CN101797242A - 半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用。本发明提供的半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用，通过低剂量的半胱胺增进癌细胞对化疗药物的敏感性，从而实现了通过低剂量的化疗药物有效杀死癌细胞。本发明大大提高化疗药物的药效，降低了化疗的副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用。
背景技术
化疗是目前临床治疗癌症非常有效和常用的方法。但严重的副作用和癌细胞的抗药性往往会导致治疗的中断或者失败。现在常用的化疗药物及相应的副作用有：环磷酰胺(CTX)副作用为骨髓抑制、***；异磷酰胺(IFO)副作用为***、骨髓抑制；顺铂(DDP)副作用为肾脏毒性、消化道反应、耳毒性、神经毒性；卡铂(CARBO)副作用为骨髓抑制；米托蒽醌(Mx)副作用为心脏毒性、骨髓抑制；氨甲蝶呤(MT)副作用为肾毒性、肺纤维化、口腔溃疡；阿糖胞苷(Ara-C)副作用为肝损害；博来霉素(BLM)副作用为肺纤维化；平阳霉素(PYM)肺纤维化；紫杉醇(TAXOL)副作用过敏、心脏传导障碍、末梢神经炎；长春新碱(VCR)末梢神经炎，外渗皮肤损害；5-氟尿嘧啶(5-FU)副作用为腹泻；鬼臼素(足叶乙甙，VP-16)副作用为骨髓抑制；和美新(TOPO)副作用为骨髓抑制；阿霉素(ADR)副作用为心脏毒性、骨髓抑制、消化道和肾脏毒性等。
因此出现大量复合的抗癌药物或者组合抗癌药，其中专利有CN101040859A、CN101495148A、CN101040959A、CN101273963A、CN101495148A等；这些组合要的成分涉及到烷化剂、抗代谢物类药物、抗生素类抗癌药、植物生物碱类药物、蒽二酮类药物、天然产物、激素、激素拮抗剂和其它药物：放射增敏剂铂配位复合物肾上腺皮质抑制剂免疫抑制剂功能性治疗剂基因治疗剂反义治疗剂酪氨酸激酶抑制剂单克隆抗体免疫毒素放射性免疫缀合物癌症疫苗干扰素白细胞介素取代脲类紫杉烷类COX-2抑制剂。
半胱胺又称β一疏基乙胺(简称CS)，可从动物毛发中提取，也可化学合成，作为半胱氨酸的脱羧产物，半胱胺是辅酶A分子的组成成分及动物体内的生物活性物质，在体内具有重要的生理作用。半胱胺在家禽生产中的应用有调节激素水平，促进动物生长；提高营养物质的消化代谢；提高动物机体免疫力。半胱胺在现今临床医疗中的应用有治疗白内障和胱氨酸病，放射病综合征，急性和慢性金属中毒。
发明内容
本发明是针对化疗效果和严重副作用，提供半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用。
利用半胱胺添加到目前使用的化疗药物中可制成新的治疗癌症的组合药剂。这种组合药剂使用时可降低化疗药物的有效剂量即可达到治疗效果，从而降低化疗药物产生的副作用。
本发明还提供一种治疗癌症的组合药剂，其有效成分包括半胱胺和化疗药物。
所述治疗癌症的组合药剂中还包括医学上可接受的辅料。
本发明组合药物的两种成分可以一起给药或分开给药，药剂形式可以是，但不限于：片剂、膏剂、胶囊、粉剂、注射剂、溶液剂等。
本发明制备出的抗癌组合药剂可以通过以下方式给药：
局部给药(topical)：直接用药于要影响的身体部位，包括：表皮给药，吸入给药，灌肠给药。
消化道给药(enteral)：口服给药，本技术中的增敏剂和化疗药物可以制成片剂、胶囊、药水等，其他的还有插管、***给药等。
非消化道给药(parenteral)：静脉注射，动脉注射，肌肉注射，皮下注射，骨髓注射，皮内注射，透皮给药，粘膜给药，吸入给药等。
其他给药方式：腹腔注射、硬膜外腔注射、脊髓注射、眼球玻璃体注射等。
本治疗癌症的药物可以分开给药，组分半胱胺优选的给药方式有：静脉注射、肌肉注射等常规给药方式，因为在半胱胺治疗急性金属中毒(如四乙基铅中毒)和防治放射病的临床应用中，静脉注射被认为是首选的可靠的给药方式。而在临床上治疗慢性金属中毒的给药方式，首选为肌肉注射，所以这两种注射方式是被临床验证的，半胱胺安全、可靠的给药方式，只是根据吸收速率等的不同，需要依临床实例进行选择。另外高剂量半胱胺可能会引起胃溃疡，所以在高剂量给药的情况下尽量避免口服给药。
该治疗癌症的组合药剂可以用于治疗人体各种实体瘤：包括起源于大脑、中枢神经***、肾脏、肝、胆囊、头颈部、口腔、甲状腺、皮肤、黏膜、腺体、血管、骨组织、***、肺脏、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宫、卵巢、子宫内膜、子宫颈、***、膀胱、结肠、直肠的原发或转移的癌或肉瘤或癌肉瘤的药物。
本治疗癌症的组合药剂虽没有应用于临床，但细胞实验证明，在使用半胱胺和化疗药剂时，化疗药剂可比单使用化疗药剂是减量。医生可根据具体对患者的病情了解和化疗效果，在安全剂量下确定剂量。组分半胱胺临床用于治疗急性金属中毒和防治放射病剂量，一般是静脉注射，剂量是0.3g/次，一天1-2次。临床使用本发明组合药剂中的半胱胺时，可以参考其临床使用安全剂量使用，在安全剂量下，使用剂量越高疗效越好。建议临床应用的剂量参考现有的临床使用剂量。比如，单独但其中组分阿霉素临床使用的剂量一般在30-100mg/m2，高剂量会达到300mg/m2，在与半胱胺共同使用时可酌情减量。
实验证明半胱胺只需协同低剂量的化疗药物便可有效的杀死癌细胞及化疗药抗性癌细胞，即证明本发明的药剂在癌细胞及抗性癌细胞的化疗中大大降低抗癌药物的使用量从而降低化疗的副作用。本发明提供的半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用，通过低剂量的半胱胺增进癌细胞对化疗药物的敏感性，从而实现了通过低剂量的化疗药物有效杀死癌细胞。本发明大大提高化疗药物的药效，降低了化疗的副作用。
利用该原理设计了本发明的抗癌药物，它包含普通化疗药物和辅剂半胱胺。抗癌药剂中半胱胺协助低剂量化疗药物杀伤肿瘤细胞和化疗药物抗性细胞，大大增强化疗药物的化疗效果从而降低化疗药物的副作用。
而由于半胱胺容易获得、价格低廉，化学成分单一且生物毒性低，更使得半胱胺的这项临床应用显得意义非凡。半胱胺作为临床药物用于白内障和胱氨酸病的治疗未发现其副作用，这也增强了此组合药物的可实施性和成功率，使本组合抗癌药物作为临床药物更具有实用性。
附图说明
图1：半胱胺引起HeLa细胞自噬(稳定表达eGFP-LC3细胞中的绿色点状聚集)
图2：半胱胺引起293A细胞自噬(稳定表达eGFP-LC3细胞中的绿色点状聚集)
图3：半胱胺引起B16，MCF细胞自噬(内源性的蛋白LC3I向LC3II型转化)
图4：半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬的时间效应
图5：半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬的剂量效应
图6：半胱胺在HeLa细胞中，导致自噬相关蛋白P62的增多
图7：高剂量半胱胺能导致细胞死亡(MTT检测法)
图8：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死HeLa细胞实验(碘化丙啶，PI染色)。
图9：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死B16细胞的实验(碘化丙啶，PI染色)。
图10：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死MCF-7细胞的实验(碘化丙啶，PI染色)。
图11：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死阿霉素抗性细胞(MCF-7/ADR细胞)的实验(碘化丙啶，PI染色)
图12：HeLa细胞中转染Atg5siRNA降低自噬水平，相应的降低自噬带来的细胞杀伤(碘化丙啶，PI染色)
图13：不同浓度的半胱胺促进浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死癌细胞(碘化丙啶，PI染色)
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、半胱胺可以HeLA癌细胞自噬【在稳定表达LC3-eGFP的人***HeLa细胞中诱导细胞自噬，以自噬促进剂rapmycin作为阳性对照】
实验方法：
1、筛选稳定表达LC3-eGFP的人***细胞(LC3-eGFP/HeLa)方法如下：
(1)人***细胞HeLa细胞(购自中科院上海细胞所)接种在装有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，密度约3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
(2)Lipofectamine2000每孔1.5μl，溶解在100μl无血清无抗生的素DMEM培养基中，充分混合后室温孵育5min，质粒LC3-eGFP(美国invitrogen公司)为每孔2μg，溶解在100μl DMEM无血清无抗生素的DMEM培养基(美国GIBCO公司)中，充分混合后室温孵育5min后两种溶解混合均匀，室温孵育20-25min。
(3)过夜培养的细胞用DMEM(无血清无抗生素)培养基洗涤2次后加入步骤(2)孵育过的混合物，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养条件培养30min，每孔补充培养基DMEM完全培养基300μl，继续培养。
(4)转染48hr后，细胞按1∶15稀释后转接到装有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板，并加入0.5mg/ml的G418抗生素筛选细胞(美国Sigma公司)，每三天换一次培养基。十天后在荧光显微镜下挑出稳定表达LC3-eGFP的绿色阳性克隆LC3-eGFP/HeLa细胞，待用。
2、将经步骤1筛选后获得的LC3-eGFP/HeLa细胞接种在装有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，24孔板细胞密度约为3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
3、步骤2的24孔中加入终浓度为1.5mM的半胱胺(图1中半胱胺)，诱导细胞自噬，在培养24小时后进行荧光显微镜观察拍照，以没有任何处理的细胞作为阴性对照(图1中对照)，以自噬促进剂雷帕霉素(终浓度为200nM，美国Sigma公司)作为引起自噬的阳性对照(图1中雷帕霉素)，同时用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA，终浓度为2mM)和1.5mM的半胱胺共同处理24小时来进一步证明半胱胺引起自噬的能力(图1中半胱胺+3-甲基嘌呤)。细胞转染eGFP-LC3质粒后，表达的eGFP-LC3蛋白在正常情况下均匀弥散于细胞质中，但在细胞发生自噬时，eGFP-LC3就会聚集在自噬泡的膜上形成点状聚集。
结果显示：
结果如图1所示，结果表明，1.5mM半胱胺处理LC3-eGFP/HeLa后，均匀弥散于细胞质中GFP-LC3蛋白聚集在自噬小体的膜上形成绿色的点状聚集，而且LC3点状聚集可以被自噬特异的抑制剂3-甲基嘌呤抑制(图1)，说明半胱胺引起LC3点状聚集的是细胞自噬的表现。
实施例2：半胱胺诱导293A细胞自噬【在稳定表达LC3-eGFP的人胚肾细胞293A中诱导细胞自噬，以自噬促进剂rapmycin作为阳性对照】
实验方法：
1、筛选稳定表达LC3-eGFP的人胚肾细胞(LC3-eGFP/293A)方法如下：
(1)293A人胚肾细胞(购自中科院上海细胞所)接种在装有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，密度约3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
(2)配制转染复合物，方法如下：Lipofectamine2000每孔1.5μl，溶解在100μl DMEM(无血清无抗生素)培养基中，充分混合后室温孵育5min，LC3-eGFP为每孔2μg，溶解在100μl DMEM(无血清无抗生素)培养基中，充分混合后室温孵育5min后两种溶解混合均匀，室温孵育20-25min。
(3)过夜培养的细胞用DMEM(无血清无抗生素)培养基洗涤2次后加入步骤(2)获得的转染复合物，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养条件培养30min，补充培养基DMEM完全培养基300μl，37℃，继续培养。
(4)转染48hr后，细胞按1∶15稀释后转接DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板，并加入0.5mg/ml的G418筛选细胞，每三天换一次培养基。十天后在荧光显微镜下挑出稳定表达LC3-eGFP的绿色阳性克隆，待用。
2、经筛选后的LC3-eGFP/293A细胞接种在24孔细胞培养板中，细胞密度约为3-5×104/孔，过夜培养，待用。
3、步骤2的24孔中加入终浓度为1.5mM的半胱胺(图2中半胱胺)，诱导细胞自噬，在培养24小时后进行荧光显微镜观察拍照。以没有任何处理的细胞作为阴性对照(图2中对照)，以自噬促进剂雷帕霉素(终浓度为200nM，美国Sigma公司)作为引起自噬的阳性对照(图1中雷帕霉素)，同时用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA，终浓度为2mM)和1.5mM的半胱胺共同处理24小时来进一步证明半胱胺引起自噬的能力(图1中半胱胺+3-甲基腺嘌呤)。
结果显示：
1、HeLa细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，24孔板细胞密度约为3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、分别加入终浓度为1.5mM半胱胺处理，分别在在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养0hr、5hr、12hr、18hr、24hr后收集，用细胞裂解液(购自碧云天公司)裂解细胞，再加入电泳上样缓冲液(购自碧云天公司)沸水煮10min后，制成电泳样品。然后进行12％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到尼龙膜上(购自美国Amersham公司)。用anti-LC3(Novus公司)作为一抗，anti-rabbit(Promega公司)为二抗，进行Western blot。以anti-GAPDH(美国密理博公司)作为一抗检测GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为参考来定量对照组与实验组的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是细胞内的组成型蛋白，在各个细胞内的水平一致)。
结果显示：
结果如图4所示，结果表明，半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬效果是随处理时间的延长而增强的(图4)。
实施例5：半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬的剂量效应【内源性的蛋白LC3I向自噬标志蛋白LC3II型转化】
实验方法：
1、HeLa细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，24孔板细胞密度约为3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、各孔分别加入终浓度为0.5mM、1.0mM、1.5mM或2.0mM的半胱胺，无任何处理的细胞为对照组(图5中的对照)，以自噬促进剂终浓度为200nM雷帕霉素处理(美国Sigma公司)作为引起自噬的阳性对照(图5中的雷帕霉素)，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱，细胞培养24hr后收集细胞，用细胞裂解液(购自碧云天公司)裂解细胞，再加入电泳上样缓冲液(购自碧云天公司)沸水煮10min后，制成电泳样品。然后进行12％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到尼龙膜上(购自美国Amersham公司)。用anti-LC3(Novus公司)作为一抗，anti-rabbit(Promega公司)为二抗，进行Western blot。以anti-GAPDH(美国密理博公司)作为一抗检测GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为参考来定量对照组与实验组的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是细胞内的组成型蛋白，在各个细胞内的水平一致)
结果如图2所示，结果表明，在LC3-eGFP/293A中1.5mM半胱胺就可以引起eGFP-LC3绿色点状聚集，eGFP-LC3点状聚集可以被自噬特异的抑制剂3-MA抑制(图2)，说明半胱胺引起eGFP-LC3点状聚集的是细胞自噬的表现。
实施例3：半胱胺引起黑色素瘤细胞B16和人乳腺癌MCF-7细胞自噬【内源性的蛋白LC3I(微管相关蛋白LC3I)向自噬标志蛋白LC3II型转化】
黑色素瘤细胞B16和人乳腺癌MCF-7细胞自噬时，内源性的蛋白LC3I向自噬标志蛋白LC3II型转化，因此下述通过检测内源性的蛋白LC3I向自噬标志蛋白LC3II型转化来确定黑色素瘤细胞B16和人乳腺癌MCF-7细胞是否发生自噬。
实验方法：
1、分别将黑色素瘤细胞B16(购自中科院上海细胞所)或人乳腺癌MCF-7细胞分别接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，24孔板细胞密度约为3-5×104/孔，37℃，过夜培养，待用。
2、分别加入终浓度为1.5mM半胱胺处理，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养24小时后收集，用细胞裂解液(购自碧云天公司)裂解细胞，再加入电泳上样缓冲液(购自碧云天公司)沸水煮10min后，制成电泳样品。然后进行12％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到尼龙膜上(购自美国Amersham公司)，以无任何处理的黑色素瘤细胞B16做为对照组。用anti-LC3(Novus公司)作为一抗，anti-rabbit(Promega公司)为二抗，进行Western blot。以anti-GAPDH(美国密理博公司)作为一抗检测GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为参考来定量对照组与实验组的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是细胞内的组成型蛋白，在各个细胞内的水平一致)。
结果显示：
结果如图3所示，结果表明，在黑色素瘤细胞B16和人乳腺癌MCF-7中，相对于对照，半胱胺处理后LC3II蛋白量大大增加，说明半胱胺在黑色素瘤细胞B16，人乳腺癌MCF-7中也能引起细胞自噬，因为增强内源性的蛋白LC3I向蛋白LC3II型转化是发生细胞自噬的标志(图3)。
实施例4：半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬的时间效应【内源性的蛋白LC3I向自噬标志蛋白LC3II型转化】
实验方法：
结果显示：
结果如图5所示，结果表明，半胱胺在HeLa细胞中引起细胞自噬效果是随半胱胺浓度的增加而增强的(图5)。
实施例6：半胱胺在HeLa细胞中，导致自噬底物蛋白p62的增多【以自噬抑制剂3-MA作为阴性对照】
细胞自噬能降解细胞内的错误折叠的蛋白或者受损伤的细胞器，P62蛋白也是细胞自噬的底物，细胞发生完整的自噬时会降解细胞内的p62蛋白，如果细胞自噬的下游被阻断就会阻断p62的降解，所以p62蛋白的增多可以间接的说明自噬的非完整性。
实验方法：
1.HeLa细胞接种在装有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，24孔板细胞密度约为3-5×104/孔，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2.各孔处理分别为加入终浓度1.5mM半胱胺、2mM 3-甲基腺嘌呤、1.5mM半胱胺和2mM 3-甲基腺嘌呤的组合，将未做任何处理的细胞做为对照，分别于37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养24hr后收集细胞，用细胞裂解液(购自碧云天公司)裂解细胞，再加入电泳上样缓冲液(购自碧云天公司)沸水煮10min后，制成电泳样品。然后进行12％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到尼龙膜上(购自美国Amersham公司)。用anti-p62(BIOMOL公司)为一抗，anti-rabbit(Promega公司)为二抗，进行Western blot，以anti-GAPDH作为一抗检测GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)作为参考来定量对照组与实验组的蛋白量(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是细胞内的组成型蛋白，在各个细胞内的水平一致)
结果显示：
结果如图6所示，结果表明半胱胺处理组与对照组比较自噬底物p62增多(见图6)，说明细胞自噬的下游通路可能被阻断，这对细胞的生存是有害的。
实施例7：半胱胺对细胞活力的影响【噻唑蓝法(MTT)法检测细胞死亡】
实验方法：
1、HeLa细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)96孔细胞培养板中，96孔板细胞密度约0.8-1×104/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、细胞培养板各孔中分别加入终浓度为0mM、0.5mM、1mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、4.0mM的半胱胺。37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养24hr后，按照步骤3的方法检测细胞死亡率。
3、96孔细胞经上述处理后，每孔加入5mg/ml MTT(噻唑蓝)10μl，在37℃，5％CO2培养箱中培养孵育约2-4小时后，当细胞内出现紫色晶体后，小心吸去上清液后，每孔加入100μl DMSO(二甲基亚砜)，放于暗处2小时。摇匀后，酶标仪检测其570nm处的紫外吸收。随着细胞死亡越多在570nm处的吸收值就越小，将0mM半胱胺处理的细胞的吸收值设为100％活细胞，然后按比例计算细胞存活力。
结果显示：
结果如图7所示，结果表明，低浓度半胱胺对细胞活力没有影响，高浓度的半胱胺可以导致细胞死亡(图7)。
实施例8：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死癌HeLa细胞的实验【用碘化丙碇(PI)染色法检测】
实验方法：
1、HeLa细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)96孔细胞培养板中，96孔板细胞密度约0.8-1×104/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、细胞培养板中各孔处理分别为终浓度为1.5mM半胱胺(图8中的CS)、0.75μg/ml阿霉素(图8中的Dox)、终浓度为1.5mM半胱胺和0.75μg/ml阿霉素的组合(图8中的DOX+CS)，其中以不加低剂量阿霉素(图8中的CS)和不加1.5mM(终浓度)半胱胺(图8中的DOX)为对照。培养24hr后，按照步骤3的方法检测细胞死亡率。
3、细胞用2μg/ml赫斯特(Hochest33342，购自碧云天公司)和5μg/ml碘化丙碇(PI)染色15分钟，然后在显微镜下拍照。Hochest33342专门用来染细胞核，用来计数总细胞数量，PI染死细胞，它能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜***双链DNA中，不能进入活细胞，死细胞占所有细胞的百分比为细胞的死亡率。
结果显示：
结果如图8所示，结果表明，低浓度的半胱胺和低剂量的阿霉素几乎不引起癌细胞死亡，而二者协同作用则引起HeLa细胞大量的死亡65.5±2.6％(图8)。
实施例9：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死黑色素瘤癌细胞B16的实验
实验方法：
1、黑色素瘤癌细胞B16细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)96孔细胞培养板中，96孔板细胞密度约0.8-1×104/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、细胞培养板中各孔处理分别为终浓度为1.5mM半胱胺(图9中的CS)、0.8μg/ml阿霉素(图9中的Dox)、终浓度为1.5mM半胱胺和0.8μg/ml阿霉素的组合(图9中的DOX+CS)，其中以不加低剂量阿霉素(图9中的CS)和不加1.5mM(终浓度)半胱胺(图9中的DOX)为对照。培养24hr后，按照实施例8的方法检测细胞死亡率
结果显示：
结果如图9所示，结果表明低浓度的半胱胺和低剂量的阿霉素几乎不引起癌细胞死亡，而二者协同作用则加大B16细胞的死亡21.892±1.053％(图9)。
实施例10：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死人乳腺癌MCF-7的实验
实验方法：
1、人乳腺癌MCF-7细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)96孔细胞培养板中，96孔板细胞密度约0.8-1×104/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、细胞培养板中各孔处理分别为终浓度为1.5mM半胱胺(图10中的CS)、0.8μg/ml阿霉素(图10中的Dox)、终浓度为1.5mM半胱胺和1.0μg/ml阿霉素的组合(图9中的DOX+CS)，其中以不加低剂量阿霉素(图10中的CS)和不加1.5mM(终浓度)半胱胺(图10中的DOX)为对照。培养24hr后，按照实施例8的方法检测细胞死亡率
结果显示：
结果如图10所示，结果表明，低浓度的半胱胺和低剂量的阿霉素几乎不引起癌细胞死亡，而二者协同作用则加大MCF-7细胞的死亡54.23±2.146％(图10)。
实施例11：半胱胺促进低浓度化疗药物阿霉素(doxorubicin)杀死耐药性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR的实验
实验方法：
1、筛选阿霉素耐药性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞方法如下：人乳腺癌细胞系MCF-7接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)24孔细胞培养板中，加入终浓度0.01μM的阿霉素，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱培养两个月后，再加入0.1μM的阿霉素，经第二轮筛选培养两个月后，提高药物浓度至1μM，筛选培养3个月后得到稳定的阿霉素耐药性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞。
2、将耐药性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)96孔细胞培养板中，96孔板细胞密度约0.8-1×104/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
3、细胞培养板中各孔处理分别为终浓度为1.5mM半胱胺(图11中的CS)、20μg/ml阿霉素(图11中的Dox)、终浓度为1.5mM半胱胺和20μg/ml阿霉素的组合(图11中的DOX+CS)，其中以不加低剂量阿霉素(图11中的CS)和不加1.5mM(终浓度)半胱胺(图11中的DOX)为对照。培养24hr后，按照实施例8的方法检测细胞死亡率结果显示：
结果如图11所示，结果表明，低剂量半胱胺和阿霉素几乎不引起耐药性细胞死亡，而二者协同作用则引起癌细胞大量的死亡44.23±1.8％。
实施例12：HeLa细胞中转染Atg5siRNA降低自噬水平，相应的降低自噬带来的细胞杀伤
实验方法：
1、HeLa细胞接种在DMEM培养基的(美国GIBCO公司)2个60mm的细胞培养板中，细胞密度约为2×105/孔，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中过夜培养，待用。
2、siRNA转染：Lipofectamine2000每孔1.5μl，溶解在100μl DMEM(无血清无抗生素)培养基中，充分混合后室温孵育5min，与哺乳细胞无同源性的阴性对照siRNA(购于上海吉玛制药技术有限公司)和Atg5siRNA(购于上海吉玛制药技术有限公司)各2μg分别溶解在100μl DMEM(无血清无抗生素)培养基中，充分混合后室温孵育5min后两种溶解混合均匀，室温孵育20-25min。
3、过夜培养的细胞用DMEM(无血清无抗生素)培养基洗涤2次后，分别加入孵育过对照siRNA和Atg5siRNA，在37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养30min，补充培养基DMEM完全培养基300μl，继续培养。
4、转染对照siRNA的细胞培养液中和Atg5siRNA的细胞培养液中分别加入1.5mM半胱胺处理，未做任何处理的细胞作为对照。
5、半胱胺处理24hr后收集细胞，用细胞裂解液(碧云天公司)裂解细胞，沸水煮10min后，12％SDS-PAGE电泳后湿转法将蛋白转移到尼龙膜上(Amersham公司)。用抗体anti-Atg5(santa公司)和anti-LC3(Novus公司)为一抗anti-rabbit(Promega公司)为二抗，进行Western blot。相对于对照siRNA处理的细胞(图12右图中consiRNA)，在转染Atg5siRNA的细胞中自噬的水平降低了(图12右图中Atg5siRNA)。
6、转染对照siRNA的细胞培养液中和转染Atg5siRNA的细胞培养液中分别加入终浓度为1.5mM半胱胺(图12左图中的CS)、20μg/ml阿霉素(图12左图中的Dox)、终浓度为1.5mM半胱胺和20μg/ml阿霉素的组合(图12左图中的DOX+CS)，其中以不加低剂量阿霉素(图12左图中的CS)和不加1.5mM(终浓度)半胱胺(图12左图中的DOX)为对照。培养24hr后，按照实施例8的方法检测细胞死亡率。
结果显示：
结果如图12所示，结果表明，转染Atg5siRNA的细胞，半胱胺引起自噬的能力减弱(图12右图)，相应的半胱胺促进阿霉素引起细胞死亡的能力也减弱(图12左图，图12左图中control siRNA为转染对照siRNA的细胞，Atg5siRNA为转染Atg5siRNA的细胞)。
实施例13：半胱胺协同阿霉素杀伤肿瘤
实验方法：
1、B16细胞接种在有DMEM培养基的(美国GIBCO公司)细胞培养瓶中，37℃，5％(体积百分含量)CO2培养箱中培养，待长满培养瓶将细胞消化并离心下来。
2、将1x106个细胞接种于C57小鼠(购自于上海史莱克公司)，待肿瘤长一周达到时0.5mm3给药，老鼠随机分成四组，对照组：给生理盐水，半胱胺组：500mg/kg(相对于老鼠体重)的剂量给药，阿霉素组：5mg/kg(相对于老鼠体重)的剂量给药，组合药组：500mg/kg半胱胺和5mg/kg阿霉素(相对于老鼠体重)共同给药，每隔一天给药一次。
3、两周以后将老鼠段颈处死，将肿瘤剥离下来称重，统计肿瘤大小来衡量半胱胺协同阿霉素杀伤肿瘤的作用(图13)
结果显示：
结果如图13所示，结果表明，半胱胺能大大加强阿霉素杀伤癌细胞的能力(图13)。
上述实施例1-13的实验说明，通过低剂量的半胱胺增进癌细胞对化疗药物的敏感性，从而实现了通过低剂量的化疗药物有效杀死癌细胞。实验证明半胱胺只需协同低剂量的化疗药物便可有效的杀死癌细胞及化疗药抗性癌细胞，即证明本发明的药剂在癌细胞及抗性癌细胞的化疗中大大降低抗癌药物的使用量从而降低化疗的副作用。因此可以利用该原理设计本发明的抗癌药物，它包含普通化疗药物和辅剂半胱胺。抗癌药剂中半胱胺协助低剂量化疗药物杀伤肿瘤细胞和化疗药物抗性细胞，大大增强化疗药物的化疗效果从而降低化疗药物的副作用。
本治疗癌症的组合药剂虽没有应用于临床，但细胞实验证明，在使用半胱胺和化疗药剂时，化疗药剂可比单使用化疗药剂是减量。医生可根据具体对患者的病情了解和化疗效果，在安全剂量下确定剂量。组分半胱胺临床用于治疗急性金属中毒和防治放射病剂量，一般是静脉注射，剂量是0.3g/次，一天1-2次。临床使用本发明组合药剂中的半胱胺时，可以参考其临床使用安全剂量使用，在安全剂量下，使用剂量越高疗效越好。建议临床应用的剂量参考现有的临床使用剂量。比如，单独但其中组分阿霉素临床使用的剂量一般在30-100mg/m2，高剂量会达到300mg/m2，在与半胱胺共同使用时可酌情减量。
Claims (10)
1.半胱胺在制备治疗癌症的药物中的应用。
2.一种治疗癌症的组合药剂，其活性成分为半胱胺和化疗药物。
3.根据权利要求2所述的组合药剂，其特征在于：所述治疗癌症的组合药剂中还包括医学上可接受的辅料。
4.根据权利要求2或3所述组合药剂，其特征在于：所述化疗药物为阿霉素。
5.根据权利要求2-4中任意一项所述的组合药剂，其特征在于：所述癌症包括起源于大脑、中枢神经***、肾脏、肝、胆囊、头颈部、口腔、甲状腺、皮肤、黏膜、腺体、血管、骨组织、***、肺脏、食管、胃、乳腺、胰腺、眼睛、鼻咽部、子宫、卵巢、子宫内膜、子宫颈、***、膀胱、结肠或直肠的原发或转移的癌或肉瘤或癌肉瘤。
6.根据权利要求5所述的组合药剂，其特征在于：所述癌症为***、乳腺癌、黑色素瘤或肾癌。
7.半胱胺在提高癌细胞对化疗药物的敏感性中的应用。
8.半胱胺在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。
9.半胱胺和化疗药物在制备肿瘤细胞抑制剂中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述肿瘤细胞为人***细胞HeLa细胞、人乳腺癌细胞系MCF-7或黑色素瘤癌细胞B16细胞；所述化疗药物为为阿霉素。
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