CN102719466A - 一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗。重组质粒pET32a-epr2-3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoRI酶切位点之间***嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I and Sal I酶切位点间***嗜水气单胞菌的epr2基因。所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗包含将转染重组质粒pET32a-epr2-3的大肠杆菌进行诱导表达所获得的重组蛋白epr2-3与佐剂。实验证明该亚单位疫苗具有较高的安全性，生产工艺简单，保存和运输条件要求不高，并且能够刺激机体全方面的免疫应答，具有广泛的开发和应用前景。

Description

一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种重组质粒及其制备的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗。 

背景技术

基因克隆技术已有40多年的良好应用，它包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。 

亚单位疫苗具有许多特点：（1）亚单位疫苗较稳定、费用低、容易进行生产和使用；（2）是一类新型疫苗，是将致病菌主要的保护性免疫原存在的组分制成的疫苗。（3）去除病原体中与激发保护性免疫无关甚或有害的成分，有效地增强了疫苗的免疫原性并且减少了副作用。 

嗜水气单胞菌(Ah)是我国水产养殖业的重要威胁之一，它是人、畜及水生动物共患的条件致病菌。该菌广泛存在于水环境中，是多种水产动物的主要致病菌，亦可引发人类的腹泻或败血症等，对食物安全具有威胁，并且是抑制病人免疫***功能和肝功能。该菌的致病性与其众多的毒力因子密切相关，其中胞外蛋白酶为最常见的毒力因子之一，它具有吞噬作用，能够刺激机体产生特异性抗体，与Ah的致病性和机体的免疫保护作用密切相关，一直是研究嗜水气单胞菌疫苗的焦点。而利用Ah的毒力基因胞外蛋白酶制备的重组亚单位疫苗，目前尚无相关报道。 

发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效控制嗜水气单胞菌感染的重组亚单位疫苗，可为嗜水气单胞菌的防控提供有力的支持。 

本发明的目的可通过如下技术方案实现： 

一种重组质粒pET32a-epr2-3，该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoR I酶切位点之间***嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I和Sal I酶切位点间***嗜水气单胞菌的epr2基因，其中所述的epr3基因GenBank登录号为EU275147.1，epr2基因GenBank登录号 为CP000462.1。 

所述的重组质粒pET32a-epr2-3优选通过如下方法制备得到： 

（1）epr2和epr3基因的克隆：以保藏号为CGMCC NO.3220的嗜水气单胞菌J-1株的DNA为模板，分别以引物Epr2-1/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3-2通过PCR扩增，得到epr2基因和epr3基因，将其分别***pMD-18T质粒，得到pMD-18T-epr2和pMD-18T-epr3； 

（2）重组质粒pET32a-epr3的构建：利用Kpn I和EcoR I对pMD-18T-epr3和pET32a分别进行双酶切，将获得的epr3基因酶切产物***pET32a的Kpn I和EcoR I酶切位点之间，得到重组质粒pET32a-epr3； 

(3)重组质粒pET32a-epr2-3的构建：利用EcoR I和Sal I对pMD-18T-epr2和pET32a-epr3分别进行双酶切，将酶切产物epr2基因***重组质粒pET32a-epr3的EcoR I和Sal I酶切位点间，得到重组质粒pET32a-epr2-3。 

含有所述的重组质粒pET32a-epr2-3的宿主。 

所述的宿主优选细菌或细胞，进一步优选大肠杆菌BL21。 

一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白由所述的含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21所分泌。 

所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，优选将含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21接种于LB培养基中，振荡培养后加入0.1M IPTG诱导蛋白表达，继续培养后离心获得菌体，超声破碎后离心获得上清和包涵体，对包涵体进行变性溶解，再分别取两者以His亲和层析柱纯化重组蛋白，收集所得即为重组蛋白Epr2-3。 

所述的重组质粒pET32a-epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。 

所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。 

一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗，含有所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3及佐剂。 

所述的佐剂优选弗氏完全佐剂或DC-Chol佐剂。 

有益效果： 

本发明首次成功构建了表达Ah胞外蛋白酶的重组亚单位疫苗，它突破了Ah常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性，兼具弱毒疫苗的复制性和灭活疫苗的安全性，容易通过安全性评价。 

试验证明，本发明的构建表达Ah重组亚单位疫苗所产生了针对Ah的抗体，且其抗体滴度显著高于灭活疫苗所产生的。 

嗜水气单胞菌的血清型众多，灭活疫苗的免疫效果存在局限性。而胞外蛋白酶Epr2、Epr3是不同血清型亚型Ah中最常见的毒力因子和保护性抗原。将胞外蛋白酶基因epr2、epr3串联表达得到重组蛋白Epr2-3，能够作为致病性嗜水气单胞菌不同血清型共同的保护性抗原，诱导动物机体产生高效价的抗体。该亚单位疫苗生产工艺简单，保存和运输条件要求不高，且对动物无任何不良影响，不会造成细菌的扩散，是一种理想的基因工程亚单位疫苗，在Ah的防治方面具有广阔的应用前景。 

附图说明

图1串联表达重组质粒pET32a-epr2-3结构示意图 

Ori为启动子，Amp为载体pET32a上抗生素基因，epr2、epr3为目的基因，KpnI、EcoRI、SalI为酶切位点。 

图2串联表达重组质粒pET32a-epr2-3酶切检测 

1：DL5000DNA Marker 2：pET32a-epr2-3酶切产物3：pET32a-epr2-34：DL10000DNA Marker图3重组蛋白Epr2-3的SDS蛋白电泳 

1：蛋白Marker MP1022：转化pET32a的大肠杆菌3：转化重组质粒pET32a-epr2-3的大肠杆菌 

图4western blot鉴定重组蛋白Epr2-3的反应原性 

M：预染蛋白Marker 1：转化重组质粒pET32a-epr2-3的大肠杆菌2：转化pET32a的大肠杆菌 

图5间接ELISA测定免疫小鼠血清的抗体滴度 

可以看出重组蛋白Epr2-3免疫的小鼠血清抗体效价明显高于其他组，能更好的刺激机体产生免疫反应。 

图6重组蛋白与不同佐剂配合测定免疫原性 

弗氏完全佐剂和DC-Chol配合重组蛋白Epr2-3的疫苗对小鼠的免疫保护率高达95％，远高于灭活组的65％。 

生物材料保藏信息 

嗜水气单胞菌J-1株,分类命名为嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila，该菌株已于2009年8月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，其保藏号为CGMCC NO.3220。 

具体实施方式

实施例1基因工程体——表达嗜水气单胞菌（Ah）胞外蛋白酶（EPR）的重组大肠杆菌E.coli的构建 

1.epr2、epr3基因的扩增、克隆、鉴定 

1.1PCR引物的设计及合成 

根据Ah标准毒株J-1的基因序列设计两对针对epr2（GenBank CP000462.1）和epr3（GenBank EU275147.1）的特异性引物，在引物的5’端分别汉有限制性内切酶酶切位点。因为由上海invitrogen生物公司合成。 

Epr2-1：5′-CCG GAA TTC ATG ACA CTC TTG CTC ACC ACC C-3′（SEQ ID No.1）， 

Epr2-2：5′-GTC GAC CTA GGA GGC GGG CAG CC-3′（SEQ ID No.2）， 

Epr3-1：5′-GGT ACC ATG AAA GCG ACT CCC ATT GCC C-3′（SEQ ID No.3）， 

Epr3-2：5′-CCG GAA TTC TCA GTT TTC GCT CGG CGT ATT CTC-3′（SEQ ID No.4） 

1.2PCR 

取2*Taq PCR Mix 12.5μl，epr2-12μl，epr2-22μl，嗜水气单胞菌J-1株(CGMCC NO.3220)菌液4μl，用无菌超纯水补至总体积25μl。在PCR仪上进行反应。循环参数为95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共进行30个循环；然后72℃延伸5min。对epr3-1的操作方法同上，循环参数为95℃预变性5min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共进行30个循环；然后72℃延伸5min。PCR产物进行1.2％（g/ml）琼脂糖凝胶电泳。 

1.3PCR产物回收与纯化 

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切下含目的条带的琼脂糖凝胶块，用DNA快速回收纯化试剂盒回收凝胶中的目的片段。具体操作步骤按Geneaid公司凝胶回收试剂盒的说明书进行。 

1.4PCR产物的酶切纯化 

酶切反应总体积为50μl，PCR后，epr2回收片段41μl，10×T buffer 5μl，EcoRI2μl，SalI2μl。37℃作用3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒对酶切后产物进行回收，方法同上。epr3回收片段41μl，10×T buffer 5μl，KpnI2μl，EcoRI2μl，其余操作同epr2。 1.5pMD-18T和pET32a的酶切纯化 

酶切反应总体积为50μl，分别对pMD-18T和pET32a两质粒进行酶切纯化，质粒41μl，10×Tbuffeer 5μl，EcoRI 2μl，SalI2μl。37℃作用3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒对酶切后产物进行回收，方法同上。以同样的方法用KpnI和EcoRI对两质粒进行酶切并回收产物。 

1.6目的片段epr2、epr3与pET32a的连接 

epr3的酶切回收PCR产物6.0μL，载体pMD-18T酶切回收产物2.0μL，10×T4连接酶缓冲液1.0μL，T4DNA连接酶1.0μL,混匀各产物后在16℃连接过夜，获得pMD-18T-epr3，以相同方法获得pMD-18T-epr2。将两连接产物分别转化E.coli DH5α。提取pMD-18T-epr3，并对pMD-18T-epr3用EcoRI和KpnI进行酶切，方法同上，再将酶切所获得的目的片段克隆进经pET32a表达载体内，然后转化E.coli BL21，获得pET32a-epr-3.对其进行酶切鉴定和DNA测序。接着提取之前获得的pMD-18T-epr2，并对pMD-18T-epr2用EcoRI和SalI进行酶切，方法同上，将酶切所得目的片段克隆入pET32a-epr-3，然后转化E.coli BL21，最终获得重组质粒pET32a-epr2-3（图1）。 

1.7大肠杆菌DH5α和BL21感受态细菌的制备和转化 

pET32a-epr2-3转化BL21感受态细菌，得到转化重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌。 

上述步骤中使用的DH5α和BL21感受态细菌的制备及连接产物的转化过程详见分子克隆。 

1.8重组质粒的提取和鉴定 

用质粒提取试剂盒提取重组质粒pET32a-epr2-3并用PCR和双酶切鉴定，在PCR和双酶切鉴定（图2）中都可以见到目的条带。 

1.9目的基因epr2-3序列分析 

测序工作由invitrogen公司协助完成。用NCBI BLAST将所测得的序列与GeneBank数据库中的epr2（GenBank CP000462.1）和epr3（GenBank EU275147.1）进行同源性比较，表明了我们所克隆入的基因与嗜水气单胞菌J-1株基因的碱基序列完全一致，而且克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。 

实施例2.重组蛋白的表达、鉴定和纯化 

2.1重组蛋白Epr2-3的表达 

实施例1中经鉴定呈阳性的重组大肠杆菌菌液接种于5mL新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养14-16h。取新鲜菌液重新接种于200mL新鲜LB液体培养基中，37℃200rpm振荡 培养4h，至OD600=0.6；加入0.1M IPTG至终浓度1mmol/L，连续振荡培养4h；取出菌液至1.5μL离心管中，4℃13000rpm离心2min，离心后的菌体用40μLPBS（ph=7.2）重悬，并加入10μL 5×SDS上样缓冲液；加热煮沸至100℃10min，13000rpm离心2min。取10μL裂解物进行SDS电泳，先80V电泳30min，然后120V。电泳以后考马斯亮蓝G250染色2h，然后每一小时脱色一次，一共3次。采用Biorad2000对蛋白胶进行拍照，可见到目的条带（图3），与标准蛋白Marker作对比，可判定其大小。 

2.2重组蛋白Epr2-3的纯化 

2.1中培养所得的阳性菌体4℃振荡培养10min，PBS重悬并保存于-80℃。冻存的菌体在用PBS重悬前需冻融3次，然后用300W功率进行5s的超声波破碎，间隔15s，进行60个循环。超声波过后，4℃下4000×g离心10min，可见溶解有epr2-3蛋白的上清液及不溶的包涵体。包涵体在4℃下变性液中反应2h，并4℃下12000×g离心15min。用20mL PBS缓冲液重悬，然后用超声波破碎仪破碎后再离心。分别取上清和包涵体沉淀进行SDS-PAGE电泳进行检测，并以His亲和层析柱纯化重组蛋白，并以BIO-RAD(Smart Spec TM3000)测定收集蛋白的浓度。 

2.3.western blot鉴定重组蛋白Epr2-3的反应原性 

纯化后的重组蛋白Epr2-3进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将SDS-PAGE胶切开，标记后放入膜转印缓冲液中浸泡30min；取略小的PVDF膜，甲醇浸15s后放入膜转印缓冲液中浸泡15min；取略小的滤纸2张放入膜转印缓冲液中浸泡数分钟。依次将滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶、滤纸重叠置于半干转印槽上，赶掉气泡后调整电流至0.8mA/cm2，转印2h。转印完毕后PVDF膜用5％脱脂奶封闭，置37℃摇床中50rpm过夜。将膜放入含1：1000稀释的含一抗（鼠源Ah J-1株全菌血清）的封闭液中置37℃摇床中50rpm作用1h；将膜取出用TBST洗三遍，每次5min；再将膜放入含1：10000稀释的含酶标二抗（HRP标记的羊抗鼠IgG）的封闭液中，同样条件作用1h；再用TBST洗三遍，每次5min；将膜放入沉淀型TMB单组份底物显色液中，室温避光作用10min。设置的阴性对照组为空载体pET32a转化到BL21进行诱导表达所得产物。结果（图4）表明目的蛋白Epr2-3有较高效率的表达，而在阴性对照和空白对照中则没有目的蛋白出现。 

实施例3.动物实验 

3.1用嗜水气单胞菌J-1株测定ICR小鼠的半数致死量 

80只四周龄大的ICR雌鼠被随机分成8组，每组10只。将嗜水气单胞菌J-1株(CGMCC NO.3220)接种至LB液体培养基中并且在28℃振荡培养至对数生长期。收集菌体并将其用10mMPBS（ph=7.2）溶液中稀释至浓度为2.5×10³CFU/ml。1-7组小鼠用0.2mL细菌注射，记录死亡数。第8组注射PBS作为空白对照组。该实验重复两次。结果见表1。 

表1 

3.2间接ELISA测定免疫小鼠血清的抗体滴度 

40只4周龄大的ICR雌鼠被随机分配至4组，每组10只。第1组肌肉注射100ug/mL的重组蛋白Epr2-3并与弗氏佐剂按1∶1体积比配合的疫苗0.2mL，第2组注射嗜水气单胞菌灭活疫苗（制备方法参见《嗜水气单胞菌灭活疫苗制造机检验试行规程》，2001新兽药证字第06号）作为阳性对照组0.2ml，两周后这两组小鼠进行加强接种。3、4组为致死组（注射0.2ml PBS）和空白组。第0，6，13，20，27，34，41和48天每组随机抽取2只小鼠进行眼眶采血，分离血清，用间接ELISA测定免疫过的小鼠体内的抗体滴度。 

结果（图5）表明：重组Epr2-3蛋白免疫的小鼠血清抗体效价明显高于其他三组。 

3.3将重组蛋白与不同佐剂配合测定其对小鼠的免疫保护作用 

90只4周龄大的ICR雌鼠被随机分配至9组，每组10只。将20μg重组蛋白Epr2-3稀释成100μl，将其与各佐剂按1∶1体积比配合。1-6组分别为重组蛋白Epr2-3配合弗氏完全佐剂、重组蛋白Epr2-3配合ISA206、重组蛋白Epr2-3配合DC-Chol、重组蛋白Epr2-3配合黄芪多糖佐剂，重组蛋白Epr2-3配合白油、重组蛋白Epr2-3配合氢氧化铝，每种佐剂使用剂量为100μl。第7组由100μl 2.0×10⁸CFU的嗜水气单胞菌灭活疫苗配合弗氏完全佐剂，8、9组分别为致死组（注射200μl PBS）和空白组。每天观察小鼠的变化，并记录死亡率，连续观察10天；10 天仍未死亡的小鼠，施以安乐死。 

结果（图6）表明：弗氏完全佐剂和DC-Chol配合重组蛋白Epr2-3的疫苗对小鼠的免疫保护率高达95％，远高于灭活组的65％。 

综上所述，本专利所涉及的胞外蛋白酶重组蛋白的亚单位疫苗能够诱导动物体内产生较高效价的抗体，并对免疫动物产生良好的保护作用，是一种理想的新型亚单位疫苗。 

Claims (10)

1.一种重组质粒pET32a-epr2-3，其特征在于该重组质粒以pET32a为出发质粒，其Kpn I和EcoR I酶切位点之间***嗜水气单胞菌的epr3基因，EcoR I和Sal I酶切位点间***嗜水气单胞菌的epr2基因，其中所述的epr3基因GenBank登录号为EU275147.1，epr2基因GenBank登录号为CP000462.1。

2.根据权利要求1所述的重组质粒pET32a-epr2-3，其特征在于该质粒通过如下方法制备得到：

(1)epr2和epr3基因的克隆：以保藏号为CGMCC NO.3220的嗜水气单胞菌J-1株的DNA为模板，分别以引物Epr2-1/Epr2-2及引物Epr3-1/Epr3-2通过PCR扩增，得到epr2基因和epr3基因，将其分别***pMD-18T质粒，得到pMD-18T-epr2和pMD-18T-epr3；

(2)重组质粒pET32a-epr3的构建：利用Kpn I和EcoRI对pMD-18T-epr3和pET32a分别进行双酶切，将获得的epr3基因酶切产物***pET32a的Kpn I和EcoRI酶切位点之间，得到重组质粒pET32a-epr3；

(3)重组质粒pET32a-epr2-3的构建：利用EcoRI和SalI对pMD-18T-epr2和pET32a-epr3分别进行双酶切，将获得的酶切产物epr2基因***重组质粒pET32a-epr3的EcoR I and Sal I酶切位点间，得到重组质粒pET32a-epr2-3。

3.含有权利要求1所述的重组质粒pET32a-epr2-3的宿主。

4.根据权利要求3所述的宿主，其特征在于所述的宿主为细菌或细胞，优选大肠杆菌BL21。

5.一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，其特征在于所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白由权利要求4所述的含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21所分泌。

6.根据权利要求5所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3，其特征在于将含有重组质粒pET32a-epr2-3的重组大肠杆菌BL21接种于LB培养基中，振荡培养后加入0.1 MIPTG诱导蛋白表达，继续培养后离心获得菌体，超声破碎后离心获得上清和包涵体，对包涵体进行变性溶解，再分别取两者以His亲和层析柱纯化重组蛋白，收集所得即为重组蛋白。

7.权利要求1所述的重组质粒pET32a-epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。

8.权利要求5所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3在制备嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗中的应用。 

9.一种嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗，其特征在于含有权利要求5所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白Epr2-3及佐剂。

10.根据权利要求9所述的嗜水气单胞菌胞外蛋白酶重组蛋白亚单位疫苗，其特征在于所述的佐剂为弗氏完全佐剂或DC-Chol佐剂。 

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