CN107823638A - 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107823638A
CN107823638A CN201711073721.5A CN201711073721A CN107823638A CN 107823638 A CN107823638 A CN 107823638A CN 201711073721 A CN201711073721 A CN 201711073721A CN 107823638 A CN107823638 A CN 107823638A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fhbp
preparation
protein
chimeric protein
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711073721.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107823638B (zh
Inventor
苏桂民
朱卫华
高博
郭通
纪国存
冀颖
杜琳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd
Chongqing Zhi Fei Biological Products Ltd By Share Ltd
Chongqing Zhifei Biological Products Co Ltd
Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd
Chongqing Zhi Fei Biological Products Ltd By Share Ltd
Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd, Chongqing Zhi Fei Biological Products Ltd By Share Ltd, Beijing Zhifei Lvzhu Biopharmaceutical Co Ltd filed Critical Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical Co Ltd
Priority to CN201711073721.5A priority Critical patent/CN107823638B/zh
Publication of CN107823638A publication Critical patent/CN107823638A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107823638B publication Critical patent/CN107823638B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法，所述疫苗含有：P2‑fHBP V1、P2‑fHBP V2和P2‑fHBP V3三种重组嵌合蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，其中每种蛋白含量分别为30‑50μg/剂，任选的，所述疫苗制剂中还含有冻干保护剂或疫苗佐剂；本发明还提供三种重组嵌合蛋白的制备方法，通过将P2与B群脑膜炎球菌fHBP蛋白连接形成的重组嵌合蛋白，能够有效的诱导体液免疫应答，显著提高fHBP的免疫原性，本发明的疫苗能够有效覆盖所有B群脑膜炎球菌菌株，从而对由B群脑膜炎球菌引起的脑脊髓膜炎、菌血症、肺炎及心包炎等侵袭性疾病提供广谱的预防作用。

Description

一种B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种疫苗的制备，特别涉及一种B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法，所述B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗包括B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)与破伤风通用性T细胞表位P2连接形成的重组嵌合蛋白，该蛋白有三个变异型fHBPV1、fHBP V2和fHBP V3，将三种变异型重组嵌合蛋白按比例配制而成的疫苗制剂及其制备方法。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)，俗称脑膜炎球菌(Meningococcus)，能够引起流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)和败血症，该疾病具有较高的发病率和病死率。脑膜炎奈瑟菌是一种以人类为主要宿主的致病性革兰阴性双球菌，曾数次引起全球范围的爆发与流行，其防控最佳策略为接种疫苗。
Nm的毒力因子主要包括荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)、脂寡糖和外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)，其中OMP主要包括菌毛、孔蛋白(PorA和Por B)、黏附分子Opc等。Nm根据荚膜多糖结构分为A、B、C、H、K、L、X、Y、Z、29E和W135共12个血清群，A、B、C、Y及W135为侵袭性脑脊髓膜炎的常见血清群，其中A、B、C群脑膜炎球菌引起的病例占90％以上。
A、C、Y、W135群多糖疫苗和多糖-蛋白结合疫苗的应用，使得相应血清群流行性脑膜炎的发病率和病死率均得到有效控制。流脑流行的显著特征是具有明显的地域性，而且随着时间的推移和疫苗的应用，会发生血清群的转换。目前，B群脑膜炎奈瑟菌已经成为主要的流行菌株，据统计，B群脑膜炎奈瑟菌导致了全球约50％的脑膜炎疾病；且B群比A群、C群等持续时间更长，达5-10年。在B群流行期间，侵袭率会增加，并且年龄也会随之扩大，特别是4-19岁青少年人群。
然而B群Nm荚膜多糖中含有的线性多聚唾液酸与人N-乙酰神经氨酸聚合物结构类似，因此在人体内不具备免疫原性，并且有诱发自生免疫疾病的危险，所以多糖疫苗的策略并不适用于B群脑膜炎奈瑟菌。因此，B群脑膜炎球菌疫苗研发集中在有效的外膜蛋白抗原成份上，如H因子结合蛋白(factor H-binding protein，fHBP)、奈瑟菌属表面蛋白A(Neisseria surface protein A，NSPA)、奈瑟菌属黏附素A(Neisseria adhesin A，
NadA)、奈瑟菌属肝素结合抗原(Neisseria heparin binding antigen，NHBA)等。
fHBP是一种几乎表达于所有脑膜炎奈瑟菌表面的特异性脂蛋白，相对分子质量约29KD，是脑膜炎奈瑟菌重要的毒力因子和疫苗抗原。fHBP根据抗原交叉反应性和蛋白序列相似性被细分为3个变异型，即V1，V2和V3。变异型内氨基酸序列同源性在90％以上，变异型间可低至62.8％。杀菌力实验分析表明，抗变异型V1抗体对变异型V2，V3脑膜炎分离株杀菌活***叉反应性很小，反之亦然。
fH(人H因子)是补体激活过程中的重要负调节蛋白，能辅助I因子介导C3b裂解为灭活片段iC3b，也能促使补体替代途径C3转化酶C3Bb的半衰期缩短。fHBP与fH结合，使fH覆盖于细菌表面，从而抑制补体***的杀菌作用。研究发现fHBP可引发广泛的交叉反应，并且这些反应是非PorA依赖性杀菌反应，血清杀菌力实验也表明fHBP具有较强的免疫原性。
辅助性T细胞(Th)表位是抗原中能与MHCⅡ类分子结合，并共同被辅助性T细胞受体(T Cell Receptor,TCR)特异性识别从而诱导相应Th细胞克隆产生活化和增殖的肽段，一般由11-18个连续的氨基酸残基构成。Th细胞的活化对体液免疫及细胞毒性T细胞免疫功能有重要的辅助作用；通用性T细胞表位最常用的为破伤风类毒素(TT)的P2和P30，以及白喉类毒素(DT)的DT1或DT2等表位。
因此，本发明将通用性T细胞表位与fHBP的N端连接组成重组嵌合蛋白，该嵌合蛋白既有fHBP的有效杀菌活性，又有T细胞表位强的免疫辅助功能，且能够高效可溶性表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分别含有fHBP V1，fHBP V2，fHBP V3的重组嵌合蛋白，所述重组嵌合蛋白和TT的抗原表位P2或P30结合，或者和DT的DT1或DT2表位结合。
本发明的另一目的在于提供fHBP与TT的通用性T细胞表位P2连接的重组嵌合蛋白，共涉及fHBP三个变异型，将三个变异型重组嵌合蛋白按比例配制成疫苗后即为B群脑膜炎球菌蛋白疫苗，该重组嵌合蛋白表达量高，易于纯化，且配制成的疫苗具有很高的免疫原性。
本发明的另一目的在于提供B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗的制备方法。
为了实现本发明目的，本发明提供了一种预防B群脑脊髓膜炎的重组嵌合蛋白疫苗制剂，所述疫苗制剂含有：P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三种重组嵌合蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，其中每种蛋白含量分别为30-50μg/剂，任选的，所述疫苗制剂中还含有冻干保护剂或疫苗佐剂。
本发明所述的疫苗制剂，优选的，其中P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三种重组嵌合蛋白的含量分别为35-45μg/剂，疫苗制剂的pH为5.8-7.2；疫苗制剂中含有佐剂铝佐剂或CpG佐剂，佐剂中的铝含量为0.4-0.6mg/ml；或佐剂中的CpG含量为120-180ug/ml。
本发明所述的疫苗制剂，为供皮下或肌肉注射的冻干或液体制剂。
本发明所述的疫苗制剂，优选的，为冻干剂型，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或安瓿瓶分装。
本发明所述的疫苗制剂，优选的，为液体剂型，采用氢氧化铝、磷酸铝或其他铝佐剂等制备成铝吸附液体疫苗，以西林瓶或预填充注射器分装；或采用CpG佐剂混合制备成液体疫苗，以预填充注射器分装。
本发明还提供所述重组嵌合蛋白疫苗制剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
将P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三个变异型重组嵌合蛋白，按比例稀释配制后，任选的，加入冻干保护剂或佐剂，采用冻干或吸附的方式配制成B群脑膜炎球菌蛋白疫苗制剂。
本发明中，所有三种重组嵌合蛋白为全新蛋白，为此本发明还包括：
P2-fHBP V1重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V1的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V1与质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V1/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V1。
P2-fHBP V2重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V2的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V2与质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V2/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V2。
P2-fHBP V3重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V3的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V3和质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V3/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V3。
本发明的任何一种重组嵌合蛋白，均和TT的抗原表位P2或P30结合，或者和DT的DT1或DT2表位结合。
优选的重组嵌合蛋白制备方法如下：
重组嵌合蛋白大肠杆菌工程菌株的构建：
fHBP蛋白分为V1、V2和V3三个变异型，分别筛选fHBP V1、fHBP V2和fHBP V3特异变异型蛋白序列，V1变异型可以选择国际或国内流行菌株的V1变异型，如MC58，CDC1573等，本发明以CDC1573株fHBP为例，其变异型为V1.55，GenBank:AY330406.1；V2变异型可以选择961-5945、M3153等，本发明以961-5945株fHBP为例，其变异型为V2.16，GenBank:DQ523568.1；V3变异型可以选择M1239、M98250771等，本发明以M98250771株fHBP为例，其变异型为V3.45，GenBank:AY330361.1。
将各变异型fHBP的N端连接通用性T细胞表位，可以是破伤风类毒素(TT)的P2和P30，或者白喉类毒素(DT)的DT1或DT2表位，本发明优选的是TT的P2。
根据已经于N端连接P2表位的fHBP各变异型的氨基酸序列，及大肠杆菌密码子偏爱性设计并合成基因，将基因合成于质粒载体pUC57-Amp或pUC57-Simple上，本发明优选载体pUC57-Amp。
重组嵌合蛋白表达载体选择为pBR322、pSC101、pET32a或pET43.1a等，本发明优选pET43.1a。
抗性基因采用卡那霉素、四环素或氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)等，本发明优选抗性为氨苄青霉素。
采用限制性内切酶HindⅢ、Bam HI、NdeI、XhoI等酶切处理基因合成产物和质粒，本发明优选限制性内切酶为NdeI、XhoI。
将酶切处理后的DNA大片断与表达载体质粒pET43.1a以T4连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，测序验证DNA序列完全正确后，提取阳性克隆质粒并转化大肠杆菌BL21(DE3)，在含抗生素的培养基上培养，挑取单克隆培养后，经电泳或质谱或氨基酸序列测定分析等方法鉴定后，确定为P2-fHBP嵌合蛋白表达。
工程菌的发酵培养与诱导表达：
取构建的可溶性高表达工程菌株，划种LB琼脂培养基(含Amp)，37℃培养过夜，挑取单个菌落接种至LB液体培养基(含Amp)中，并以1.5-7.5％的接种比例逐步扩大至发酵罐发酵培养，待OD600达到18-22时，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养3-6小时，停止培养，离心收集大肠杆菌菌体。
重组嵌合蛋白的提取纯化：
将发酵培养收获的细菌离心，收集菌体，以一定比例的破菌缓冲液溶菌后，采用反复冻融、超声破碎、低温超高压均质破碎或渗透冲击等方法将细菌菌体破碎，离心收集细菌破碎上清液，经过硫酸铵分级沉淀、酒精分步沉淀、等电点沉淀、双水相抽提等方法提取目的蛋白，再采用离子交换或疏水层析及分子筛等进行精细纯化，去除脂多糖、核酸及其他大肠杆菌宿主杂蛋白，得到纯度大于95％的重组P2-fHBP嵌合蛋白原液。
细菌内毒素不高于20EU/ml，本发明应不高于10EU/ml，最佳不高于5EU/ml。
本发明的B群脑膜炎球菌蛋白疫苗，其制备方法如下：
将三个变异型的重组fHBP嵌合蛋白P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3按相应比例配制后，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或安瓿瓶分装。
或者
将三个变异型的重组fHBP嵌合蛋白P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3按相应比例配制后，采用氢氧化铝、磷酸铝或者CpG等佐剂制备成吸附疫苗，以预填充注射器或西林瓶分装。
按以上任一种疫苗配制方式，每剂配制成终浓度含P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3各30-50μg/剂的疫苗制剂。
本发明的优点是，针对B群脑膜炎球菌荚膜多糖成份不适合用作疫苗的特征，利用反向遗传学技术，重组表达B群脑膜炎球菌人H因子结合蛋白(fHBP)抗原，该蛋白抗原含有V1、V2和V3三个变异型，完全覆盖了B群脑膜炎球菌所有菌株，对B群脑膜炎球菌感染引起的脑脊髓膜炎等疾病起到有效而广泛的预防作用；本发明将通用性T细胞表位连接到fHBP N末端，显著增强fHBP蛋白的免疫原性，且该表达为可溶性表达。同时将三个变异型重组fHBP嵌合蛋白配制成疫苗，能够增加疫苗对所有B群脑膜炎球菌广谱的预防效果，从而提供更为广泛、更为有效的针对B群脑膜炎球菌的疫苗保护效果。
附图说明
图1为p2-fhbp V1基因与pET43.1a连接后的DNA序列鉴定电泳图。
图2为p2-fhbp V2基因与pET43.1a连接后的DNA序列鉴定电泳图。
图3为p2-fhbp V3基因与pET43.1a连接后的DNA序列鉴定电泳图。
图4为P2-fHBP V1重组嵌合蛋白表达的SDS-PAGE图。
图5为P2-fHBP V2重组嵌合蛋白表达的SDS-PAGE图。
图6为P2-fHBP V3重组嵌合蛋白表达的SDS-PAGE图。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。
实施例1P2-fHBP V1工程菌株的构建：
根据fHBP V1和P2的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列p2-fhbp V1，p2连接于fhbp V1N端，为基因合成质粒，将基因p2-fhbp V1合成至质粒pUC57上，以限制性内切酶NdeI和XhoI酶切处理基因合成质粒pUC57和载体pET43.1a，获得目的基因片段和酶切后的质粒pET43.1a；将目的基因片段p2-fhbp V1与质粒pET43.1a以T4ligase连接，连接产物转化E.coli DH5α，37℃培养过夜。挑取阳性克隆接种LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。以PCR方法扩增目的基因片断，分析鉴定结果如图1显示，可扩增到约800bp左右的p2-fhbp V1基因大片断。将目的基因片断测序，结果显示基因片段DNA序列(p2-fhbp V1)完全正确。
将连接正确的质粒转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，于LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)37℃过夜培养，得到阳性P2-fHBP V1/BL21(DE3)表达菌株，挑取单个克隆，37℃振荡培养至细菌密度至OD600约0.5～1.0时，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃振荡诱导培养2-6小时，经SDS-PAGE鉴定，结果如图4显示，P2-fHBP V1/BL21(DE3)诱导后有明显的表达条带，分子量为32KD。将表达蛋白条带经质谱鉴定为P2-fHBP V1重组嵌合蛋白，序列表达正确。
实施例2P2-fHBP V1工程菌的发酵
将菌种接种LB液体培养基，37℃、200rpm培养12小时。以5％比例扩大接种至发酵罐，37℃培养4-8小时后，待OD600增长至18～22时，以终浓度0.05mM的IPTG诱导4-8小时。大容量离心机离心收集菌体。
实施例3P2-fHBP V1重组嵌合蛋白的提取纯化
菌体破碎：取菌体加入破菌缓冲液(20mM PB，2mM EDTA，pH7.0)，低温(4℃)超高压(1100-1400bar)均质破菌二遍后，高速离心(10000rpm，60min，4℃)取细菌破碎上清。
蛋白提取：采用硫酸铵分级沉淀的方法，15％硫酸铵4℃搅拌状态下沉淀1小时，6500rpm8℃离心60分钟，取离心上清；将上清以45％硫酸铵4℃搅拌沉淀1小时，取蛋白沉淀以20mM PB PH7.4溶解，10KD膜包超滤并浓缩至原体积的1/5-1/3。
蛋白精细纯化：采用Sepharose QFF，以20mM PB PH7.4平衡液上样，以20mMPB+1MNaCl PH7.4洗脱液0-100％梯度洗脱，收集25％洗脱峰。取25％梯度洗脱液以10KD超滤膜包超滤浓缩至原体积的1/3，经GE Sepharose 6FF层析，收集V0处蛋白峰。
实施例4P2-fHBP V1重组嵌合蛋白原液制备：
将经GE Sepharose 4FF层析收集的V0处蛋白峰纯化化液，以0.15mol/L氯化钠、10KD膜包超滤5次以上，并浓缩至蛋白含量为1-2mg/ml，0.22μm除菌过滤。经无菌检查、蛋白含量检查、分子量和纯度检查、蛋白特异性检查、细菌内毒素检查合格后，即为P2-fHBP V1蛋白原液。
实施例5P2-fHBP V1蛋白分子量与纯度检查：采用15％的分离胶进行SDS-PAGE，上样量为10ug，并以未转化的大肠杆菌BL21(DE3)为阴性对照；电泳胶片考马斯亮蓝染色后，以Gel DocTM XR+凝胶成像仪进行凝胶扫描，以Image Lab软件计算分子量及纯度分析，结果如图4所示，分子量为32.3KD，纯度为98.2％。
实施例6蛋白特异性检查Western Blot：样品和未转化的大肠杆菌BL21(DE3)经SDS-PAGE后，电转印至PVDF或NC膜上，以脱脂奶粉封闭后结合兔抗fHBP特异性抗体，室温孵育2小时，以PBST洗涤5次，结合羊抗兔二抗，室温孵育1小时，以PBST洗涤5次，DAB显色。结果显示，P2-fHBP V1在32KD左右显现特异性蛋白带，而未转化大肠杆菌则无特异性蛋白带显现，证明为特异性fHBP V1表达。
实施例7按照实施例1-6的菌种构建及蛋白制备方法，及P2-fHBP V2蛋白本身的特性构建并制备P2-fHBP V2原液，具体的实施方式在实施例1-6的方法上加以改进或改变，经鉴定分析蛋白原液为P2-fHBP V2正确表达，分子量为31.8，纯度达到97.6％。
实施例8按照实施例1-6的菌种构建及蛋白制备方法，及P2-fHBP V3蛋白本身的特性构建并制备P2-fHBP V3原液，具体的实施方式在实施例1-6的方法上加以改进或改变，经鉴定分析蛋白原液为P2-fHBP V3正确表达，分子量为32.1，纯度达到98.5％。
实施例9疫苗的配制：
三价fHBP蛋白疫苗的配制
将三种变异型重组B群fHBP嵌合蛋白P2-fHBP V1、P2-fHBP V2及P2-fHBP V3，分别以氢氧铝佐剂吸附，4℃搅拌过夜，吸附率在95％以上。以0.15mol/L氯化钠稀释配制，至蛋白终浓度分别为240μg/ml，铝含量终浓度为0.45-0.6mg/ml，pH值5.8-7.2。
本实施例中，将三种重组嵌合蛋白吸附原液，按等体积混合配制成三价疫苗成品。以预填充式注射器分装，即为吸附型液体针剂疫苗成品。
实施例10B群重组嵌合蛋白疫苗的免疫原性研究
免疫剂型为：氢氧化铝佐剂吸附P2-fHBPV1/V2/V3单价及三价疫苗成品，并以铝佐剂吸附生理盐水为阴性对照。
小鼠免疫：分别皮下免疫12-14克SPF级NIH小鼠10只，免疫剂量为0.1ml/只，免疫程序为0，2，4周，免疫程序结束后2周采血，离心收集血清；另设10只小鼠阴性对照，相同方法注射铝佐剂吸附生理盐水。
流行株的杀菌力(SBA)实验：
采用B群脑膜炎球菌440902菌株，该菌株为ST4821序列型，属ST4821序列群(克隆群)，为国内近期B群脑膜炎球菌流行菌株，fHBP分型为V2变异型。
靶菌的制备：培养流行性脑膜炎球菌440902菌株，于8-12％羊血琼脂平板上，37℃6-10％二氧化碳培养16-18小时，刮取菌苔至生理盐水中，细菌比浊法计数，根据计数，将靶菌稀释至1×106。
将待检小鼠血清于56℃灭活1小时，以灭活小鼠血清固有补体活性。实验过程中将Pel-Freez幼兔补体加入到待检小鼠血清中，同时设置灭活补体、补体对照对照，倍比稀释至96孔培养板上，并滴加新鲜配制的靶菌10ul。震荡混匀后于37℃培养2-4小时。
点样：取培养后的混合菌液，以10ul的量滴加至固体营养琼脂综合培养基上，37℃5％二氧化碳培养过夜。
显色：将含有150-300ug/ml的TTC的软琼脂覆盖在过夜培养的固体营养琼脂综合培养基上，以适宜温度、适宜时间显色。
计数：高清拍摄显色菌落照片，采用图像扫描技术，以专用分析软件分析并计算细菌菌落个数，以杀菌力结果计算软件计算出杀菌滴度。结果如下：
小鼠血清杀菌力滴度(BC Titer 1：)
序列表
110 北京智飞绿竹生物制药有限公司
120一种B群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
160 3
210 1
211 276
212 PRT
213 人工序列
220
221
222
223
400 1
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
5 10 15
Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr
20 25 30
Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu
35 40 45
Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
50 55 60
Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu
65 70 75
Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys
80 85 90
Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val
95 100 105
Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr
110 115 120
Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu
125 130 135
Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys Met Val Ala Lys Arg Arg Phe
140 145 150
Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
155 160 165
Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser
170 175 180
Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
185 190 195
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu
200 205 210
Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu Lys His
215 220 225
His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu Lys
230 235 240
Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val
245 250 255
Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile
260 265 270
Gly Leu Ala Ala Lys Gln
275
210 2
211 270
212 PRT
213 人工序列
220
223
400 2
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
5 10 15
Leu Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala
20 25 30
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu
50 55 60
Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
65 70 75
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser
80 85 90
Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile
95 100 105
Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser
110 115 120
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
125 130 135
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu
140 145 150
Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala
155 160 165
Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys
170 175 180
Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys
185 190 195
Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala
200 205 210
Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly
215 220 225
Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
230 235 240
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
245 250 255
Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
260 265 270
211 270
210 3
211 277
212 PRT
213 人工序列
220
223
400 3
Met Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu
5 10 15
Leu Cys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala
20 25 30
Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp
35 40 45
His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
65 70 75
Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys
80 85 90
Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile
95 100 105
Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln
110 115 120
Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
125 130 135
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg
140 145 150
Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn
155 160 165
Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
170 175 180
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
185 190 195
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
200 205 210
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys
215 220 225
Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu
230 235 240
Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
245 250 255
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu
260 265 270
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
275

Claims (10)

1.一种预防B群脑脊髓膜炎的重组嵌合蛋白疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂含有：P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三种重组嵌合蛋白，其氨基酸序列分别为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，其中每种蛋白含量分别为30-50μg/剂，任选的，所述疫苗制剂中还含有冻干保护剂或疫苗佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其特征在于，其中P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三种重组嵌合蛋白的含量分别为35-45μg/剂，疫苗制剂的pH为5.8-7.2；疫苗制剂中含有佐剂铝佐剂或CpG佐剂，佐剂中的铝含量为0.4-0.6mg/ml；或佐剂中的CpG含量为120-180ug/ml。
3.根据权利要求1所述的疫苗制剂，其特征在于，为供皮下或肌肉注射的冻干或液体制剂。
4.根据权利要求3所述的疫苗制剂，其特征在于，为冻干剂型，采用乳糖、明胶、蔗糖或人血白蛋白等保护剂成份制备成冻干制剂，以西林瓶分装冻干；稀释剂为无菌、无热原的注射用水、生理盐水或PBS等，以预填充注射器或安瓿瓶分装。
5.根据权利要求3所述的疫苗制剂，其特征在于，为液体剂型，采用氢氧化铝、磷酸铝或其他铝佐剂等制备成铝吸附液体疫苗，以西林瓶或预填充注射器分装；或采用CpG佐剂混合制备成液体疫苗，以预填充注射器分装。
6.权利要求1所述重组嵌合蛋白疫苗制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将P2-fHBP V1、P2-fHBP V2和P2-fHBP V3三个变异型重组嵌合蛋白，按比例稀释配制后，任选的，加入冻干保护剂或佐剂，采用冻干或吸附的方式配制成B群脑膜炎球菌蛋白疫苗制剂。
7.P2-fHBP V1重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V1的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V1与质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V1/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V1。
8.P2-fHBP V2重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V2的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V2与质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V2/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V2。
9.P2-fHBP V3重组嵌合蛋白，其特征在于，其制备方法经过以下步骤：
根据P2与fHBP V3的氨基酸序列及大肠杆菌密码子偏爱性，设计并合成全长DNA序列，将合成的目的基因片段p2-fhbp V3和质粒pET43.1a以T4Ligase连接，连接产物转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到P2-fHBP V3/BL21(DE3)菌株，将菌种培养扩增得到菌体，经IPTG诱导表达，再经过蛋白提取、蛋白纯化得到重组嵌合蛋白P2-fHBP V3。
10.权利要求7,8,9任何一项重组嵌合蛋白，其特征在于，所述重组嵌合蛋白和TT的抗原表位P2或P30结合，或者和DT的DT1或DT2表位结合。
CN201711073721.5A 2017-11-05 2017-11-05 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法 Active CN107823638B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711073721.5A CN107823638B (zh) 2017-11-05 2017-11-05 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711073721.5A CN107823638B (zh) 2017-11-05 2017-11-05 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107823638A true CN107823638A (zh) 2018-03-23
CN107823638B CN107823638B (zh) 2020-01-03

Family

ID=61653673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711073721.5A Active CN107823638B (zh) 2017-11-05 2017-11-05 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107823638B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804101A (zh) * 2019-11-08 2020-02-18 苏州微超生物科技有限公司 B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用
CN110859954A (zh) * 2019-11-08 2020-03-06 苏州微超生物科技有限公司 一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用
CN117264031A (zh) * 2023-11-03 2023-12-22 烟台派诺生物技术有限公司 一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102028941A (zh) * 2011-02-11 2011-04-27 中国医学科学院医学生物学研究所 一种b群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法
CN102711814A (zh) * 2009-04-30 2012-10-03 奥克兰儿童医院及研究中心 一种嵌合h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法
CN104888209A (zh) * 2015-05-13 2015-09-09 北京民海生物科技有限公司 一种b群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗及其制备方法
CN106215183A (zh) * 2016-07-21 2016-12-14 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102711814A (zh) * 2009-04-30 2012-10-03 奥克兰儿童医院及研究中心 一种嵌合h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法
CN102028941A (zh) * 2011-02-11 2011-04-27 中国医学科学院医学生物学研究所 一种b群脑膜炎球菌重组蛋白嵌合疫苗及其制备方法
CN104888209A (zh) * 2015-05-13 2015-09-09 北京民海生物科技有限公司 一种b群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗及其制备方法
CN106215183A (zh) * 2016-07-21 2016-12-14 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JENNINGS HJ: "Induction of meningococcal group B polysaccharide-specific IgG antibodies in mice by using anN-propionylated B polysaccharide-tetanus toxoid conjugate vaccine", 《J IMMUNOL》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804101A (zh) * 2019-11-08 2020-02-18 苏州微超生物科技有限公司 B群脑膜炎球菌相关融合蛋白、疫苗及其制备方法与应用
CN110859954A (zh) * 2019-11-08 2020-03-06 苏州微超生物科技有限公司 一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用
CN110859954B (zh) * 2019-11-08 2023-10-13 苏州聚微生物科技有限公司 一种包含B群脑膜炎球菌fHBP抗原的组合物及其制备方法与应用
CN117264031A (zh) * 2023-11-03 2023-12-22 烟台派诺生物技术有限公司 一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用
CN117264031B (zh) * 2023-11-03 2024-01-30 烟台派诺生物技术有限公司 一种B群脑膜炎奈瑟菌fHBP重组蛋白及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107823638B (zh) 2020-01-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2009223613B2 (en) Chimeric factor H binding proteins (fHBP) containing a heterologous B domain and methods of use
US20090035328A1 (en) fHbp- AND LPXL1-BASED VESICLE VACCINES FOR BROAD SPECTRUM PROTECTION AGAINST DISEASES CAUSED BY NEISSERIA MENINGITIDIS
CN101107007A (zh) 对脑膜炎奈瑟球菌所致疾病具有广谱保护作用的gna1870囊泡疫苗
CN104334187A (zh) 脑膜炎双球菌组合物及其方法
CN102711814A (zh) 一种嵌合h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法
AU2023204391A1 (en) Factor H binding protein variants and methods of use thereof
CN107823638A (zh) 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
CN106215183A (zh) 一种abc群脑膜炎球菌联合疫苗及其制备方法
CN106350527B (zh) 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体
CN108774628B (zh) 合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途
CN108939061A (zh) 一种多组分b群脑膜炎球菌疫苗及其制备方法
CN105431167A (zh) 非天然发生因子h结合蛋白(fhbp)及其使用方法
CN104888209B (zh) 一种b群流行性脑膜炎球菌重组蛋白疫苗及其制备方法
CA2378862C (en) Multi-component vaccine to protect against disease caused by haemophilus influenzae and moraxella catarrhalis
CN110922454B (zh) 绿脓杆菌毒素ExoS和ExoT的免疫用途及其制备方法
CN102676570B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用
CN105732817A (zh) 一种铜绿假单胞菌重组蛋白Vac33及制备方法和应用
JP2016104783A (ja) Ｔ細胞刺激タンパク質ｂおよび使用方法
CN105732818A (zh) 一种铜绿假单胞菌重组蛋白pop及其制备方法和应用
CN104096224B (zh) 一种增强流行性嗜血杆菌b型多糖蛋白结合物免疫原性的方法
US20240024450A1 (en) Neisserial surface protein a (nspa) variants and methods of use thereof
RU2811942C2 (ru) Варианты фактор h-связывающего белка и способы их применения
WO2011043696A1 (ru) Способ получения iga1 протеазы из культуры n. меningiтidis серогруппы а и поливалентный вакцинный препарат для профилактики инфекции, вызываемой бактериями n. меningiтidis серогрупп а и в

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant