CN102392007B - 一种高温碱性木聚糖酶xyn10a及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYN10A及其基因和应用。本发明提供了一种新的高温碱性木聚糖酶XYN10A，其具有如SEQID NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述高温碱性木聚糖酶XYN10A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明提供的木聚糖酶最适pH 7.0，并在pH 5.0-10.0范围内具有75％以上的酶活力，而且在pH 12.0仍具有50％以上的酶活力，具有很好的pH稳定性；最适温度70℃。本发明的木聚糖酶XYN10A可有效降解各种不同类型的木聚糖，而不降解纤维素，将在造纸、纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。

Description

一种高温碱性木聚糖酶XYN10A及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性木聚糖酶XYN10A及其基因和应用。

背景技术

木质纤维素主要是由纤维素，半纤维素以及木质素这三大主要类多糖构成的高分子复合物，其中，纤维素是主骨架，木质素与半纤维素分散在纤维素之中及其周围，相互之间靠共价键连结，同时也存在一定程度的化学键(Martinez AT，Ruiz-DuenasFJ，Martinez MJ，et al.Enzymatic delignification of plant cell wall：from nature to mill.Curr Opin Biotechnol，2009，20：348-357.)。半纤维素占到20-30％，是由D-木糖、D-甘露糖、L-***糖或D-半乳糖以直链或支链聚合而成的多糖。自然界中，木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是半纤维素中最丰富的一种；其主链由吡喃木糖以β-1，4糖苷键连接而成(Saha BC.Hemicellulose bioconversion.J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30：279-291.)。根据氨基酸序列同源性，木聚糖酶主要归类于GH10、11、39、43、52、62和67家族(Henrissat B，Bairoch A.New families in the classification ofglycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities.Biochem J，1993，293：781-788.)。

在饲料工业中，酸性木聚糖酶是一种饲料添加剂，其功能可消除抗营养因子的作用，提高饲料利用率，并且可降低食糜的粘稠度，可增大食糜和小肠粘膜的接触面积，从而提高营养物质的吸收率；还可减少畜禽粪便量，降低氮的排出率；并且可以提高动物体的抗病性(马玉龙.饲用酶制剂的研究进展及应用前景.粮食与饲料工业，1998，4：29-31.)。在制浆造纸工业中，碱性木聚糖酶用于纸浆漂白，降低漂白过程中化学药品的消耗和漂白废液中有害成分的含量，有效减轻造纸工业对环境的污染(杨桂花，陈嘉川，陈克复新型木聚糖酶辅助漂白杨木KP浆的研究，华东纸业，2011，42：11-13.)。在纺织工业中，碱性木聚糖酶被用于棉及其混纺的纤维的生物复合酶精炼加工，能有效地去除纺织印染产品上残留杂质，达到可靠的润湿性。在食品工业中，木聚糖酶可以和β-葡聚糖酶协同作用，从而解决啤酒黏度问题，可提高酒液的澄清度，降低酿酒成本。

木聚糖酶在工业中有着广阔的应用前景。近几年，研究发现天然来源的木聚糖酶难以满足工业实际需求，因此优良性质的天然酶的异源表达成为获得工业用酶一种有效途径。已报道的真菌木聚糖酶多数在酸性pH条件下稳定，而在pH超过10.0后几乎丧失其活力，其不能适应造纸、纺织工业中的碱性环境。另外，细菌产的木聚糖酶虽能在碱性条件下有活力，但其表达量过低限制了其工业生产前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种高温碱性木聚糖酶XYN10A。

本发明的再一目的是提供编码上述高温碱性木聚糖酶的基因xyn10A。

本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述高温碱性木聚糖酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温碱性木聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高温碱性木聚糖酶的应用。

本发明提供了一种高温碱性木聚糖酶XYN10A，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MRFSASLLLA LTGSAAASPI RAEEEIRVYD LPISLFDDLQ GLDAAMKAAG

REYIGTSLTV                    60

RNDFQEQNII RTEFGSITPE NAQKWDATEP NRGQFTFGSA DQHMDWARQN

GKHVRCHTLV                    120

WYSQLPGWVS NSGFNNATLQ QVMQNHINQV MGRYRGRCNH

WDVVNEAPRL MAMRLQIGEA         180

YIPIAFRMAA QADPSAKLYY NDYNLEYLGP KVEGAARIVR LVKQYGARID

GVGYQAHLVT                    240

EPTPTQSTPT PSEEDLIKAL RITADLGVDV AYTEIDIRMR TPSNAQKLQQ

LADAYYRVAR                    300

SCMKVPRCVG MTIWGVTDRY SWVPNTFRGE GDALLWDSNY

QRKAAYNAFL RGIQEPVN           358

其中，该酶基因编码358个氨基酸，N端17个氨基酸为其预测的信号肽序列如SEQ ID NO.3所示：

MRFSASLLLA LTGSAAA            17

因此，成熟的高温碱性木聚糖酶XYN10A的理论分子量为38.7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SPIRAEEEIR VYDLPISLFD DLQGLDAAMK AAGREYIGTS LTVRNDFQEQ

NIIRTEFGSI                                     60

TPENAQKWDA TEPNRGQFTF GSADQHMDWA RQNGKHVRCH

TLVWYSQLPG WVSNSGFNNA                          120

TLQQVMQNHI NQVMGRYRGR CNHWDVVNEA PRLMAMRLQI

GEAYIPIAFR MAAQADPSAK                          180

LYYNDYNLEY LGPKVEGAAR IVRLVKQYGA RIDGVGYQAH LVTEPTPTQS

TPTPSEEDLI                                     240

KALRITADLG VDVAYTEIDI RMRTPSNAQK LQQLADAYYR VARSCMKVPR

CVGMTIWGVT                                     300

DRYSWVPNTF RGEGDALLWD SNYQRKAAYN AFLRGIQEPV N  341

本发明的木聚糖酶XYN10A同时具有优良的pH稳定性，在中温和高温范围内均具有高活性。本发明的木聚糖酶，其最适pH值为7.0，在pH 5.0-10.0的范围内维持75％以上的酶活性；在pH 4.0-12.0之间，酶活很稳定；最适温度为70℃。

本发明提供了编码上述高温碱性木聚糖酶基因xyn10A。具体地，该基因的基因组序列如SEQ ID NO.4所示：

atgcgtttct ccgcctccct gctccttgcc ctgacgggct ccgctgccgc cagccctatc     60

cgggctgagg aagagatccg ggtgtacgac ttgcccatct cactgttcga tgatctgcag    120

ggtctggatg ctgccatgaa ggctgccgga agggagtaca tcggcacctc cctcaccgtg    180

aggaacgact tccaggagca gaacatcatc cgcactgagt tcggctcgat cacgcccgag    240

aacgcccaga agtgggacgc caccgagccc aaccgcggcc agtttacctt cggctctgcc    300

gaccagcaca tggactgggc ccgccagaac gggaagcacg tccgctgcca cacccttgtc    360

tggtactccc agctccccgg ctgggtgtcc aacagcggct tcaacaacgc caccttgcag    420

caggtgatgc agaatcacat caaccaagtg atgggccggt accgtggccg ctgcaaccac    480

tgggatgtcg tcaatgaggc tcccaggctg atggccatgc gattgcagat cggagaggcg    540

tatatcccga ttgctttcag gatggccgcc caggccgatc cctcggccaa gctctactac    600

aatgactaca acctcgagta tctcggaccc aaggttgagg gtgctgcccg catcgtgcgc    660

cttgtcaagc agtacggcgc tcgcatcgac ggtgtcggct atcaggctca ccttgtcacc    720

gagcccaccc cgactcagtc caccccgact ccgtctgagg aggacctcat caaggctctg    780

cgtatcaccg ctgacctcgg tgtcgatgtc gcctacaccg agattgatat ccgcatgcgc    840

accccgtcga acgcccagaa gctccagcag cttgcggatg cttactaccg cgtggctcgc    900

tcgtgcatga aggttccgcg ctgcgtcggc atgaccattt ggggcgtcac tgaccggtac    960

tcgtgggttc ccaacacctt ccgcggtgag ggtgatgcgc tcctttggga cagcaactac   1020

cagaggaagg ccgcttacaa cgctttcctc cgcggcatcc aggagcccgt caactaa      1077

本发明通过RT-PCR的方法分离克隆了木聚糖酶基因xyn10A，cDNA全序列分析结果表明，木聚糖酶XYN10A基因xyn10A全长1077bp。其中，信号肽的碱基序列如SEQ ID NO.6所示：

atgcgtttct ccgcctccct gctccttgcc ctgacgggct ccgctgccgc c              51

因此，成熟的木聚糖酶XYN10A的基因序列如SEQ ID NO.5所示：

agccctatcc gggctgagga agagatccgg gtgtacgact tgcccatctc actgttcgat     60

gatctgcagg gtctggatgc tgccatgaag gctgccggaa gggagtacat cggcacctcc    120

ctcaccgtga ggaacgactt ccaggagcag aacatcatcc gcactgagtt cggctcgatc    180

acgcccgaga acgcccagaa gtgggacgcc accgagccca accgcggcca gtttaccttc    240

ggctctgccg accagcacat ggactgggcc cgccagaacg ggaagcacgt ccgctgccac    300

acccttgtct ggtactccca gctccccggc tgggtgtcca acagcggctt caacaacgcc    360

accttgcagc aggtgatgca gaatcacatc aaccaagtga tgggccggta ccgtggccgc    420

tgcaaccact gggatgtcgt caatgaggct cccaggctga tggccatgcg attgcagatc    480

ggagaggcgt atatcccgat tgctttcagg atggccgccc aggccgatcc ctcggccaag    540

ctctactaca atgactacaa cctcgagtat ctcggaccca aggttgaggg tgctgcccgc    600

atcgtgcgcc ttgtcaagca gtacggcgct cgcatcgacg gtgtcggcta tcaggctcac    660

cttgtcaccg agcccacccc gactcagtcc accccgactc cgtctgagga ggacctcatc    720

aaggctctgc gtatcaccgc tgacctcggt gtcgatgtcg cctacaccga gattgatatc    780

cgcatgcgca ccccgtcgaa cgcccagaag ctccagcagc ttgcggatgc ttactaccgc    840

gtggctcgct cgtgcatgaa ggttccgcgc tgcgtcggca tgaccatttg gggcgtcact    900

gaccggtact cgtgggttcc caacaccttc cgcggtgagg gtgatgcgct cctttgggac    960

agcaactacc agaggaaggc cgcttacaac gctttcctcc gcggcatcca ggagcccgtc   1020

aactaa                                                              1026

成熟蛋白理论分子量为38.7kDa，将木聚糖酶基因xyn10A序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于Chaetomium globosum CBS148.51假设的第十家族木聚糖酶氨基酸序列一致性为71％，与发表的来源于Penicillium funiculosum的木聚糖酶氨基酸序列一致性为46％。说明木聚糖酶基因xyn10A是一种新的木聚糖酶基因。

本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xyn10A的重组载体，优选为pPIC9-xyn10A。将本发明的木聚糖酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的木聚糖酶基因***到质粒pPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn10A。

本发明还提供了包含上述高温碱性木聚糖酶基因xyn10A的重组菌株，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10A。

本发明还提供了一种制备上述高温碱性木聚糖酶XYN10A的方法，包括以下步骤：

1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN10A的表达；以及

3)回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10A。

其中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞、啤酒酵母细胞或多型逊酵母细胞，优选将重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichia pastoris)GS115，得到重组菌株GS115/xyn10A。

本发明还提供了上述高温碱性木聚糖酶XYN10A的应用，优选其在水解木聚糖及其在造纸、纺织工业中的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在造纸、纺织工业中应用新的木聚糖酶。本发明的木聚糖酶最适pH 7.0，并在pH 5.0-10.0范围内具有75％以上的酶活力，而且在pH 12.0仍具有50％以上的酶活力；具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH 4.0-12.0之间，剩余酶活性均在95％以上；最适温度70℃。此外，木聚糖酶XYN10A可有效降解各种不同类型的木聚糖，而不降解纤维素，可以有效降解漂白纸浆中的木聚糖部分而不影响纤维素。因此，本发明的木聚糖酶将在造纸、纺织工业的应用中显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组木聚糖酶的最适pH。

图2重组木聚糖酶的pH稳定性。

图3重组木聚糖酶的最适温度。

图4重组木聚糖酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：毕赤酵母表达载体pPIC9及菌株GS115购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Promega公司。底物购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

(1)重组毕赤酵母菌培养基为马铃薯汁培养基：1000mL马铃薯汁，10g葡萄糖，25g琼脂，pH 5.0。

(2)大肠杆菌培养基LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH 7.0)。

(3)BMGY培养基：1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)。

(4)BMMY培养基：除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份均与BMGY相同，pH4.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1木聚糖酶编码基因Xyn10A的克隆

提取腐殖霉Humicola sp.S8基因组DNA：

培养3天后将菌丝体高速离心后取入研钵中，液氮冻制研磨5min，然后将研磨液置于50mL离心管中，加入2mL CTAB提取液，70℃水浴锅裂解2h，每隔10min混匀一次，在4℃下12000rpm离心10min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置10min后，4℃下12000rpm离心10min。弃上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两次，真空干燥，加入0.2mL TE溶解，置于-20℃备用。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守(WDVVNE和NDY(F)NL(I)EY)序列设计合成了简并引物P1，P2：

P1：5′-TGGGAYGTNGTNAAYGARGC-3′；

P2：5′-TAYTCTATRTTRWARTCRTT-3′。

以Humicola sp.S8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃降落45℃(每个循环降落0.5℃)退火30sec，72℃延伸30s，十个循环；94℃变性30s，45℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃保温10min。得到一约141bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各二条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，第二条引物的位置设计在第一条引物的内侧。每两个引物之间的距离为50bp左右，引物长度一般22-30nt，退火温度在60℃。并将它们分别命名为usp1，usp2(上游特异性引物)，dsp1，dsp2(下游特异性引物)见表1。

表1.木聚糖酶XYN10A TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后再通过RT-PCR方法获得XYN10A木聚糖酶基因全长1077bp(SEQ ID NO.4)，编码358个氨基酸(SEQ ID NO.1)和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明N端17个氨基酸为预测的信号肽(SEQ ID NO.3)。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为38.7kDa。

实施例2重组木聚糖酶的制备

将表达载体pPIC9进行双酶切(SpeI+NotI)，同时将扩增到编码木聚糖酶的基因xyn10A(不含信号肽)双酶切(EcoR I+Not I)，切出编码木聚糖酶的基因片段与表达载体pPIC9连接，获得含有木聚糖酶基因xyn10A的重组质粒pPIC9-xyn10A并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10A；同样，将包含有信号肽序列的木聚糖酶XYN10A的cDNA通过酶切、连接方法***已去除α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9中，获得含信号肽序列的编码木聚糖酶的基因xyn10A的重组质粒pPIC-xyn10A-1并转化毕赤酵母GS115，获得重组毕赤酵母菌株GS115/xyn10A-1。

分别取含有两种重组质粒的GS115菌株，分别接种于300mL BMGY培养液中，30℃250rpm振荡培养48h后，离心收集菌体。然后于100mL BMMY培养基重悬，30℃250rpm振荡培养。诱导72h后，离心收集上清。测定木聚糖酶的活力。重组菌株GS115/xyn10A的重组木聚糖酶的表达量为24.5U/mL，相比之下，重组菌株GS115/xyn10A-1的重组木聚糖酶的表达量低于前者。SDS-PAGE结果表明，重组木聚糖酶在毕赤酵母中得到了表达。重组木聚糖酶的比活为74.6U/mg。

实施例3重组木聚糖酶的活性分析

纯化重组菌株GS115/XYN10A和GS115/XYN10A-1所产重组木聚糖酶，使用DNS法进行活性分析。

DNS法：具体方法如下：在pH 7.0，60℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，900μL底物，反应10min，加入1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol还原糖的酶量。

实施例4重组木聚糖酶XYN10A的性质测定

1、重组木聚糖酶XYN10A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将实施例3纯化的重组木聚糖酶在不同的pH下测定其最适pH。桦木木聚糖在不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中37℃下进行酶活力测定。结果(图1)表明，重组酶XYN10A的最适pH为7.0，在pH 5.0-10.0有75％以上的相对酶活性。木聚糖酶在以上各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH 7.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH稳定性。结果(图2)表明木聚糖酶在pH 4.0-12.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在95％以上，这说明此酶在中性和碱性范围内具有很好的pH稳定性。

2、木聚糖酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

木聚糖酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木聚糖酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，XYN10A在60℃下温育1h，能保持原有的酶活性的75％。

3、木聚糖酶的K_m值测定方法如下：

以不同浓度的桦木木聚糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 7.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的K_m值。经测定，K_m值为3.2mg/mL，最大反应速度V_max为101.5μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对XYN10A酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入1mmol/L的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在60℃、pH 7.0条件下测定酶活性。结果表明(表2)，Fe³⁺、Ag⁺对酶活有部分抑制作用，SDS强烈抑制其活性，而Mn²⁺和巯基乙醇对酶活都有一定的促进作用，其它金属离子和EDTA对酶活的影响不大。

表2.各种化学试剂及离子的对木聚糖酶XYN10A的影响

5、重组木聚糖酶的底物特异性

该酶除可作用于桦木木聚糖外，对于榉木木聚糖、可溶性小麦***木聚糖也有较高的降解作用(表3)，但该酶不降解纤维素钠。其桦木木聚糖降解产物主要为木糖、木二糖、木三糖和其他寡糖。

表3.木聚糖酶XYN10A底物特异性

Claims (9)

1.一种高温碱性木聚糖酶XYN10A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1或2所示。

2.一种高温碱性木聚糖酶基因xyn10A，其特征在于，编码权利要求1所述的高温碱性木聚糖酶XYN10A。

3.根据权利要求2所述的高温碱性木聚糖酶基因xyn10A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示。

4.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xyn10A的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-xyn10A，将权利要求2所述聚糖酶基因xyn10A***到质粒pPIC9上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPIC9-xyn10A。

6.包含权利要求2或3所述高温碱性木聚糖酶基因xyn10A的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备高温碱性木聚糖酶XYN10A的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶XYN10A的表达；以及

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XYN10A。

9.权利要求1所述高温碱性木聚糖酶XYN10A用于降解木聚糖的应用。

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