血根碱盐酸盐对IHH-4细胞和ASH-3细胞生长的影响:结果见表1、图1。
与对照组(0μmol/L)相比,△P<0.05,△△P<0.01,△△△P<0.001;与乙氧基血根碱相比,#P<0.05,##P<0.01。
从表1可以看出:与对照组即血根碱盐酸盐的浓度为0μmol/L相比,不同浓度血根碱盐酸盐对甲状腺癌细胞显示出明显的抑制作用(P<0.05,P<0.01,P<0.001);与乙氧基血根碱相比,当血根碱盐酸盐的浓度为5.0、2.5、2.0μmol/L时,对IHH-4细胞的抑制作用具有明显的差异(P<0.05,P<0.01);当血根碱盐酸盐的浓度为5.0、2.5μmol/L时,对ASH-3的抑制作用具有明显的差异(P<0.01,P<0.05)。
由IHH-4、ASH-3细胞存活率回归计算半数抑制浓度(IC50)为1.44μmol/L、2.62μmol/L。
从图1可以看出:不同浓度的血根碱盐酸盐对IHH-4细胞和ASH-3细胞克隆数的影响明显不同,浓度越高杀灭癌细胞的作用越强。
6.2同一浓度血根碱盐酸盐在不同时间对细胞生长的影响
从图2可以看出:随着时间的延长,血根碱盐酸盐对人***状甲状腺癌细胞和人未分化甲状腺癌的杀灭作用呈明显的依赖关系。
7、实验小结:体外实验表明血根碱盐酸盐对甲状腺癌细胞有明显杀灭作用,作用强度与剂量和时间相关。
实施例6:对裸鼠甲状腺移植瘤的影响
1、材料
癌细胞株:IHH-4,人***状甲状腺癌细胞;
血根碱盐酸盐:采用实施例4制备的药物;
乙氧基血根碱对照品(98.0%):购自长沙上禾生物科技有限公司,20mg/支;
注射用环磷酰胺(CTX):购自江苏恒瑞医药股份有限公司,100mg/支。
2、动物模型建立
动物准备:五周龄雌性裸鼠(品系:BALB/c),体重18-20g,吉林大学实验动物中心SPF级动物实验室饲养。给予灭菌处理的饲料和水,适应性饲养一周,并观察全身情况,证实裸鼠健康。
动物接种:
1)将对数生长期的甲状腺***状癌IHH-4细胞0.1ml约5×105个种植于裸鼠右侧侧胸部皮下。
2)7d后种植部位有硬结,14d肿瘤长成,肿瘤平均长径约0.65cm,开始实验。
3)分组:
按肿瘤大小随机将裸鼠分成血根碱高剂量组(10mg/kg)、中剂量组(3mg/kg)、低剂量组(1mg/kg),乙氧基血根碱组(10mg/kg)、阳性对照CTX组(30mg/kg)及阴性对照组(即模型组)。每组10只。
4)处理:
血根碱盐酸盐及乙氧基血根碱、阳性对照组以生理盐水溶解并稀释为相应浓度。
(1)治疗组给予50ul血根碱灌胃,每日一次,共5周;
(2)阴性对照组裸鼠接受等量(50ul)空白溶剂灌胃处理,每日一次,共5周;
(3)每周测量裸鼠体重;
(4)五周后动物处死解剖,完整取出肿瘤组织,称重;
(5)肿瘤生长抑制率(抑瘤率)=(W对照组-W治疗组)/W对照组×100%。
3、统计学方法:
4、实验结果见表2:
与阴性对照组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与乙氧基血根碱组比,△P<0.05。
从表2可以看出:与阴性对照组比较,CTX、乙氧基血根碱与血根碱盐酸盐各剂量组对裸鼠移植瘤均有不同程度的抑瘤作用;与乙氧基血根碱组相比,血根碱盐酸盐高、中剂量组抑瘤作用明显优于乙氧基血根碱(P<0.05)。
实验小结:体内实验表明血根碱盐酸盐对裸鼠移植瘤具有良好抑瘤作用,作用强度与剂量相关。
结论:通过体内外实验证明,血根碱盐酸盐对甲状腺癌有显著抑制或杀伤作用,其作用强度与剂量及作用时间有关。
虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (5)
1.血根碱盐酸盐在制备治疗甲状腺癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,该甲状腺癌为***状腺癌或未分化甲状腺癌。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于所述血根碱盐酸盐为与药学上可接受的载体或稀释剂组成的制剂。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述制剂选自片剂、丸剂、胶囊剂、滴丸、控释剂、微囊剂、脂质体、混悬剂、乳剂、注射液、大输液或冻干制剂。
5.根据权利要求3所述的应用,其特征在于所述药学上可接受的载体或稀释剂选自淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联羧甲基纤维素钠、氯化钠、葡萄糖、羟丙甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁或滑石粉中的一种或几种。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121017 |