CN102713574A - 荧光检测装置、荧光检测方法以及荧光信号的信号处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种荧光检测装置、荧光检测方法以及荧光信号的信号处理方法，荧光检测装置用受光元件接收测量对象物受以规定频率调制的激光照射后发出的荧光，并输出输出电平被调节的荧光信号，信号处理部通过将所输出的荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据，分析装置计算出测量对象物发出的荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的第一相位偏差，进行与输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，分析装置进一步利用所计算出的第二相位偏差计算出测量对象物发出的荧光的荧光弛豫时间。
Description
技术领域
本发明涉及对测量对象物接收荧光照射后发出的荧光的荧光信号进行处理的荧光检测装置、荧光检测方法以及荧光信号的信号处理方法。
背景技术
在医疗、生物领域中广泛应用流式细胞仪。该流式细胞仪用光电倍增管或雪崩光电二极管等光电转换器接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并分析细胞或基因等的测量对象物的种类或数量，进一步分析测量对象物的特性。
具体地说，流式细胞仪如下形成分层鞘流：使利用荧光试剂对细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质等的分析对象物进行标签化而制作的测量对象物在施加压力而以每秒大约10m以内的速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。通过流式细胞仪向该流动中的测量对象物照射激光，由此流式细胞仪接收测量对象物上附着的荧光色素发出的荧光，并将该荧光作为分析对象物的标签进行识别，由此规定分析对象物。
该流式细胞仪例如能够测出细胞内的DNA、RNA、酶、蛋白质等的细胞内的相对量，并在短时间内能够分析这些对象物的作用。另外，流式细胞仪通过荧光判别规定类型的细胞或染色体，并用细胞分类器等仅将所判别的细胞或染色体以活着的状态下短时间内进行分选收集。
在该流式细胞仪的使用中，要求在短时间内根据荧光信息对更多的测量对象物进行正确规定。
例如，已公开了通过计算出受激光照射后测量对象物的荧光色素发出的荧光的荧光寿命（荧光弛豫时间），能够在短时间内对更多的测量对象物进行正确规定的荧光检测装置及方法（专利文献1）。
根据上述荧光检测装置，荧光检测装置对激光进行强度调制后照射至测量对象物上，并用光电转换器接收从测量对象物发出的荧光，并求出从光电转换器输出的荧光信号相对于用于激光强度调制的调制信号的相位偏差，并根据该相位偏差计算出荧光弛豫时间。
专利文献1：特开2006-226698号公报
发明内容
用于上述荧光弛豫时间的计算的相位偏差，除了接收荧光的光电转换器自身特性所导致的相位偏差、装置的激光或荧光的光路长度之外，还去除根据电路长度的相位差的影响而计算。但是，用于上述荧光弛豫时间的计算的相位偏差根据从光电转换器输出的荧光信号的输出电平发生微妙的变化，因此有时并不能计算出正确的荧光弛豫时间的值。特别是，判断是否有FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer：共振能量转移）时，要求计算出正确的荧光弛豫时间的值。
因此，为了解决上述问题，本发明的目的在于，提供一种荧光检测装置和荧光检测方法以及用于该荧光检测装置和荧光检测方法的荧光信号的信号处理方法，在对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理时，能够计算出正确的荧光弛豫时间。
本发明的一个方式是，对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行处理的荧光检测装置。该荧光检测装置包括：光源部，以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射；受光部，包括受光元件，接收测量对象物受所述激光照射后发出的荧光，并输出输出电平被调节的荧光信号，能够调节所述输出电平；第一处理部，通过将所述荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据；第二处理部，利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间。
优选的是，所述受光部包括通过施加给所述受光元件的调节参数来调节所述输出电平的调节部。
此时，优选的是，当进行所述校正时，所述第二处理部利用根据所述调节参数值规定的校正式。
进一步，优选的是，所述第二处理部预先存储用于所述校正式的常数值，在进行所述校正时，读取所述常数值而利用。
另外，优选的是，所述第二处理部包括输出电平调节部，通过将施加给所述受光元件的调节参数值预先进行变更，求出所述调节参数值和所述输出电平的关系，当所述关系表示所述受光元件的输出电平不饱和时，提取用于所述校正式的所述常数值。
此时，优选的是，所述输出电平调节部按照下述方式提取所述常数：作为测量对象物利用荧光弛豫时间已知的基准对象物而从所述第二相位偏差计算出的荧光弛豫时间通过所述校正后使其近似于所述基准对象物的已知的荧光弛豫时间。
所述受光元件为例如光电倍增管，所述调节参数值为施加于所述光电倍增管的电极的电压。
此时，优选的是，当施加于所述电极的电压为V、所述第一相位偏差为θmeas、所述第二相位偏差为θτ时，所述校正式由下述式表示，
θτ＝Ｘ－θmeas－Ａ·Ｖ(-1/2)
其中，X和A为常数。
另外，优选的是，在所述受光元件的受光面前面设置有能够进行调节的减光滤波器。
本发明的另一方式是，荧光检测装置对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理的荧光检测方法。该方法包括如下步骤：以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射的步骤；用受光元件接收测量对象物受所述激光后发出的荧光，由此输出输出电平被调节的荧光信号的步骤；通过将所述荧光信号与所述规定频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据的步骤；利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间的步骤。
本发明的又另一方式是，荧光检测装置对通过受激光照射而荧光弛豫时间已知的基准测量对象物发出的荧光的荧光信号进行信号处理的方法。该方法包括如下步骤：第一步骤，以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射；第二步骤，用受光元件接收基准对象物受所述激光照射后发出的荧光，由此输出输出电平被调节的荧光信号；第三步骤，通过将所述荧光信号与所述规定频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据；第四步骤，利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，并将所计算出的所述第一相位偏差和为了调节所述输出电平而施加给所述受光元件的调节参数值作为组来存储；第五步骤，变更所述调节参数值，并重复所述第一步骤~所述第四步骤，由此存储多个由所述第一相位偏差和所述调节参数值组成的组；第六步骤，读取所存储的所述多个组，使规定所述调节参数值和所述第一相位偏差的关系的回归式近似于所读取的所述多个组的关系，由此提取包括在所述回归式的未知常数值；第七步骤，存储所提取的所述常数值。
此时，优选的是，按照每重复所述第一步骤~所述第四步骤时所述输出电平减少的方式变更所述调节参数值。
另外，优选的是，所述受光元件所接收的所述荧光按照所述受光元件输出的所述荧光信号的输出电平不饱和的方式在被所述受光元件受光之前通过减光滤波器被减光。
在上述方式的荧光检测装置和荧光检测方法中，在对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行处理时，能够计算出正确的荧光弛豫时间。
另外，在上述方式的荧光信号的信号处理方法中，能够更有效地决定用于为了计算正确的荧光弛豫时间的校正式的常数值。
附图说明
图1为采用本实施方式的荧光检测装置的流式细胞仪的概略构成图；
图2为表示用于图1所示的流式细胞仪的激光光源部构成的一个例的图；
图3为表示用于图1所示的流式细胞仪的受光部的一个例的概略构成的概略构成图；
图4为表示用于图1所示的流式细胞仪的光电倍增管的概略构成的图；
图5为表示用于图1所示的流式细胞仪的控制和处理部的概略构成的图；
图6为表示用于图1所示的流式细胞仪的分析装置的概略构成的图；
图7（a）、（b）为表示提供给图4所示的光电倍增管的控制电压和荧光的相位偏差角θmeas之间的关系的图表；
图8为表示采用图1所示的流式细胞仪决定用于校正式的常数X、A值的流程的例的图；
图9为说明从图4所示的光电倍增管输出的荧光信号的输出电平的饱和的例的图。
附图标记说明
10：流式细胞仪
12：样品
20：信号处理装置
22：激光光源部
22a：光源
23、26a：透镜***
24、26：受光部
26d：电压调节部
27：光电倍增管
27a：负极
27b：聚焦电极
27c：电子倍增部
27c1~27c11：电子倍增器电极
27d1~27d11：正极
27e：芯柱
28：控制和处理部
30：管道
32：回收容器
34：激光驱动器
40：信号生成部
42：信号处理部
44：信号控制部
46：振荡器
48：功率分配器
50、52、54、64：放大器
58：IQ混频器
60：***控制器
62：低通滤波器
66：A/D转换器
80：分析装置
82：CPU
84：存储器
86：相位偏差计算部
88：相位偏差校正部
90：荧光弛豫时间计算部
92：荧光强度计算部
94：输出电平调节部
具体实施方式
以下，详细说明本发明的荧光检测装置、荧光检测方法以及荧光信号的信号处理方法。
图1为采用本实施方式的荧光检测装置的流式细胞仪10的概略构成图。
流式细胞仪10包括信号处理装置20和分析装置（计算机）80。信号处理装置20朝向作为测量对象的样品12照射激光，并对样品12发出的荧光的荧光信号进行检测以进行信号处理。分析装置（计算机）80根据信号处理装置20中得到的处理结果，计算出荧光强度或者荧光弛豫时间。作为样品12的例子，下面利用由带有荧光蛋白（荧光色素）X1的细胞（分析对象物）X2构成的测量对象物进行说明。在本实施方式中，也可以利用除了荧光蛋白以外的荧光色素。分析对象物也除了细胞以外，还可以利用DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质和人工制造的微球等。另外，图1所示的样品12的构成例如为，荧光蛋白X1进入到细胞X2内，由此荧光蛋白X1被放入到细胞X2内而分散。附着在细胞X2的荧光蛋白X1的数并不限定于一个，可以是多个。
信号处理装置20包括激光光源部22、受光部24，26、控制和处理部28、管道30。
控制和处理部28包括：控制部，对从激光光源部22发射的激光按照规定频率进行强度调制；信号处理部，对样品12发出的荧光的荧光信号进行信号处理。在管道30中，使样品12包括在形成高速流的鞘液中，由此形成样品12的流动。
在管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10中也可以配置用来通过激光照射在短时间内分离出样品12中的规定细胞等活体物质的细胞分类器，以将其分离于各自的回收容器中。
激光光源部22是发射规定波长的激光的部分。透镜***按照使激光聚焦在管道30中规定位置的方式设置，并在该聚焦位置上形成样品12的测量点。
图2为表示激光光源部22构成的一个例的图。
激光光源部22发射具有可见光区域波长且进行强度调制的激光。
激光光源部22包括光源22a。光源22a将具有激发荧光蛋白X1的波长的激光L作为CW（连续波）激光发射，且以规定频率f的调制信号对该激光L强度进行强度调制的同时发射。
进一步，激光光源部22包括透镜***23、激光驱动部34。透镜***23使激光L聚焦在管道30中的中心，由此形成测量点。激光驱动器34驱动光源22a。
作为发射激光L的光源，例如，可以利用半导体激光器。激光L的输出功率是例如约5~100mW。
另外，用于对激光L进行强度调制的频率（调制频率）f，其周期与荧光弛豫时间相比稍长，例如为10~50MHz。
光源22a按照激光L激发荧光色素而发出规定波段的荧光的方式以预先规定的波段振荡。当被激光L激发的样品12通过管道30的测量点时，在测量点受到激光L照射。此时，荧光蛋白X1以规定波长发出荧光。
受光部24按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置。受光部24包括光电转换器，通过接收因在测量点上通过的样品12而发生前向散射的激光，由此输出样品12正通过测量点情况的样品12的检测信号。从该受光部24输出的检测信号供给到控制和处理部28以及分析装置80，以通知样品12正通过管道30测量点的时间，用作开始处理的触发信号、处理开始的ON信号和OFF信号。
另一方面，受光部26配置在相对于从激光光源部22发射的激光发射方向垂直的方向且相对于管道30中样品12的移动方向垂直的方向，并包括光电转换器，以用来接收样品12在测量点被激光照射后发出的荧光。在本实施方式中，可以用雪崩光电二极管等公知的光电转换器代替光电倍增管。
图3为受光部26一个例的概略构成图。
图3所示的受光部26包括：对来自样品12的荧光信号进行聚焦的透镜***26a、ND滤波器26b、带通滤波器26c、电压调节部26d、光电倍增管（受光元件）27。
透镜***26a按照使入射至受光部26的荧光在光电转换器27的受光面上聚焦的方式构成。
ND滤波器26b减弱入射至受光部26的荧光。如后面所述，受光部26利用ND滤波器26b的目的是，减弱荧光以实现即使施加于光电倍增管27的正极的控制电压变得最大，但荧光信号的输出电平不会饱和。
带通滤波器26c设置在光电倍增管27的受光面前面，是一种仅透射具有规定波段荧光的滤波器。
光电倍增管27是将光电面上接收的光转换成电信号的受光元件。在此，所输出的荧光信号其输出电平被调节。光电倍增管27所接收的荧光是基于用规定频率进行强度调制的激光，因此输出的荧光信号也是用规定频率改变强度。通过该荧光的受光而输出的荧光信号供给到控制和处理部28。
图4为表示光电倍增管27概略构成的图。光电倍增管27例如在保持10-4Pa程度的真空环境的真空容器内包括在表面上具有受光面的负极27a、聚焦电极27b、光电倍增管27c、正极27d1~27d11，在真空容器的外侧具有芯柱27e。
如果光入射至负极27a，则从负极27a的光电面向真空容器内的真空中发射光电子。该光电子通过聚焦电极27b被导向至光电倍增部27c。光电子通过正极27d1被引诱而与光电倍增部27c的电子倍增器电极27c1冲撞，由此电子倍增器电极27c1发射二次电子。进一步，从电子倍增器电极27c1发射的二次电子通过设置在光电倍增器电极27c2前面的正极27d2被引诱而与电子倍增器电极27c2冲撞，由此电子倍增器电极27c2再次发射二次电子。由此，被正极27dn（n为2以上10以下的整数）引诱而与电子倍增器电极27c3~电子倍增器电极27c10冲撞，因此从电子倍增器电极27c3~电子倍增器电极27c10进一步依次发射二次电子，从而电子被倍增。所倍增的电子被正极27d11引诱而聚集在电子倍增器电极27c11上，由此通过芯柱27e产生荧光电流。
此时，电子的移动速度根据施加于正极27d1~27d11的电压来决定，并根据该电子的移动速度决定与电子倍增器电极27c1~电子倍增器电极27c10冲撞的电子的能量。因此，通过施加于正极27d1~27d11的电压，调节从电子倍增器电极27c1~电子倍增器电极27c10发射的二次电子的量。流式细胞仪10将施加于上述正极27d1~27d11的电压作为控制荧光信号的输出电平的电压使用。
电压调节部26d（参照图3）设定控制荧光信号的输出电平的控制电压并施加于光电倍增管27。电压调节部26d根据后述的分析装置80的输出电平调节部94的指令设定控制电压。电压调节部26d将施加于光电倍增管27的控制电压的信息提供给后述的相位偏差校正部88（参照图6）。
如图5所示，控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42、信号控制部44。
信号生成部40生成用来以规定频率f对激光L强度进行强度调制的调制信号。
具体地说，信号生成部40包括振荡器46、功率分配器48以及放大器50、52。信号生成部40将生成的调制信号供给到激光光源部22的激光驱动器34，同时将调制信号供给到信号处理部42。如后述，将调制信号供给到信号处理部42是用作对从光电倍增管27输出的荧光信号进行检波的参照信号。另外，调制信号是DC成分上载有规定频率的正弦波信号的信号，其频率范围设定成10MHz~50MHz。
信号处理部42是利用输出自光电倍增管27的荧光信号提取通过激光照射所发出的荧光的相位偏差信息。信号处理部42包括：放大器54、IQ混频器58和低通滤波器62。放大器54将从光电倍增管27输出的荧光信号放大。
IQ混频器58是将从光电倍增管27供给的荧光信号与从信号生成部40供给的调制信号作为参照信号进行混合的装置。具体地说，IQ混频器58将参照信号与荧光信号（RF信号）相乘，并生成包括与调制信号相位相同的成分的荧光信号的I信号和包括相对于调制信号相位90度位移的成分的荧光信号的Q信号。包括相位相同的成分的I信号是通过调制信号和荧光信号混合生成，包括相位90度位移的成分的Q信号是通过相位90度位移的调制信号和荧光信号混合生成。
低通滤波器62过滤在IQ混频器58中生成的I信号、Q信号的低频信号。通过该过滤，与调制信号相位相同的荧光信号的成分（Re成分）和相对于调制信号相位90度位移的荧光信号的成分（Im成分）作为荧光数据被提取。被提取的各成分送至信号控制部44。下面，将包括通过IQ混频器58的混合处理和通过低通滤波器62的过滤处理称之为频率下降转换处理，将通过该处理得到的数据称之为荧光数据。
信号控制部44将从信号处理部42供给的荧光信号的Re成分和Im成分放大并进行AD转换。
具体地说，信号控制部44包括：***控制器60，下达指令以控制各部分的动作，同时管理流式细胞仪10的整个动作；放大器64，将从信号处理部42生成的Re成分和Im成分放大；A/D转换器，将被放大的Re成分和Im成分抽样。放大器64和A/D转换器66可以在后述的分析装置80内运行。
分析装置80从在信号控制部44通过A/D转换得到的Re成分和Im成分计算出相对于激光的荧光的相位偏差角度，进一步，从该相位偏差角度计算出荧光弛豫时间常数（荧光弛豫时间）。另外，分析装置80从Re成分和Im成分计算出荧光强度。图6为表示分析装置80的概略构成的图。
分析装置80由包括CPU82和存储器84的计算机构成。分析装置80还包括相位偏差计算部86、相位偏差校正部88、荧光弛豫时间计算部90、荧光强度计算部92、输出电平调节部94。这些部分是计算机上通过启动软件而使其发挥功能的软件模块。当然，这些部分可以由专用电路构成。
相位偏差计算部86针对荧光蛋白X1发出的荧光的荧光数据，将Re成分作为实数部、Im作为虚数部的复数的辐角（tan-1（荧光数据的Im成分/荧光数据的Re成分））作为相位偏差角θmeas计算出。相位偏差计算部86将相位偏差角θmeas提供给相位偏差校正部88。
相位偏差校正部88对相位偏差计算部86中计算出的相位偏差角θmeas进行与施加于光电倍增管27的正极27d1～d11的控制电压（调节参数值）相应的校正，即，进行与通过电压调节部26d的荧光信号的输出电平的调节条件相应的校正，由此计算出源自荧光蛋白X1发出的荧光的相位偏差角θτ。
该校正是为了防止因光电倍增管27的光电子和二次电子的移动速度发生变化而产生的相位偏差角θ的变化以及计算出正确的荧光弛豫时间而进行。在光电倍增管27中，根据控制电压，光电子和二次电子的移动速度不同。因此，对于相位偏差角θ进行与设定的控制电压相应的校正。
光电倍增管27中利用二次电子所生成的电子倍增器电极和二次电子被引诱的正极之间的距离l，光电子和二次电子移动的时间t由下述式（1）表示。
t＝(2ml2／V／q)(1/2) （1）
m为电子质量，q为电子的电荷量，V为控制电压。
另一方面，相位偏差角θ与时间t成正比。因此，通过电子在光电倍增管27内移动的时间产生的相位偏差角（源自光电倍增管27的相位偏差角）θpmt，附加常数B而由公式θpmt＝Ａ·Ｖ(-1/2)＋Ｂ表示。另外，A、B是常数。
另一方面，相位偏差计算部86上计算出的相位偏差角θmeas可以由下述式（2）表示。
θmeas＝θ0－（θpmt＋θd＋θτ） （2）
在上述式（2）中，θ0为作为基准的相位偏差角（常数），θpmt为源自光电倍增管27的相位偏差角，θd为流式细胞仪10中源自激光和荧光的路径长度以及荧光信号的电路长度的相位偏差角，θτ为源自荧光蛋白X1发出的荧光的相位偏差角。
因此，源自荧光蛋白X1发出的荧光的相位偏差角θτ由下述式（3）表示。
θτ＝θ0-(θpmt+θd+θmeas) （3）
向上述式（3）代入θpmt＝Ａ·Ｖ(-1/2)＋Ｂ就可以得到下述式（4）。
θτ＝Ｘ－θmeas－Ａ·Ｖ(-1/2) （4）
但是，X由Ｘ＝θ0－Ｂ－θd表示，并且是并不依赖于控制电压的常数。
分析装置80的存储器84预先存储上述常数X和常数A的值。相位偏差校正部88从存储器84读取常数X和常数A的值，并代入至式（4）中而得到校正式。由此，相位偏差校正部88根据从相位偏差计算部86提供的相位偏差角θmeas和从电压调节部26d提供的控制电压V，利用已准备好的校正式计算出相位偏差角θτ。
相位偏差校正部88将计算出的相位偏差角θτ提供给荧光弛豫时间计算部90。
荧光弛豫时间计算部90是利用通过相位偏差校正部88计算出的相位偏差角θτ将荧光蛋白X1的荧光弛豫时间τ根据式τ＝1/(2πf)·tan(θτ)计算出。在此，f是用于对激光L进行强度调制的频率。能够通过式τ＝1/(2πf)·tan(θτ)计算出荧光弛豫时间τ是由于荧光现象表示根据一次弛豫过程的变化。
荧光强度计算部92针对从AD转换器66供给的荧光数据，通过求出Re成分作为实数部和Im成分作为虚数部的复数的绝对值，计算出荧光蛋白X1发出的荧光强度。
所计算出的荧光蛋白X1的荧光强度、相位偏差角θτ以及荧光弛豫时间τ是作为结果信息输出在未图示的打印机或显示器等的输出装置上。另外，该结果信息作为样品12通过管道30的测量点时获得的测量结果，作为统计处理对象。
输出电平调节部94生成用来规定施加于光电倍增管27的控制电压的控制信号。在从光电倍增管27输出的荧光信号的输出电平不饱和的范围自由地设定控制电压。输出电平调节部94至少获取正在施加于光电倍增管27的控制电压的信息。另外，输出电平调节部94进行后述的校准，以计算出常数X和常数A。
图7（a）为将从给出常数X和常数A的值而准备的校正式中求出的、荧光蛋白Qdot555的荧光的相位偏差角θmeas和利用流式细胞仪10分析装置80所计算出的实测的相位偏差角θmeas相比较的图表。图7（b）为将从给出常数X和常数A的值而准备的校正式中求出的、荧光蛋白PerCP的荧光的相位偏差角θmeas和利用流式细胞仪10分析装置80所计算出的实测的相位偏差角θmeas相比较的图表。在此，荧光蛋白Qdot555和PerCP的荧光弛豫时间τ已知，因此相位偏差角θτ使用由公式θτ＝tan-1（2πfτ）计算出的值。图7（a）、（b）中的曲线为通过校正式计算出的相位偏差角θmeas的计算结果，●为相位偏差角θmeas的实测结果。
从图7（a）、（b）可知，校正式与实测结果高度一致。由此，利用校正式进行校正，即，由式（4）计算出的相位偏差角θτ能够计算出高精度的荧光弛豫时间。
接着，关于在流式细胞仪10中进行的荧光检测方法进行说明。
首先，流式细胞仪10将用规定频率f进行强度调制的激光作为照射光从激光光源部22发射。
接着，受光部26接收荧光后输出荧光信号。
控制和处理部28通过将输出的荧光信号与对激光进行强度调制的调制信号混合，生成包括相对于调制信号的荧光信号的相位偏差角和强度振幅的荧光数据。
分析装置80的相位偏差计算部86从所生成的荧光数据计算出相位偏差角θmeas。相位偏差校正部88将所计算出的相位偏差角θmeas代入到作为给出常数X和常数A的值的校正式的式（4）而计算出相位偏差角θτ。进一步，荧光弛豫时间计算部90利用相位偏差角θτ根据公式τ＝tan（θτ）/（2πf）计算出荧光蛋白X1的荧光弛豫时间τ。另一方面，荧光强度计算部92求出所生成的荧光数据的绝对值，由此计算出荧光强度。
计算出的荧光弛豫时间、相位偏差角θτ以及荧光强度从未图示的输出装置输出。
图8为表示利用流式细胞仪10规定存储于存储器84的常数X、A的值的校准流程的例的图。规定常数X、A的值时，在流式细胞仪10中用于测量的荧光蛋白X1的荧光弛豫时间τ已知。
首先，分析装置80的输出电平调节部94使光电倍增管（以下，称之为PMT）27的控制电压V最大（步骤S 10）。使控制电压V最大的目的是，即使是微弱的荧光的情况下也能够高灵敏度地测出荧光。控制电压的调节是通过电压调节部26d进行。
接着，分析装置80的输出电平调节部94适当地调节ND滤波器26b（步骤S20）。通过ND滤波器进行减光是为了当使PMT27的控制电压最大而使PMT27处于最高灵敏度的状态时，使相对于光量的PMT27的荧光信号的输出电平不饱和。ND滤波器26b设定为例如最大减光和最小减光的中间。
接着，光源22a照射用频率f进行强度调制的激光L（步骤S30）。由此，PMT27接收样品12通过测量点时受激光L照射后发出的荧光。由此，PMT27以通过控制电压V来被调节的输出电平输出荧光信号（步骤S40）。荧光信号在信号处理部42和信号控制部44被处理后生成包括Re成分和Im成分的荧光数据（步骤S50）。接着，分析装置80的荧光强度计算部92从荧光数据计算出荧光强度（步骤S60）。荧光强度用荧光数据的绝对值表示。
接着，输出电平调节部94判断所设定的控制电压V是否为规定的电压以下（步骤S70）。
当判断结果为“否”时，输出电平调节部94通过电压调节部26d将控制电压V一定幅度降低（步骤S80）。如此，利用被降低的控制电压重复进行步骤S30~步骤S70。即，调节控制电压V，以使荧光信号的电平每次重复步骤S30~步骤S70减少。当在步骤S70的判断为“是”时，输出电平调节部94利用相对于控制电压V的荧光强度的变化进一步判断PMT27所输出的荧光信号是否饱和（步骤S90）。
关于PMT27输出的荧光信号的是否饱和的判断可以根据确认未图示的显示器上以图表形式显示的特性结果的操作员的输入来判断。或者是，分析装置80将未图示的显示器上以图表形式显示的特性结果自动进行分析后判断荧光信号是否饱和。例如，如图9所示，相对于控制电压V将荧光强度计算部92计算出的荧光强度的值作为特性结果以图表形式显示时，根据操作员目视的确认结果或分析装置80的分析结果来判断有没有相对于控制电压V的荧光强度的特性伴随控制电压的上升从直线弯曲并平稳地变化的区域，由此判断荧光信号的饱和的有无。
该判断结果为“是”时，返回到步骤S20，重复进行步骤S20~步骤S80。
步骤S90的判断结果为“否”时，即，PMT27处于不饱和状态时，输出电平调节部94将回归式近似化而提取常数X和常数A的值（步骤S100），并将所提取的常数X和常数A的值存储于存储器84（步骤S110）。回归式利用将上述式（4）进行变换而得到的下述式（5）。
θmeas＝Ｘ－θτ－Ａ·Ｖ(-1/2) （5）
但是，θτ＝tan-1（2πfτ）
在此，f为激光的强度调制的频率（已知），τ为用于测量的荧光蛋白X1的荧光弛豫时间（已知）。
输出电平调节部94按照利用上述式（5）预测的相位偏差角θmeas近似于实测的相位偏差角θmeas的方式利用上述式（5）等的回归式从实测的相位偏差角θmeas提取常数X和常数A的值。换言之，按照将实测的相位偏差角θmeas利用上述式（4）校正后得到的相位偏差角（式（4）的右边的值）近似于通过已知的荧光弛豫时间τ规定的相位偏差角θτ的方式，进一步换言之，按照从式（4）的右边所示的校正后的相位偏差角计算出的荧光弛豫时间近似于已知的荧光弛豫时间τ的方式，提取常数X和常数A的值。
图7（a）所示的例子中，作为常数X的值提取3.7584，作为常数A的值提取0.6360。常数X和常数A的值利用最小二乘近似法等公知方法提取。常数X和常数A的值与荧光蛋白X1无关的装置固有的值。即使变换荧光蛋白的种类也能够利用。
如图7（a）、（b）所示，分析装置80利用设定的回归式能够准确地预测相对于PMT27的控制电压的相位偏差角θmeas的变化。因此，分析装置80利用作为规定用于该回归式的常数X和常数A值的校正式的式（4），能够从实测的相位偏差角θmeas计算出源自荧光蛋白X1的相位偏差角θτ。即，能够校正相位偏差角θmeas。
因此，分析装置80能够准确地计算出荧光蛋白X1发出的荧光的荧光弛豫时间。
以上，针对本发明的荧光检测装置、荧光检测方法和对荧光信号进行信号处理的方法进行了详细说明，但本发明并不局限于上述实施方式，在不脱离本发明的主要内容的范围内，可以进行多种改进或变更。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
（根据PCT条约19条修改）
[2011年5月25日（25.05.2011）国际事务局受理]
1.一种荧光检测装置，对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行处理，其特征在于，包括：
光源部，以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射；
受光部，包括受光元件，接收测量对象物受所述激光照射后发出的荧光，并输出输出电平被调节的荧光信号，能够调节所述输出电平；
第一处理部，通过将所述荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据；
第二处理部，利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间。
2.根据权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部包括通过施加给所述受光元件的调节参数来调节所述输出电平的调节部。
3.根据权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，当进行所述校正时，所述第二处理部利用根据所述调节参数值规定的校正式。
4.根据权利要求3所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二处理部预先存储用于所述校正式的常数值，在进行所述校正时，读取所述常数值而利用。
5.根据权利要求3或4所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二处理部包括输出电平调节部，通过将施加给所述受光元件的调节参数值预先进行变更，求出所述调节参数值和所述输出电平的关系，当所述关系表示所述受光元件的输出电平不饱和时，提取用于所述校正式的所述常数值。
6.根据权利要求5所述的荧光检测装置，其特征在于，所述输出电平调节部按照下述方式提取所述常数：作为测量对象物利用荧光弛豫时间已知的基准对象物而从所述第二相位偏差计算出的荧光弛豫时间通过所述校正后使其近似于所述基准对象物的已知的荧光弛豫时间。
7.根据权利要求2至6任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光元件为光电倍增管，所述调节参数值为施加于所述光电倍增管的电极的电压。
8.根据权利要求7所述的荧光检测装置，其特征在于，施加于所述电极的电压为V、所述第一相位偏差为θmeas、所述第二相位偏差为θτ时，所述校正式由下述式表示，
θτ＝Ｘ－θmeas－Ａ·Ｖ(-1/2)
其中，X和A为常数。
9.根据权利要求1至8任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，在所述受光元件的受光面前面设置有能够进行调节的减光滤波器。
10.一种荧光检测方法，其中，荧光检测装置对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括如下步骤：
以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射的步骤；
用受光元件接收测量对象物受所述激光后发出的荧光，由此输出输出电平被调节的荧光信号的步骤；
通过将所述荧光信号与所述规定频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据的步骤；
利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间的步骤。
11.根据权利要求10所述的荧光检测方法，其特征在于，
所述荧光信号的输出为通过施加给所述受光元件的调节参数值而输出电平被调节的荧光信号的输出，
在计算所述第二相位偏差时，利用与所述调节参数值相应而规定且被施加预先存储的常数值的校正式，进行与所述输出电平调节条件相应的校正，
施加给所述校正式的所述常数值为按照下述方式提取的值：作为测量对象物利用荧光弛豫时间已知的基准对象物而从所述第二相位偏差计算出的荧光弛豫时间通过所述校正使其近似于所述基准对象物的已知的荧光弛豫时间，
所述常数值的提取在通过预先变更施加给所述受光元件的调节参数值来求出的所述调节参数值和所述输出电平的关系表示所述受光元件的输出电平不饱和时进行。
12.根据权利要求10或11所述的荧光检测方法，其特征在于，在所述受光元件的受光面前面设置有能够进行调节的减光滤波器，所述减光滤波器按照所述受光元件的输出电平不饱和的方式被调节。
Claims (13)
1.一种荧光检测装置，对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行处理，其特征在于，包括：
光源部，以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射；
受光部，包括受光元件，接收测量对象物受所述激光照射后发出的荧光，并输出输出电平被调节的荧光信号，能够调节所述输出电平；
第一处理部，通过将所述荧光信号与所述频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据；
第二处理部，利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间。
2.根据权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光部包括通过施加给所述受光元件的调节参数值调节所述输出电平的调节部。
3.根据权利要求2所述的荧光检测装置，其特征在于，当进行所述校正时，所述第二处理部利用根据所述调节参数值规定的校正式。
4.根据权利要求3所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二处理部预先存储用于所述校正式的常数值，在进行所述校正时，读取所述常数值而利用。
5.根据权利要求3或4所述的荧光检测装置，其特征在于，所述第二处理部包括输出电平调节部，通过将施加给所述受光元件的调节参数值预先进行变更，求出所述调节参数值和所述输出电平的关系，当所述关系表示所述受光元件的输出电平不饱和时，提取用于所述校正式的所述常数值。
6.根据权利要求5所述的荧光检测装置，其特征在于，所述输出电平调节部按照下述方式提取所述常数：作为测量对象物利用荧光弛豫时间已知的基准对象物而从所述第二相位偏差计算出的荧光弛豫时间通过所述校正后使其近似于所述基准对象物的已知的荧光弛豫时间。
7.根据权利要求2至6任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，所述受光元件为光电倍增管，所述调节参数值为施加于所述光电倍增管的电极的电压。
8.根据权利要求7所述的荧光检测装置，其特征在于，施加于所述电极的电压为V、所述第一相位偏差为θmeas、所述第二相位偏差为θτ时，所述校正式由下述式表示，
θτ＝Ｘ－θmeas－Ａ·Ｖ(-1/2)
其中，X和A为常数。
9.根据权利要求1至8任一项所述的荧光检测装置，其特征在于，在所述受光元件的受光面前面设置有能够进行调节的减光滤波器。
10.一种荧光检测方法，其中，荧光检测装置对测量对象物受激光照射后发出的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括如下步骤：
以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射的步骤；
用受光元件接收测量对象物受所述激光后发出的荧光，由此输出输出电平被调节的荧光信号的步骤；
通过将所述荧光信号与所述规定频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据的步骤；
利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，对于所计算出的所述第一相位偏差，进行与所述输出电平的调节条件相应的校正，以计算出第二相位偏差，利用所计算出的所述第二相位偏差计算出所述荧光的荧光弛豫时间的步骤。
11.一种荧光信号的处理方法，其中，荧光检测装置对通过受激光照射而荧光弛豫时间已知的基准测量对象物所发出的荧光的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括如下步骤：
第一步骤，以规定频率的调制信号对激光进行强度调制后发射；
第二步骤，用受光元件接收基准对象物受所述激光照射后发出的荧光，由此输出输出电平被调节的荧光信号；
第三步骤，通过将所述荧光信号与所述规定频率的调制信号混合，生成包括相位和强度信息的荧光数据；；
第四步骤，利用所述荧光数据计算出所述荧光的、相对于所述调制信号的第一相位偏差，并将所计算出的所述第一相位偏差和为了调节所述输出电平而施加给所述受光元件的调节参数值作为组来存储；
第五步骤，变更所述调节参数值，并重复所述第一步骤~所述第四步骤，由此存储多个由所述第一相位偏差和所述调节参数值组成的组；
第六步骤，读取所存储的所述多个组，使规定所述调节参数值和所述第一相位偏差的关系的回归式近似于所读取的所述多个组的关系，由此提取包括在所述回归式的未知的常数值；
第七步骤，存储所提取的所述常数值。
12.根据权利要求11所述的荧光信号的处理方法，其特征在于，按照每重复所述第一步骤~所述第四步骤时所述输出电平减少的方式变更所述调节参数值。
13.根据权利要求11或12所述的荧光信号的处理方法，其特征在于，所述受光元件所接收的所述荧光按照所述受光元件输出的所述荧光信号的输出电平不饱和的方式在被所述受光元件受光之前通过减光滤波器被减光。
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121003 |