CN102718984A - 氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法，以1,4-二氧六环为溶剂，制备表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，以表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，氧氟沙星和17β-***两种抗生素为模板，采用表面印迹技术制备成氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球，本发明的制备方法反应条件温和，能够制备出对氧氟沙星和17β-***都有较好的识别性能、能够快速吸附与解吸且稳定性好的双模板分子印迹复合微球，实现了对两类或多类痕量组分的同时纯化富集，为食品中多种药物的同时快速检测提供参考。

Description

氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法

技术领域

本发明属于分子印迹复合微球的合成技术领域，特别是涉及一种氧氟沙星和17-***双模板分子印迹复合微球的制备方法。

背景技术

抗生素在医学上有重要的应用，但它们的代谢产物与人类的某些疾病却有着密切关系，可通过生命体的代谢进入环境，或作为合成其他新型抗生素的母体化合物随工业废物进入环境，对人和其他生物的健康、生态生存环境都会造成直接或间接的危害。Sanderson曾对药物的风险评价中公开，根据危害人体健康和环境的程度依次排列为：抗生素>***>心血管药物>抗肿瘤药物。氧氟沙星是第三代喹诺酮类(FQs)广谱抗生素，***是一类干扰人类和其他动物内分泌***的有毒有机污染物，会使机体的稳定性和调控作用发生紊乱，***中的17β-***能够提高可食动物的瘦肉比和产量，也常被用于养殖业中，如果长期食用动物性食品，其中残留的抗生素药物通过食物链可能会在人体内沉积，从而对食用者产生一定的毒性以及潜在致癌、致畸、致突变等作用；因此，残留的抗生素和***引起的安全问题不容忽视，尤其是农产品及食品中该类药物残留的分析检测应给予高度的重视。但是，通常多种抗生素同时以痕量或超痕量存在于食品或环境中，这对正确分析它们的含量和风险评估带来了一定的难度。利用分子印迹聚合物（MIP）的高识别能力，将MIP应用于药物残留的分离与富集，可解决目前药物残留分析速度、灵敏度和回收率低的问题，同时还可以降低分析成本。

目前合成的分子印迹聚合物（MIP）多数采用单一的模板分子，当多种药物残留时，其仅能检测出其中的一种，不能同时检测其他共存的药物，这样，导致在检测过程中发生漏检或者检测繁琐的问题。也有人将同类药物中的多种药物做模板，或者以两种异构体为模板，利用本体法合成分子印迹聚合物，但是，其仍然是同类药物，仅能检测出同类的药物，而且其在制备过程中工艺繁琐、费时费力且由过筛选择的粒子粒径范围分布较宽，会导致装填质量较差。

发明内容

为了解决现有技术中分子印迹聚合物的合成过程中所存在的不足，本发明提供了一种以氧氟沙星和17β-***为模板的双模板分子印迹复合微球的制备方法。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法包括以下步骤：

1）合成单分散聚苯乙烯分散液

将苯乙烯和偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入无水乙醇中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1：0.01～0.04：0.1～0.3：7.5～9，超声分散，通氮气除氧，搅拌，70℃反应24小时，制备成聚苯乙烯；将聚苯乙烯用质量分数为0.2%的十二烷基硫酸钠水溶液超声分散，得到单分散聚苯乙烯分散液；

2）制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将过氧化苯甲酰与甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂溶液加入环己醇与甲苯的混合溶剂中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂溶液的质量比为1：2：0.15：2：3：60，用细胞破碎仪在功率为300～500W下超声，每间隔10～20秒超声1次，每次超声10～20秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1）的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1：0.1，30℃搅拌溶胀10小时，通氮气除氧，70℃聚合反应24小时，过滤，依次用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空干燥4小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

3）抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将步骤2）制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中140℃抽提48小时，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

4）单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基

将步骤3）制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1,4-二氧六环中，每100mL 1,4-二氧六环中加入3～10g单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4～12小时，通氮气除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1,4-二氧六环、三氟化硼***的质量比为1：2～5：4～6的混合液，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1：0.1～2，30～60℃搅拌8～15小时，过滤，产物依次用1,4-二氧六环、甲醇、蒸馏水、丙酮洗涤，真空干燥，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

5）制备氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球

将17β-***与甲基丙烯酸、乙腈按照质量比为1：2.5～15：250～563的量混合，超声分散，在室温下预聚合4～12小时，转速为30～150转/分；

将氧氟沙星与甲基丙烯酸、乙腈按照质量比为1：2～12：200～400的量混合，超声分散，在室温下预聚合4～12小时，转速30～150转/分；

将17β-***、甲基丙烯酸、乙腈的混合液与氧氟沙星、甲基丙烯酸、乙腈的混合液混合，加入步骤4）的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球中，添加乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：20～120：8～20：1～2，通氮气除氧，60～70℃反应16～48小时，用甲醇和乙酸的混合液洗脱除去氧氟沙星和17β-***，乙酸和甲醇的体积比为1：4，用甲醇与水洗涤至产物表面呈中性，干燥，制备成氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球。

上述步骤1）中聚乙烯吡咯烷酮规格为k-30，数均分子量为40000。

上述步骤2）分散剂为质量分数为0.4%的十二烷基硫酸钠溶液和质量分数为4%的聚乙烯醇溶液以体积比为1:1的比例混合，聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88%。

上述步骤5）中17β-***与氧氟沙星与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：40～80：12～18：1～2。

本发明以1,4-二氧六环为溶剂，制备表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，以表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球为载体，氧氟沙星和17β-***两种抗生素为模板，采用表面印迹技术制备成氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球，本发明的制备方法反应条件温和，能够制备出对氧氟沙星和17β-***都有较好的识别性能、能够快速吸附与解吸且稳定性好的双模板分子印迹复合微球，实现了对两类或多类痕量组分的同时纯化富集，为食品中多种药物的同时快速检测提供参考。

附图说明

图1是氧氟沙星在印迹柱和非印迹柱上保留的色谱图。

图2是17β-***在印迹柱和非印迹柱上保留的色谱图。

图3是模板分子及其对比物在印迹柱上保留的色谱图。

图4是本发明的双模板分子印迹复合微球（MIP）和非分子印迹复合微球（NIP）对17β-***的吸附等温曲线。

图5是本发明的双模板分子印迹复合微球（MIP）和非分子印迹复合微球（NIP）对氧氟沙星的吸附等温曲线。

图6是3种喹诺酮类物质和3种***类物质经双模板分子印迹复合微球（MIP）、硅胶（Silica）、硅酸镁（Florisil）和十八烷基键合硅胶（C18）处理后的回收率。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例1

本实施例氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法包括以下步骤：

步骤1：合成单分散聚苯乙烯分散液

将10.908g苯乙烯、0.218g偶氮二异丁腈、1.528g数均分子量为40000的聚乙烯吡咯烷酮k-30（焦作中维化工有限公司）加入盛有96g无水乙醇的250mL单口烧瓶中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1：0.02：0.14：8.8，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散20分钟，通氮气15分钟除氧，搅拌，70℃反应24小时，离心分离，用无水乙醇洗涤，制备成聚苯乙烯；将0.2g聚苯乙烯在功率为80W下超声分散于10mL质量分数为0.2%的十二烷基硫酸钠水溶液中，得到单分散聚苯乙烯分散液；

步骤2：制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将过氧化苯甲酰0.1559g、甲基丙烯酸环氧丙酯1.92g、乙二醇二甲基丙烯酸酯3.118g以及由质量分数为0.4%的十二烷基硫酸钠与质量分数为4%的聚乙烯醇（聚合度为1700，醇解度为88%）按照体积比为1:1的比例混合制成的分散剂溶液62.35g加入盛有1.92g环己醇和1.0392g甲苯的250mL烧杯中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂溶液的质量比为1：2：0.15：2：3：60，用细胞破碎仪在功率为400W下超声，每间隔15秒超声1次，每次超声15秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1得到的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1：0.1，120转/分钟搅拌，30℃溶胀10小时，通氮气20分钟除氧，70℃聚合反应24小时，用玻砂漏斗抽滤，用70℃蒸馏水洗涤，再依次用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空干燥4小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤3：抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将步骤2制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球置于索式提取器中，加入50mL甲苯，140℃抽提48小时，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，在真空度为0.06MPa下60℃干燥3小时，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤4：单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基

将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球2.0g加入50mL1,4-二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入2.0g甲基丙烯酸羟乙酯、5.2g 1,4-二氧六环、10.0g三氟化硼***的混合液，甲基丙烯酸羟乙酯与1,4-二氧六环、三氟化硼***的质量比为1：2.6：5，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1：1，45℃搅拌12小时，过滤，产物依次用1,4-二氧六环、甲醇、蒸馏水、丙酮洗涤，30℃真空干燥2小时，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤5：制备氧氟沙星、17β-***整合模板分子印迹复合微球

将氧氟沙星18mg与甲基丙烯酸126mg溶于5.4g乙腈中，氧氟沙星与甲基丙烯酸、乙腈的质量比为1：7：300，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合8小时，制备成混合液（Ⅰ）；

将17β-***14mg与甲基丙烯酸126mg溶于5300g乙腈中，17β-***与甲基丙烯酸、乙腈质量比为1：9：380，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合8小时，制备成混合液（II）；

将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球0.98g，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯56mg作为交联剂、偶氮二异丁腈21mg作为引发剂，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：70：14：1.5，通氮气20分钟除氧，65℃聚合反应24小时，产物先依次用蒸馏水、甲醇洗涤，再用甲醇与乙酸的体积比为4:1的洗脱液洗脱24小时，除去氧氟沙星、17β-***，产物用蒸馏水洗至中性，再用甲醇洗涤，30℃真空干燥2小时，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例2

以制备氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球为例，其制备方法包括以下步骤：

步骤1：合成单分散聚苯乙烯分散液

将10.908g苯乙烯、0.11偶氮二异丁腈、1.09g平均分子量为40000的聚乙烯吡咯烷酮k-30加入盛有82g无水乙醇的250mL单口烧瓶中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1：0.01：0.1：7.5，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散20分钟，通氮气15分钟除氧，其他的操作与实施例1相同，得到单分散聚苯乙烯分散液；

步骤2：与实施例1相同，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤3：与实施例1的相同，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤4：单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基

将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球2g加入50mL1,4-二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入0.2g甲基丙烯酸羟乙酯、0.4g 1,4-二氧六环、0.8g三氟化硼***的混合液，混合液中甲基丙烯酸羟乙酯与1,4-二氧六环、三氟化硼***的质量比为1：2：4，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1：0.1，其他操作与实施例1相同，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤5：合成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球

将17β-***14mg（0.05mmol）与甲基丙烯酸35mg溶于3.5g乙腈中，17β-***与甲基丙烯酸、乙腈质量比为1：2.5：250，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（II）；

将氧氟沙星18mg（0.05mmol）与甲基丙烯酸36mg溶于3.6g乙腈中，氧氟沙星与甲基丙烯酸、乙腈的质量比为1：2：200，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（Ⅰ）；

将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球0.28g，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯112mg作为交联剂、偶氮二异丁腈14mg作为引发剂，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：20：8：1，其他操作与实施例1相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例3

本实施例氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法包括以下步骤：

步骤1：合成单分散聚苯乙烯分散液

将10.908g苯乙烯、0.4363g偶氮二异丁腈、3.2724g平均分子量为40000的k-30聚乙烯吡咯烷酮加入盛有98g无水乙醇的250mL单口烧瓶中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1：0.04：0.3：9，其他的操作与实施例1相同，得到单分散聚苯乙烯分散液；

步骤2：与实施例1相同，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤3：与实施例1相同，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤4：单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基

将步骤3制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.0g加入50mL1,4-二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀6小时，通氮气20分钟除氧，加入2.0g甲基丙烯酸羟乙酯、10.0g 1,4-二氧六环、12.0g三氟化硼***的混合液，甲基丙烯酸羟乙酯与1,4-二氧六环、三氟化硼***的质量比为1：5：6，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1：2，其他的操作与实施例1相同，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

步骤5：合成氧氟沙星、17β-***整合模板分子印迹复合微球

将17β-***14mg（0.05mmol）与甲基丙烯酸210mg溶于7.88g乙腈中，17β-***与甲基丙烯酸、乙腈质量比为1：15：563，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（II）；

将氧氟沙星18mg（0.05mmol）与甲基丙烯酸216mg溶于7.20g乙腈中，氧氟沙星与甲基丙烯酸、乙腈的质量比为1：12：400，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（Ⅰ）；

将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.68g，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯280mg作为交联剂、偶氮二异丁腈28mg作为引发剂，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：120：20：2，其他操作与实施例1相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例4

在上述实施例1~3的步骤5中，将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球0.56g，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯168mg作为交联剂、偶氮二异丁腈14mg作为引发剂，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：40：12：1，本步骤中其他操作与相应的实施例相同。

其他的步骤与相应的实施例相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例5

在上述实施例1~3的步骤5中，将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球1.12g，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯252mg作为交联剂、偶氮二异丁腈28mg作为引发剂，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：80：18：2，本步骤中其他操作与相应的实施例相同。

其他的步骤与相应的实施例相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例6

上述实施例1~5中，在步骤2中将过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、十二烷基硫酸钠与聚乙烯醇的混合物水溶液加入盛有环己醇与甲苯的250mL烧杯中，用细胞破碎仪在功率为300W下超声，每间隔10秒超声1次，每次超声10秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1得到的单分散聚苯乙烯分散液中，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

在步骤4中，将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球按照每100mL1,4-二氧六环中加入3g单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的量加入1,4-二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀4小时，通氮气20分钟除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯、1,4-二氧六环、三氟化硼***的混合液，60℃搅拌8小时，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

在步骤5中，将氧氟沙星与甲基丙烯酸溶于乙腈中，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，30转/分钟搅拌，室温预聚合12小时，制备成混合液（Ⅰ）；将17β-***与甲基丙烯酸溶于乙腈中，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，30转/分钟搅拌，室温预聚合12小时，制备成混合液（II）；将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气20分钟除氧，60℃聚合反应48小时，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同。

其他的步骤与相应的实施例相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

实施例7

上述实施例1~5中，在步骤2中将过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、十二烷基硫酸钠与聚乙烯醇的混合物水溶液加入盛有环己醇与甲苯的250mL烧杯中，用细胞破碎仪在功率为500W下超声，每间隔20秒超声1次，每次超声20秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1得到的单分散聚苯乙烯分散液中，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

在步骤4中，将单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球按照每100mL1,4-二氧六环中加入10g单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的量加入1,4-二氧六环中，200转/分钟搅拌，室温溶胀12小时，通氮气20分钟除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯、1,4-二氧六环、三氟化硼***的混合液，30℃搅拌15小时，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。

在步骤5中，将氧氟沙星与甲基丙烯酸溶于乙腈中，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，150转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（Ⅰ）；将17β-***与甲基丙烯酸溶于乙腈中，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，150转/分钟搅拌，室温预聚合4小时，制备成混合液（II）；将混合液（Ⅰ）与混合液（II）混合，加入步骤4得到的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈，通氮气20分钟除氧，70℃聚合反应16小时，本步骤中其他的操作与相应的实施例相同。

其他的步骤与相应的实施例相同，制备成氧氟沙星、17β-***双模板分子印迹复合微球。

为了验证本发明的有益效果，发明人采用本发明实施例1制备的氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球和对比例1制备的非分子印迹复合微球进行了各种试验，具体试验情况如下：

对比例1的双模板非分子印迹复合微球的制备方法是按照本发明实施例1中的步骤1～4的方法制备表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球。不添加模板分子氧氟沙星、17β-***，直接将甲基丙烯酸70μL（0.8mmol）溶于15mL乙腈中，用超声波清洗器在功率为80W下超声分散5分钟，50转/分钟搅拌，室温搅拌4小时。加入0.8g表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，加入乙二醇二甲基丙烯酸酯300μL（3mmol）、偶氮二异丁腈20mg（0.12mmol），通氮气20分钟除氧，70℃聚合反应24小时，产物依次用蒸馏水、甲醇洗涤，30℃真空干燥2小时，制备成非分子印迹复合微球。

实验试剂：过氧化苯甲酰(BPO，A.R.天津市福晨化学试剂厂)；甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA，Sigma-Aldrich）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA，Sigma-Aldrich）；甲基丙烯酸（MAA，Sigma-Aldrich）；甲基丙烯酸羟乙酯（HEMA，Sigma-Aldrich）；1,4-二氧六环（A.R.天津市福晨化学试剂厂）；N，N-二甲基甲酰胺（DMF，天津市福晨化学试剂厂）；17β-***，雌三醇和雌酮，均采购自上海晶纯实业有限公司；氧氟沙星、诺氟沙星和氯霉素均购买于陕西省食品药品检验所；槲皮素。

1、色谱实验

称取氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球（MIP）、非分子印迹复合微球（NIP）各0.8g置于30mL异丙醇中，超声匀浆10分钟，在20MPa压力下，以乙腈作为顶替液，湿法装柱（50mm×4.6mm），以乙腈为流动相，直到获得稳定的基线。以双模板分子印迹复合微球填充的色谱柱称为印迹柱，以非分子印迹复合微球填充的色谱柱称为非印迹柱。以甲醇-水溶液（80/20，v/v）为流动相，流速为0.8mL/分钟，进样量为10.0μL，样品：氧氟沙星20μg/mL，17β-***20μg/mL的乙腈水溶液；检测波长为280nm，考察了印迹柱、非印迹柱对模板分子的保留情况，参见表1以及印迹柱的特异选择性，参见图1~5，具体如下：

表1两种模板分子及其对比物在印迹柱、非印迹柱上的保留情况

从表1可以看出，印迹柱不仅对两种模板分子氧氟沙星和17β-***有特异选择性，而且对氧氟沙星的结构类似物诺氟沙星、17β-***的结构类似物雌三醇也有一定的特异选择性，而非印迹柱对五种物质的保留都很弱，不具备特异选择性，进一步说明非印迹聚合物中并不存在和模板结构相匹配的印迹空穴，与所有物质的结合作用都是非特异性的。

由图1可知，在40%的甲醇-水溶液为流动相的条件下，模板之一的氧氟沙星在印迹柱上50分钟之内都没有被洗脱下来，呈现出很强的保留行为，而其在非印迹柱上几乎没有保留，这说明双模板分子印迹复合微球对氧氟沙星有较好的特异性吸附性能。

由图2可知，在相同的分离条件下，另一模板17β-***在印迹柱上的保留比非印迹柱强，表明双模板分子印迹复合微球对模板分子17β-***具有很强的特异性吸附。

从图3可以看出，在印迹柱上，模板分子氧氟沙星在50分钟没有被洗脱下来，具备很强的保留行为，另一模板分子17β-***的保留也远大于对比物槲皮素的保留，双模板分子印迹复合微球对其不具备识别能力。

从图4和图5可以看出，两个模板分子氧氟沙星和17β-***在双模板分子印迹聚合物（MIP）的吸附容量均大于两者在双模板非分子印迹聚合物（NIP）的吸附容量，并且双模板分子印迹聚合物（MIP）对两种模板的吸附容量基本相同。合成过程中加入的两种模板是等物质的量，说明印迹效果对两种模板来说是等价的，不因两者的性质差异而选择性吸附不同。

2、样品分析

牛奶：称取样品2.0g(精确至0.001g)，置于25ml容量瓶中，用V(乙腈)：V(水)=85%：15%的混合液定容至刻度，80W超声30min混匀，移至离心管中，10000rpm/min离心10min，取上层清液加入一定浓度的待测物，过自制的印迹柱和其他商品化固相萃取填料自制的固相萃取小柱，用氮气将洗脱液吹至近干，甲醇定容，经微孔滤膜（0.22μm）过滤后供HPLC-UV分析，回收率如图6。

流动相A：甲醇，流动相B：0.2%的甲酸水溶液；梯度：0-15min，A：28%；15-35min，A：28%-70%。流速0.8mL/min，检测波长：280nm。6种物质的加标牛奶(2μg/mL)经十八烷基键合硅胶（C18）、硅胶（silica）和硅酸镁（Florisil）和双模板分子印迹复合微球（MIP）处理后经0.22μm的微孔滤膜过滤，供HPLC-UV分析。

图6为6种抗生素（氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星、17β-***、雌三醇和雌酮）的加标牛奶（2μg/mL）经十八烷基键合硅胶（C18）、硅胶（silica）、硅酸镁（Florisil）和双模板分子印迹复合微球（MIP）处理后，在各自最优的萃取条件下的回收率，由图可看出，经MIP对氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星的回收率分别为：90%、89%和98%，对17β-***、雌三醇和雌酮三种***的回收率都在80%以上，且均高于商品化的固相萃取吸附剂十八烷基键合硅胶（C18）、硅胶（silica）和硅酸镁（Florisil），由此可见双模板分子印迹复合微球可作为高选择性的固相萃取吸附材料实现对喹诺酮类物质和***类物质痕量组分的同时纯化富集，为食品中多种药物的同时快速检测提供参考。

Claims (4)

1.一种氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法，包括以下步骤：

1）合成单分散聚苯乙烯分散液

将苯乙烯和偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮加入无水乙醇中，苯乙烯与偶氮二异丁腈、聚乙烯吡咯烷酮、无水乙醇的质量比为1：0.01～0.04：0.1～0.3：7.5～9，超声分散，通氮气除氧，搅拌，70℃反应24小时，制备成聚苯乙烯；将聚苯乙烯用质量分数为0.2%的十二烷基硫酸钠水溶液超声分散，得到单分散聚苯乙烯分散液；

2）制备单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将过氧化苯甲酰与甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂溶液加入环己醇与甲苯的混合溶剂中，甲苯与环己醇、过氧化苯甲酰、甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、分散剂溶液的质量比为1：2：0.15：2：3：60，用细胞破碎仪在功率为300～500W下超声，每间隔10～20秒超声1次，每次超声10～20秒，超声乳化至上层无油滴，加入到步骤1）的单分散聚苯乙烯分散液中，甲基丙烯酸环氧丙酯与单分散聚苯乙烯分散液中聚苯乙烯的质量比为1：0.1，30℃搅拌溶胀10小时，通氮气除氧，70℃聚合反应24小时，过滤，依次用甲醇、丙酮洗涤，60℃真空干燥4小时，制备成单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

3）抽提单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球

将步骤2）制备的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球用甲苯在索式提取器中140℃抽提48小时，依次用无水乙醇、丙酮洗涤，干燥，得到单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

4）单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球表面键合乙烯基

将步骤3）制备的单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球加入1,4-二氧六环中，每100mL 1,4-二氧六环中加入3～10g单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球，室温搅拌溶胀4～12小时，通氮气除氧，加入甲基丙烯酸羟乙酯与1,4-二氧六环、三氟化硼***的质量比为1：2～5：4～6的混合液，单分散多孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球与甲基丙烯酸羟乙酯的质量比为1：0.1～2，30～60℃搅拌8～15小时，过滤，产物依次用1,4-二氧六环、甲醇、蒸馏水、丙酮洗涤，真空干燥，得到表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球；

5）制备氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球

将17β-***与甲基丙烯酸、乙腈按照质量比为1：2.5～15：250～563的量混合，超声分散，在室温下预聚合4～12小时，转速为30～150转/分；

将氧氟沙星与甲基丙烯酸、乙腈按照质量比为1：2～12：200～400的量混合，超声分散，在室温下预聚合4～12小时，转速30～150转/分；

将17β-***、甲基丙烯酸、乙腈的混合液与氧氟沙星、甲基丙烯酸、乙腈的混合液混合，加入步骤4）的表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球中，添加乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈，17β-***与氧氟沙星、表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：20～120：8～20：1～2，通氮气除氧，60～70℃反应16～48小时，用甲醇和乙酸的混合液洗脱除去氧氟沙星和17β-***，乙酸和甲醇的体积比为1：4，用甲醇与水洗涤至产物表面呈中性，干燥，制备成氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球。

2.根据权利要求1所述的氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于：所述步骤1）中聚乙烯吡咯烷酮的规格为k-30，数均分子量为40000。

3.根据权利要求1所述的氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于：所述步骤2）分散剂为质量分数为0.4%的十二烷基硫酸钠和质量分数为4%的聚乙烯醇以体积比为1:1的比例混合，聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88%。

4.根据权利要求1所述的氧氟沙星和17β-***双模板分子印迹复合微球的制备方法，其特征在于：步骤5）中17β-***与氧氟沙星与表面键合乙烯基的单分散交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈质量比为1：1.25：40～80：12～18：1～2。

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