CN113811756A - 射频复用信号的相位校正 - Google Patents

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Abstract

本公开的各方面包括用于表征流动流中的样品颗粒的方法。根据某些实施例的方法包括根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据；以及通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在某些实施例中，方法包括基于相位校正的空间数据生成流动流中的颗粒的图像。还描述了具有处理器的***，该处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，该存储器具有存储在其上的指令，该指令在由该处理器执行时使处理器根据流动流的颗粒的频率编码的荧光数据来计算相位校正的空间数据。还提供了具有编程用于实践主题方法的集成电路设备(例如现场可编程门阵列)。

Description

射频复用信号的相位校正
相关申请的交叉引用
本申请涉及2019年5月30日提交的美国临时专利申请序列号No.62/854,875；其公开内容通过引用并入本文。
引言
生物流体中分析物的表征已成为医学诊断和对患者整体健康状况进行评估的组成部分。检测生物流体(例如人类血液或血液衍生产品)中的分析物能够提供可以在确定患有多种疾病的患者的治疗方案中发挥作用的结果。
流式细胞术是一种用来表征生物材料并经常用来对生物材料进行分选的技术，例如，血液样品的细胞或另一种类型的生物或化学样品中的感兴趣的颗粒。流式细胞仪通常包括用于接收诸如血液样品之类的流体样品的样品储存器和包含鞘液的鞘储存器。流式细胞仪将流体样品中的颗粒(包括细胞)作为细胞流运输到流动池，同时还将鞘液引导到流动池。为了表征这种流动流的组成，用光照射流动流。流动流中材料的变化(例如形态或存在荧光标记)可以导致观察到的光的变化，并且这些变化能够进行表征和分离。
为了表征流动流中的组成，光必须投射在流动流上并进行收集。流式细胞仪中的光源可以在广谱灯、发光二极管以及单波长激光器之间变化。光源与流动流对准，并将来自照射的颗粒的光学响应收集和量化。
发明内容
本公开的各方面包括用于表征流动流中的样品颗粒的方法。根据某些实施例的方法包括根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据，以及通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在某些实施例中，方法包括基于相位校正的空间数据生成流动流中的颗粒的图像。还描述了一种***，该***具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到该处理器的存储器，该存储器具有存储在其上的指令，该指令在由该处理器执行时使处理器根据流动流的颗粒的频率编码的荧光数据来计算相位校正的空间数据。还提供了具有编程用于实践主题方法的集成电路设备(例如现场可编程门阵列)。
在实施例中，根据在流动流的询问区域中检测到的光产生来自样品中的颗粒的频率编码的荧光数据。在一些实施例中，颗粒是细胞。在实施例中，方法包括检测来自流动流中的样品的光发射(例如荧光)，以根据颗粒生成频率编码的荧光数据。在一些实施例中，方法还包括检测光吸收、光散射或它们的组合。在一些实施例中，利用来自光束发生器的多个频移光束照射具有一个或更多个荧光团的颗粒以生成频率编码的荧光。在一个示例中，在(水平轴线的)流动流上的多个位置由激光束照射，该激光束包括本振光束和多个射频移位的激光束，使得在流动流上的不同位置由本振光束和射频移位的光束之一进行照射。在一些实例中，本地振荡器是来自激光器的频移光束。在该示例中，在流动流中的颗粒上的每个空间位置由不同的拍频进行表征，该拍频对应于本振光束的频率与该位置处的射频移位的光束的频率之间的差。在一些实施例中，来自颗粒的频率编码的数据包括在流动流中颗粒的水平轴线上的空间编码的拍频。
在实施本主题方法时，在询问区域中检测来自流动流中的样品的光并且生成来自样品中的颗粒的频率编码的数据。在一些实施例中，在询问区域中检测到的颗粒包括细胞。在一些实施例中，方法包括检测来自流动流中的样品的光吸收、光散射、光发射(例如荧光)中的一种或更多种。在一些实例中，根据检测到的光吸收(例如明场图像数据)生成样品中一个或更多个颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，根据检测到的光散射(例如前向散射图像数据、侧向散射图像数据)生成样品中一个或更多个颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，根据检测到的荧光(例如荧光标记的图像数据)生成样品中一个或更多个颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的荧光中的两种或更多种的组合生成样品中一个或更多个颗粒的相位校正的空间数据。
在实施例中，利用相位校正分量对来自流动流中的颗粒的频率编码的荧光数据进行变换以给出颗粒的空间数据。在实施例中，空间数据可以包括颗粒的水平尺寸维度、颗粒的垂直尺寸维度、沿两个不同维度的颗粒尺寸比率、颗粒组成的尺寸比率(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比率)。在一些实施例中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换来对频率编码的荧光数据进行变换。在一些实例中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换(DFT)来对频率编码的荧光数据进行变换。在其他实例中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)来计算相位校正的空间数据。在其他实例中，利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
在一些实施例中，方法包括确定用来将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据的相位校正分量。在一些实例中，相位校正分量包括修正变换系数。在某些实施例中，相位校正分量包括第一相位调整和第二相位调整。在一些实例中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，第一相位调整可以包括来自明场光电检测器的输出信号。
在一些实施例中，通过以下方式计算第一相位调整：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以产生相位调整值；并计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点(bins)的总和。在某些实施例中，第一相位调整是干涉相位调整。在这些实施例中，相位调整包括由用来照射流动流中的样品的光源引起的相移。例如，光源可以是配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束的光束发生器部件。根据一些实例的光束发生器包括激光器(例如连续波激光器)和声光偏转器(例如耦接到直接数字合成器RF梳状发生器上的)。在一些实施例中，干涉相位调整包括由光束发生器的部件之间的振动引起的相移。在一些实施例中，第二相位调整基于样品中荧光团的荧光寿命。在这些实施例中，可以通过如下方式来计算第二相位调整：获取来自所有荧光检测器的信号以确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。
根据某些实施例的方法还包括分选样品中的一种或更多种颗粒。在一些实施例中，颗粒被识别成单个细胞并且被分选到第一样品组成收集位置。在其他实施例中，颗粒被识别成细胞聚集体并且被分选到第二样品组成收集位置。在一些实例中，第一样品组成收集位置包括样品收集容器，第二样品组成收集位置包括废物收集容器。
本公开的各方面包括用于表征流动流中的样品颗粒(例如生物样品中的细胞)的***。根据某些实施例的***包括配置为对流动流中具有颗粒的样品进行照射的光源、具有光电检测器和处理器的光检测***，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时，使处理器执行以下操作：根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；以及通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
在实施例中，***配置为根据利用光源照射的样品中的颗粒生成频率编码的荧光数据。在一些实施例中，光源包括配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束的光束发生器部件。根据某些实例的光束发生器包括激光器(例如连续波激光器)和声光偏转器(例如耦接到直接数字合成器RF梳状发生器的)。主题***包括光检测***，该光检测***配置为检测来自流动流中的样品的光吸收、光散射、光发射(例如荧光)中的一个或更多个。在一些实例中，光检测***包括用于检测光吸收的光电检测器(例如明场光电检测器)。在其他实例中，光检测***包括用于检测光散射的光电检测器(例如，前向散射检测器、侧向散射检测器)。在其他实例中，光检测***包括用于检测荧光的光电检测器。在其他实例中，光检测***包括以下两个或更多个的组合：光吸收检测器、光散射检测器和发射(例如荧光)的光检测器。
在实施例中，主题***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在实施例中，空间数据可以包括颗粒的水平尺寸维度、颗粒的垂直尺寸维度、沿两个不同维度的颗粒尺寸比率、颗粒组成的尺寸比率(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比率)。在一些实施例中，为了计算相位校正的空间数据，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换(DFT)以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)。在其他实施例中，***配置为利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
在一些实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器确定用来将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据的相位校正分量。在一些实例中，相位校正分量包括修正变换系数。在一些实施例中，***配置为通过计算第一相位调整和第二相位调整来确定相位校正分量。在某些情况下，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，第一相位调整可以包括来自明场光电检测器的输出信号。
在一些实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过以下方式计算第一相位调整：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以产生相位调整值；并计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。在某些实施例中，第一相位调整是干涉相位调整。在其他实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器基于样品中荧光团的荧光寿命来计算第二相位调整。在这些实施例中，可以由主题***通过如下方式来计算第二相位调整：获取来自所有荧光检测器的信号以确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整来计算第二相位调整。
在某些实例中，感兴趣的***被配置用于分选流动流中的样品(例如生物样品)的颗粒。在一些实施例中，***还包括颗粒分选部件，该颗粒分选部件具有样品流体输送子***和鞘液输送子***，该鞘液输送子***与颗粒分选部件的入口和用于接收来自流动流的经分选的颗粒的一个或更多个样品收集容器流体连通。
本公开的各方面还包括集成电路设备，该集成电路设备编程以执行以下操作：根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施例中，集成电路设备被编程以分选颗粒，例如分选到样品收集容器或废物收集容器。在某些实例中，感兴趣的集成电路设备可以包括现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
根据某些实施例的集成电路设备编程为根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据。在一些实施例中，集成电路设备编程为根据来自光吸收检测器的数据信号(例如明场图像数据)生成频率编码的荧光数据。在其他实施例中，集成电路设备编程为根据来自光散射检测器的数据信号(例如前向散射图像数据、侧向散射图像数据)生成频率编码的荧光数据。在其他实施例中，集成电路设备编程为根据来自光发射检测器的数据信号(例如荧光标记图像数据)生成频率编码的荧光数据。在其他实例中，集成电路设备编程为根据检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的荧光中的两个或更多个的组合生成频率编码的荧光数据。
在实施例中，主题集成电路设备编程为通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实例中，集成电路设备被编程为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换来生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，集成电路设备被编程为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换来生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，集成电路设备被编程为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换来生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实例中，集成电路设备被编程为利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
在一些实施例中，集成电路设备被编程为确定用来将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据的相位校正分量。在一些实例中，相位校正分量包括修正变换系数。在一些实施例中，集成电路设备被编程为通过计算第一相位调整和第二相位调整来确定相位校正分量。在某些实例中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，第一相位调整可以包括来自明场光电检测器的输出信号。
在一些实施例中，集成电路设备编程为通过以下方式计算第一相位调整：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘，以产生相位调整值；并计算相位调整值的反正切以产生第一相位调整值。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。在某些实施例中，第一相位调整是干涉相位调整。在其他实施例中，集成电路设备被编程为基于样品中荧光团的荧光寿命来计算第二相位调整。在这些实施例中，第二相位调整可以由主题集成电路通过以下方式来计算：获取来自所有荧光检测器的信号以确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。
附图说明
在结合附图阅读时，可以从以下详细描述中最好地理解本发明。附图中包括以下图：
图1描绘了根据某些实施例的用于生成频率编码的荧光数据并根据频率编码的荧光数据计算相位校正的空间数据的流程图。
图2描绘了根据实施例的使用相位校正的空间数据生成颗粒的图像与空间数据未进行相位校正的图像的比较。
具体实施方式
本公开的一些方面包括用于表征流动流中的样品颗粒的方法。根据某些实施例的方法包括根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据；并且通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在某些实施例中，方法包括基于相位校正的空间数据生成流动流中的颗粒的图像。还描述了具有处理器的***，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，该存储器具有存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器根据流动流的颗粒的频率编码的荧光数据计算相位校正的空间数据。还提供了具有编程以用于实践主题方法的集成电路设备(例如现场可编程门阵列)。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所述的特定实施例，因此当然可以进行变化。还应当理解的是，在本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。
在提供数值范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每个中间值到该下限单位的十分之一，以及该规定范围中的任何其他规定值或中间值，除非上下文另有明确规定，否则都包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内并且也包括在本发明内，受该规定范围中的任何具体排除的限制。在规定范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些包括的限值之一或两者的范围也包括在本发明中。
在本文中，某些范围以数值前面带有术语“约”来呈现。在本文中，术语“约”用来为其后面的确切数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于具体列举的数字时，接近的或近似的未列举数字可以是在其呈现的上下文中提供具体列举的数字的实质等价物的数字。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的的任何方法和材料也能够用于本发明的实践或测试，但现在对代表性的说明性方法和材料进行描述。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，就好像每个单独的出版物或专利都具体地和单独地指示为通过引用并入，并通过引用并入本文以公开和描述与引用出版物有关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是为了在申请日之前将其公开，并且不应解释为承认本发明因在先发明而无权早于此类出版物。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，实际出版日期可能需要独立确认。
应当注意的是，除非上下文另有明确说明，否则在本文和所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一个”、“该”等包括复数指代物。还应当注意，可以起草权利要求书以排除任何可选元素。因此，本声明旨在作为与权利要求要素的叙述相关联的诸如“唯一”、“仅”等排他性术语的使用或“否定”限制的使用的先行基础。
本领域技术人员在阅读本公开内容后将显而易见，在本文描述和说明的每个单独的实施例都具有分立的部件和特征，这些部件和特征可以在不脱离本发明的范围或精神的情况下容易地与其他几个实施例中的任何一个的特征分开或组合。任何叙述的方法都能够按照所叙述的事件的顺序或按照逻辑上可能的任何其他顺序进行。
虽然为了语法上的流畅性，利用功能说明描述了设备和方法或将要对其进行描述，但应当明确理解的是，除非根据35 U.S.C.§112明确制定的权利要求书，否者该权利要求书不应解释为必须以任何方式受到“手段”或“步骤”限制的构造的限制，而是根据等效原则赋予权利要求书所提供的定义的全部含义和等价物的范围，并且在权利要求书是根据35U.S.C.§112明确制定的情况下根据35 U.S.C.§112赋予完全法定等同物。
如上所述，本公开提供了用于表征(例如成像)流动流中的样品颗粒的***和方法。在进一步描述的本公开的实施例中，首先较详细地描述了用于根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据并计算颗粒的相位校正的空间数据的方法。接下来，描述了用于实时表征流动流中的颗粒并实时分离样品中的颗粒的***。还提供了集成电路设备(例如现场可编程门阵列)，其具有用于根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据并计算颗粒的相位校正的空间数据的编制程序。
用于表征样品中的颗粒的方法
本公开的各个方面包括用于表征样品颗粒(例如生物样品中的细胞)的方法。在实践根据某些实施方案的方法中，利用光源照射流动流中具有细胞的样品，并检测来自样品的光以根据颗粒生成频率编码的荧光数据并通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施例中，样品是生物样品。术语“生物样品”在其常规意义上用来指整个生物、植物、真菌或动物组织、细胞或组成部分的子集，在某些情况下，它们可以在血液、粘液、淋巴液、滑液、脑脊液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水、羊膜脐血、尿液、***液和***中发现。因此，“生物样品”是指天然生物体或其组织的子集以及从生物或其组织的子集制备的匀浆、裂解物或提取物，包括但不限于，例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤切片、呼吸道、胃肠道、心血管、泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳汁、血细胞、肿瘤、器官。生物样品可以是任何类型的器官组织，该生物组织包括健康组织和患病组织(例如癌性的组织、恶性的组织、坏死的组织等)。在某些实施例中，生物样品是液体样品，例如血液或其衍生物，例如血浆、眼泪、尿液、***等，其中在一些实例中，样品是包括全血的血液样品，例如从静脉穿刺或指尖采血(其中血液可能会或可能不会在化验前与任何试剂(如防腐剂、抗凝剂等)混合)获得的血液。
在某些实施例中，样品来源是“哺乳动物”或“哺乳类动物”，其中这些术语被广泛用于描述哺乳动物纲的生物，该生物包括食肉目(例如狗和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长目(例如人类、黑猩猩和猴子)。在一些实例中，受试者是人类。方法可以应用于从两性和处于任何发育阶段(即，新生儿、婴儿、少年、青少年、成人)的人类受试者获得的样品，其中，在某些实施例中，人类受试者是少年、青少年或成人。虽然本发明可以应用于来自人类受试者的样品，但是应当理解，方法也可以在来自其他动物受试者(即，“非人类受试者”，例如但不限于鸟类、小鼠、大鼠、狗、猫、牲畜和马)的样品上进行。
在实践主题方法时，利用来自光源的光照射具有颗粒的样品(例如流式细胞仪的流动流中的细胞)。在一些实施例中，光源是宽带光源，其发射具有例如跨度50nm或更大、例如100nm或更大、例如150nm或更大、例如200nm或更大、例如250nm或更大、例如300nm或更大、例如350nm或更大、例如400nm或更大以及包括跨度500nm或更大的宽波长范围的光。例如，一个合适的宽带光源发射波长为200nm到1500nm的光。合适的宽带光源的另一个示例包括发射波长为400nm到1000nm的光的光源。在方法包括利用宽带光源照射的情况下，感兴趣的宽带光源协议可以包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定光纤耦合宽带光源、具有连续光谱的宽带LED、超亮发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光源、多LED集成白光源以及其他宽带光源或它们的任何组合。
在其他实施例中，方法包括利用发射特定波长或窄波长范围的窄带光源照射，例如利用发射窄波长范围的光的光源，该窄波长范围例如为50nm或更小、例如40nm或更小、例如30nm或更小、例如25nm或更小、例如20nm或更小、例如15nm或更小、例如10nm或更小、例如5nm或更小、例如2nm或更小以及包括发射特定波长的光(即单色光)的光源。在方法包括利用窄带光源照射的情况下，感兴趣的窄带光源协议可以包括但不限于耦接到一个或更多个光学带通滤波器、衍射光栅、单色器或它们的任何组合上的窄波长LED、激光二极管或宽带光源。
在某些实施例中，方法包括利用一个或更多个激光器照射流动流。激光器的类型和数量将根据样品以及所收集的期望的光而变化，并且可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器(例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)准分子激光器、氪-氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或它们的组合)、染料激光器(例如芪、香豆素或罗丹明激光器)、金属蒸气激光器(例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合)、固态激光器(例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器，钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb2O3激光器或掺铈激光器及它们的组合)、半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)或将上述任何激光器实施为倍频或三倍频。
可以利用上述光源中的一个或更多个(例如2个或更多个光源、例如3个或更多个光源、例如4个或更多个光源、例如5个或更多光源以及包括10个或更多个光源)照射流动流中的样品。光源可以包括任何类型光源的组合。例如，在一些实施例中，方法包括利用激光器阵列(例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列)照射流动流中的样品。
可以利用200nm到1500nm(例如250nm到1250nm、例如300nm到1000nm、例如350nm到900nm以及包括400nm到800nm)的波长照射样品。例如，在光源是宽带光源的情况下，可以利用200nm到900nm的波长照射样品。在其他实例中，在光源包括多个窄带光源的情况下，可以利用200nm到900nm的特定波长照射样品。例如，光源可以是多个窄带LED(1nm-25nm)，每个LED独立地发射200nm到900nm波长范围的光。在其他实施例中，窄带光源包括一个或更多个激光器(例如激光器阵列)并且利用200nm到700nm的特定波长照射，例如利用如上所述的具有气体激光器、准分子激光器、染料激光器、金属蒸汽激光器和固态激光器的激光器阵列照射。
在采用多于一个光源的情况下，可以利用光源同时地或顺序地或其组合方式照射样品。例如，可以利用每个光源同时照射样品。在其他实施例中，利用每个光源顺序地照射流动流。在采用多于一个光源来顺序地照射样品的情况下，每个光源照射样品的时间可以独立地为0.001微秒或更长，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，方法可以包括利用光源(例如激光)照射样品，持续时间为0.001微秒到100微秒，例如0.01微秒到75微秒、例如0.1微秒到50微秒、例如1微秒到25微秒以及包括5微秒到10微秒。在利用两个或更多个光源顺序地照射样品的实施例中，每个光源照射样品的持续时间可以相同或不同。
通过每个光源所进行的照射之间的时间段也可以根据需要而变化，该时间段独立地间隔开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如15微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，通过每个光源所进行的照射之间的时间段可以为0.001微秒到60微秒，例如0.01微秒到50微秒、例如0.1微秒到35微秒、例如1微秒到25微秒以及包括5微秒到10微秒。在某些实施例中，通过每个光源所进行的照射之间的时间段是10微秒。在由多于两个(即，3个或更多个)光源顺序地照射样品的实施例中，通过每个光源所进行的照射之间的延迟可以相同或不同。
可以连续地或以离散的间隔照射样品。在一些实例中，方法包括利用光源连续地照射样品中的样品。在其他实例中，利用光源以离散的间隔照射样品，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或一些其他间隔照射该样品。
取决于光源，可以从一定距离处照射样品，该距离是变化的，例如0.01mm或更大、例如0.05mm或更大、例如0.1mm或更大、例如0.5mm或更大、例如1mm或更大、例如2.5mm或更大、例如5mm或更大、例如10mm或更大、例如15mm或更大、例如25mm或更大以及包括50mm或更大。而且，照射角度也可以变化，该照射角度为10°到90°，例如15°到85°、例如20°到80°、例如25°到75°以及包括30°到60°，例如以90°角进行照射。
在实践主题方法时，例如通过收集一定波长范围(例如200nm-1000nm)内的来自样品光来测量来自被照射样品的光。在实施例中，方法可以包括测量样品的光吸收(例如明场光数据)、测量光散射(例如前向或侧向散射光数据)和测量样品的光发射(例如荧光光数据)中的一种或更多种。
可以在一个或更多个波长处测量来自样品的光，例如在5个或更多个不同波长处、例如在10个或更多个不同波长处、例如在25个或更多个不同波长处、例如在50个或更多个不同波长处、例如在100个或更多个不同波长处、例如在200个或更多个不同波长处、例如在300个或更多个不同波长处的来自样品的光，以及包括测量在400个或更多个不同波长处收集的光。
可以收集一个或更多个200nm-1200nm波长范围内的光。在一些实例中，方法包括测量一定波长范围内的来自样品的光，该波长范围例如为200nm到1200nm、例如300nm到1100nm、例如400nm到1000nm、例如500nm到900nm以及包括600nm到800nm。在其他实例中，方法包括测量在一个或更多个特定波长处收集的光。例如，可以测量在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及它们的任何组合中一个或更多个处收集的光。在某些实施例中，方法包括测量对应于某些荧光团的荧光峰值波长的光的波长。
可以连续地或以离散的间隔测量收集的光。在一些实例中，方法包括连续地对光进行测量。在其他实例中，以离散的间隔对光进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或一些其他间隔测量光。
在实施主题方法期间，可以对所收集的光进行一次或更多次测量，例如2次或更多次，例如3次或更多次，例如5次或更多次以及包括10次或更多次。在某些实施例中，测量2次或更多次来自样品的光，在某些实例中对数据取平均值。
在一些实施例中，方法包括在检测光之前进一步调节来自样品的光。例如，来自样品源的光可以穿过一个或更多个透镜、反光镜、针孔、狭缝、光栅、光折射器及它们的任何组合。在一些实例中，所收集的光穿过一个或更多个聚焦透镜例如以减小光的分布。在其他实例中，来自样品的发射的光穿过一个或更多个准直器以减少光束发散。
在某些实施例中，方法包括利用两束或更多束频移光照射样品。如上所述，可以采用具有激光器和声光设备的光束发生器部件，用于对激光进行频移。在这些实施例中，方法包括利用激光器照射声光设备。取决于在输出激光束中产生的光的期望的波长(例如用于照射流动流中的样品)，激光器可以具有从200nm到1500nm变化的特定波长，例如从250nm到1250nm、例如从300nm到1000nm、例如从350nm到900nm以及包括从400nm到800nm。可以利用一个或更多个激光器(例如2个或更多个激光器、例如3个或更多个激光器、例如4个或更多个激光器、例如5个或更多个激光器以及包括10个或更多个激光器)照射声光设备。激光器可以包括任何类型的激光器的组合。例如，在一些实施例中，方法包括利用激光器阵列照射声光设备，例如具有一个或更多个气体激光器、一个或更多个染料激光器和一个或更多个固态激光器的阵列。
在采用多于一个激光器的情况下，可以利用激光同时地或顺序地或其组合方式来照射声光设备。例如，可以利用每个激光器同时照射声光设备。在其他实施例中，利用每个激光器顺序地照射声光设备。在采用多于一个激光器来顺序地照射声光设备的情况下，每个激光器照射声光设备的时间可以独立地为0.001微秒或更长，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，方法可以包括利用激光器照射声学设备，持续时间为0.001微秒到100微秒，例如0.01微秒到75微秒、例如0.1微秒到50微秒、例如1微秒到25微秒以及包括5微秒到10微秒。在利用两个或更多个激光器顺序地照射声光设备的实施例中，每个激光器照射声光设备的持续时间可以相同或不同。
通过每个激光器所进行的照射之间的时间段也可以根据需要而变化，该时间段独立地间隔开0.001微秒或更长的延迟，例如0.01微秒或更长、例如0.1微秒或更长、例如1微秒或更长、例如为5微秒或更长、例如10微秒或更长、例如15微秒或更长、例如30微秒或更长以及包括60微秒或更长。例如，通过每个光源所进行的照射之间的时间段的范围可以为0.001微秒到60微秒，例如0.01微秒到50微秒、例如0.1微秒到35微秒、例如1微秒到25微秒以及包括5微秒到10微秒。在某些实施例中，通过每个激光器所进行的照射之间的时间段是10微秒。在通过多于两个(即，3个或更多个)激光器顺序地照射声光设备的实施例中，通过每个激光器所进行的照射之间的延迟可以相同或不同。
可以连续地或以离散的间隔照射声光设备。在一些实例中，方法包括利用激光器连续地照射声光设备。在其他实例中，利用激光器以离散的间隔照射声光设备，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或一些其他间隔照射该声光设备。
取决于激光器，可以从一定距离处照射声光设备，该距离是变化的，例如0.01mm或更大、例如0.05mm或更大、例如0.1mm或更大、例如0.5mm或更大、例如1mm或更大、例如2.5mm或更大、例如5mm或更大、例如10mm或更大、例如15mm或更大、例如25mm或更多大以及包括50mm或更大。而且，照射角度也可以从10°到90°变化，例如15°到85°、例如20°到80°、例如25°到75°以及包括30°到60°，例如以90°角进行照射。
在实施例中，方法包括向声光设备施加射频驱动信号以生成角度偏转的激光束。可以向声光设备施加两个或更多个射频驱动信号以生成具有期望数量的角度偏转的激光束的输出激光束，所述两个或更多个射频驱动信号例如是3个或更多个射频驱动信号、例如4个或更多个射频驱动信号、例如5个或更多个射频驱动信号、例如6个或更多个射频驱动信号、例如7个或更多个射频驱动信号、例如8个或更多个射频驱动信号、例如9个或更多个射频驱动信号、例如10个或更多个射频驱动信号驱动信号、例如15个或更多个射频驱动信号、例如25个或更多个射频驱动信号、例如50个或更多个射频驱动信号以及包括100个或更多个射频驱动信号。
由射频驱动信号产生的角度偏转的激光束各自具有基于施加的射频驱动信号的幅度的强度。在一些实施例中，方法包括施加具有足以产生期望强度的角度偏转的激光束的幅度的射频驱动信号。在一些实例中，每个施加的射频驱动信号独立地具有约0.001V到约500V的幅度，例如约0.005V到约400V、例如约0.01V到约300V、例如约0.05V到约200V、例如约0.1V到约100V、例如约0.5V到约75V、例如约1V到50V、例如约2V到40V、例如3V到约30V以及包括约5V到约25V。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号具有约0.001MHz到约500MHz的频率，例如约0.005MHz到约400MHz、例如约0.01MHz到约300MHz、例如约0.05MHz到约200MHz、例如约0.1MHz到约100MHz、例如约0.5MHz到约90MHz、例如约1MHz到约75MHz、例如约2MHz到约70MHz、例如约3MHz到约65MHz、例如约4MHz到约60MHz以及包括约5MHz到约50MHz。
在一些实施例中，为了生成频率编码的荧光数据，利用来自声光设备的输出激光束照射流动流中的样品，该输出激光束包括各自具有基于施加的射频驱动信号的幅度的强度的角度偏转的激光束。例如，用来照射流动流中的颗粒的输出激光束可以包括2个或更多个角度偏转的激光束，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个、例如7个或更多个、例如8个或更多个、例如9个或更多个、例如10个或更多个以及包括25个或更多个角度偏转的激光束。在实施例中，每个角度偏转的激光束具有不同的频率，这些频率从输入激光束的频率移位了预定的射频。
每个角度偏转的激光束还在空间上彼此移位。取决于施加的射频驱动信号和输出激光束的期望的照射分布，角度偏转的激光束可以分开0.001μm或更大，例如0.005μm或更大、例如0.01μm或更大、例如0.05μm或更大、例如0.1μm或更大、例如0.5μm或更大、例如1μm或更大、例如5μm或更大、例如10μm或更大、例如100μm或更大、例如500μm或更大、例如1000μm或更大以及包括5000μm或更大。在一些实施例中，角度偏转的激光束重叠，例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻的角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(例如束斑的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠、例如0.01μm或更多的重叠、例如0.05μm或更多的重叠、例如0.1μm或更多的重叠、例如0.5μm或更多的重叠、例如1μm或更多的重叠、例如5μm或更多的重叠、例如10μm或更多的重叠以及包括100μm或更多的重叠。
当颗粒穿过由两个子束叠加形成的激发束的一部分时，该颗粒会暴露于该两个子束的电场叠加中。由颗粒发射的荧光是利用拍频编码的频率，该拍频对应于入射子束的光学频率之间的差。举例来说，穿过由第一子束和第二子束的叠加形成的激发束的左水平边缘的颗粒发射的频率编码的荧光将表现出与第二子束的频率与第一子束的频率之间的差相对应的拍频(即f第一子束-f第二子束的拍频)。以这种方式，穿过激发束的颗粒的位置可以通过与这些颗粒发射的辐射相关联的RF拍频进行编码。在一些实施例中，这种对颗粒的位置的编码可以用来相对于光束强度的变化(例如在其水平方向上)归一化由这些颗粒发射的检测到的辐射的强度。
在一些实施例中，颗粒发射的频率编码的荧光是对应于本振光束的频率(fLO)与射频移位子束的频率之间的差的拍频。例如，频率编码的荧光数据包括fLO-fRF移位子束的拍频。在对流动流的照射包括跨越流动流的宽度(例如整个水平轴线)的本地振荡器的情况下，频率编码的荧光数据包括对应于本振光束的频率(fLO)与每个射频移位子束的频率(f1、f2、f3、f4、f5、f6等)之间的差的拍频。在这些实施例中，频率编码的荧光数据可以包括各自对应于流动流的水平轴线上的位置的多个拍频。
如下文更详细地讨论的，在一种操作模式下，可以利用多个激发频率同时照射流动流中的颗粒，每个激发频率可以例如通过对激光束的中心频率进行移位来获得。更具体地，可以用激光束同时照射多个样品位置，该激光束是通过将参考激光束(例如本地振荡器)与多个射频移位的激光束混合而生成的，使得参考光束和射频移位的光束之一照射每个样品位置以在该位置处激发感兴趣的荧光团(如果存在)。在一些实施例中，参考本地振荡器可以经由(例如来自激光器(如连续波激光器)的)光束的射频移位来生成。在这些实施例中，利用光照射的流动流中的颗粒的每个空间位置都用不同的拍频“标记”，该拍频对应于参考光束的频率与射频移位的光束之一的频率之间的差。在这些实例中，荧光团发射的荧光辐射将对拍频进行空间编码。
在某些实例中，利用多束频移光束照射流动流，通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像对流动流中的细胞进行成像，以生成频率编码的图像，例如在Diebold等人的自然光子学(Nature Photonics)Vol.7(10)；806-810(2013)中描述的以及美国专利No.9423353、No.9784661和No.10006852中以及美国专利公开No.2017/0133857和No.2017/0350803中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
在实施例中，频率编码的荧光数据是通过检测来自流动流中的颗粒的光来生成的。荧光数据可以从一个或更多个荧光检测器(例如一个或更多个检测通道)生成，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个以及包括8个或更多个荧光检测器(例如8个或更多个检测通道)。在一些实施例中，频率编码的荧光数据包括从来自其他检测器的光获取(或导出)的数据分量，例如检测到的光吸收或检测到的光散射。在一些实例中，根据从样品中检测到的光吸收(例如来自明场光检测器)生成来自样品的频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。如下文更详细地描述的，相位校正分量可以包括来自明场检测器的信号，在某些实施例中，该明场检测器用来生成相位校正的空间数据，该相位校正的空间数据是对根据频率编码的荧光数据计算的空间数据进行干涉相位调整的解释。在其他实例中，根据从样品中检测到的光散射(例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)生成来自样品的频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。
在实施例中，方法包括根据频率编码的荧光数据计算空间数据。根据本公开的实施例的空间数据是通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来进行相位校正的。在一些实施例中，空间数据包括颗粒的水平尺寸维度、颗粒的垂直尺寸维度、沿两个不同维度的颗粒尺寸比率、颗粒组成的尺寸比率(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比率)。
在一些实例中，相位校正分量用来生成修正变换系数(即，如下所述，用于将频率编码的数据变换成空间数据)。例如，相位校正分量可以包括2个或更多个修正变换系数，例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个修正变换系数。在通过执行傅立叶变换(如下所述)来计算空间数据的情况下，在某些实施例中，相位校正分量包括傅立叶变换仅生成实数数学计算分量(即，不生成虚数数学计算分量)的修正变换系数。
在某些实施例中，相位校正分量包括第一相位调整和第二相位调整。每个相位调整可以是频率编码的荧光数据中不同相位源导致的结果。在一个示例中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，第一相位调整可以包括来自明场光电检测器的输出信号。在一些实施例中，第一相位调整通过以下方式计算：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以生成相位调整值；并计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
在某些实施例中，第一相位调整是干涉相位调整。在这些实施例中，相位调整包括由用来照射流动流中的样品的光源引起的相移。例如，光源可以是光束发生器部件，该光束发生器部件配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束。根据某些实例的光束发生器包括激光器(例如连续波激光器)和声光偏转器(例如耦接到直接数字合成器RF梳状发生器)。在一些实施例中，干涉相位调整包括由光束发生器的部件之间的振动引起的相移。
在一些实施例中，第二相位调整基于样品中荧光团的荧光寿命。在这些实施例中，可以通过如下方法计算第二相位调整：获取来自所有荧光检测器的信号以确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。根据荧光团的具体类型和存在的荧光团的数量，可以计算一个或更多个荧光寿命，可以计算例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个荧光寿命。在一些实施例中，在荧光团峰值发射波长处计算每个荧光寿命。在这些实施例中，可以使用来自不同检测器通道的信号来检测和计算每个荧光团寿命。
在实施例中，方法还包括通过利用上文确定的相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算相位校正的空间数据。在一些实施例中，方法包括根据来自目标的频率编码的荧光数据计算空间数据。在一些实例中，计算目标的空间数据包括对频率编码的荧光数据进行变换。在一个示例中，通过对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换(FT)来计算空间数据。在另一个示例中，通过对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换(DFT)来计算空间数据。在又一个示例中，通过对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)来计算空间数据。在又一个示例中，利用数字锁相放大器来计算空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差并解复用该频率编码的荧光数据。通过在将频率编码的数据变换成空间数据之前考虑相位校正分量，使得与将原始频率数据变换成空间数据相比(即，不先考虑相位)，变换的输出在计算上的复杂度更低。在一些实施例中，方法包括对频率编码的荧光数据进行变换而不进行任何数学虚数计算(即，仅进行用于变换的数学实数计算的计算)，以根据频率编码的荧光数据生成空间数据。
在一些实施例中，方法包括根据频率编码的荧光生成流动流中的颗粒的图像。在一些实施例中，可以根据频率编码的荧光结合检测到的光吸收、检测到的光散射或其组合生成颗粒的图像。在某些实例中，仅根据频率编码的荧光生成颗粒的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光和从样品中检测到的光吸收(例如来自明场光检测器)生成目标的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光与从样品中检测到的光散射(例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)生成颗粒的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光以及检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合生成颗粒的图像。
可以根据频率编码的荧光数据生成颗粒的一个或更多个图像。在一些实施例中，根据频率编码的荧光数据生成颗粒的单个图像。在其他实施例中，根据频率编码的荧光数据生成颗粒的两个或更多个图像，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个以及包括10个或更多个图像或它们的组合。
如上所述，本公开的方法还包括分选颗粒。在实施例中，可以基于频率编码的荧光数据、计算的空间数据、生成的图像、根据计算的空间数据或生成的图像确定的颗粒的一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心、偏心率)或其中一些组合来分选颗粒。术语“分选”在本文中以其常规意义使用，以指代分离样品的组成(例如包含细胞的液滴、包含非细胞颗粒(例如生物大分子)的液滴)，并且在一些实例中，将分离的组成输送到一个或更多个样品收集容器。例如，方法可以包括对样品的2个或更多个组成进行分选，例如3个或更多个组成、例如4个或更多个组成、例如5个或更多个组成、例如10个或更多个组成、例如15个或更多个组成以及包括对样品的25个或更多个组成进行分选。在一些实例中，第一样品组成收集位置包括样品收集容器，第二样品组成收集位置包括废物收集容器。
在从流动流中的样品中分选颗粒时，方法包括例如利用计算机采集数据(例如荧光数据)、分析(确定频率编码的荧光数据、确定相位校正分量、计算频率编码的数据到相位校正空间数据的变换)和记录，其中多个数据通道记录来自每个检测器(例如散射检测器、明场光电检测器或荧光检测器)的数据。在这些实施例中，分析包括对颗粒进行分类和计数，使得每个颗粒以一组数字化的参数值的形式存在。主题***(如下所述)可以设置成在选择的参数上触发，以便将感兴趣的颗粒与背景和噪声区分开。
然后可以通过基于针对整个族群收集的频率编码的荧光数据进行“门控”来进一步分析感兴趣的特定子群(例如单个细胞)。为了选择合适的门限，绘制数据以便获得可能的子群的最佳分离。该过程可以通过绘制图像矩或一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心、偏心率)来进行。在其他实施例中，方法包括在二维点图上绘制前向光散射(FSC)与侧向(即，正交)光散射(SSC)。在其他实施例中，方法包括针对前向光散射(FSC)和侧向(即，正交)光散射(SSC)中的一个或更多个绘制一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心、偏心率)。在其他实施例中，方法包括针对前向光散射(FSC)和侧向(即正交)光散射(SSC)对颗粒族群进行门控，然后基于目标的图像、基于一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心，偏心率)进行门控。在其他实施例中，方法包括基于目标的图像、基于一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心、偏心率)对颗粒族群进行门控，然后针对前向光散射(FSC)和侧向(即正交)光散射(SSC)对颗粒族群进行门控。
然后选择目标的子群(即门限内的那些单个细胞)并排除不在门限内的颗粒。在期望的情况下，可以使用计算机屏幕上的光标在期望的子群周围画线来选择门限。然后通过绘制这些颗粒的其他参数(例如荧光)，仅对门限内的那些颗粒进行进一步分析。在期望的情况下，上述分析可以配置成产生样品中感兴趣的颗粒的计数。
在一些实施例中，用于分选样品组成的方法包括利用具有偏转器板的颗粒分选模块分选颗粒(例如生物样品中的细胞)，例如在2017年3月28日提交的美国专利公开No.2017/0299493中描述的，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，使用具有多个分选决策单元的分选决策模块分选样品的细胞，例如在2019年2月8日提交的美国临时专利申请No.62/803264中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
图1示出了根据某些实施例的用于生成频率编码的荧光数据并根据频率编码的荧光数据计算相位校正的空间数据的流程图。在步骤101处，检测来自流动流中的颗粒(例如细胞)的光(光吸收、散射的光或光发射)。在步骤102处，生成颗粒的频率编码的荧光数据(例如沿水平轴线的每个空间位置的频率数据)。在步骤103处，确定相位校正分量，例如干涉相位分量和荧光寿命相位分量。在步骤104处，通过例如利用离散傅立叶变换对频率编码的荧光数据进行变换来计算相位校正的空间数据。在步骤105处，可以使用空间数据来生成图像。然后，在步骤106处，可以使用图像掩模来生成图像掩模。在步骤107处，可以使用两个或更多个图像来计算细胞的一个或更多个特征(例如细胞器)的共定位，或者在步骤108处，可以使用图像掩模来计算共定位。
图2示出了根据某些实施例的使用相位校正的空间数据生成颗粒的图像与空间数据未进行相位校正的图像的比较。如组A所示，例如在未进行相位校正的情况下，通过使用快速傅立叶变换(FFT)来将频率编码的荧光数据变换成空间数据。生成的图像示出了较低的分辨率，颗粒被背景噪声遮蔽。在组B中，频率编码的荧光数据是利用相位调整部件结合FFT进行了校正的相位，以生成相位校正的空间数据。相位校正的空间数据提供了未被背景噪声遮蔽的增强分辨率的颗粒成像。
用于表征样品中的颗粒的***
如上所述，本公开的各个方面包括用于表征样品颗粒(例如生物样品中的细胞)的***。根据某些实施例的***包括光源和光检测***，光源配置为照射流动流中具有颗粒的样品，光检测***具有光电检测器和处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器被配置为：根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；以及通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
感兴趣的***包括配置为照射流动流中的样品的光源。在实施例中，光源可以是任何合适的宽带或窄带光源。取决于样品中的组成(例如细胞、珠粒、非细胞颗粒等)，光源可以配置为发射波长变化的光，波长变化范围为200nm到1500nm，例如250nm到1250nm、例如300nm到1000nm、例如350nm到900nm以及包括400nm到800nm。例如，光源可以包括发射波长200nm到900nm的光的宽带光源。在其他实例中，光源包括发射波长200nm到900nm的窄带光源。例如，光源可以是发射波长200nm到900nm的光的窄带LED(1nm-25nm)。
在一些实施例中，光源是激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器(例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)准分子激光器、氪-氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或它们的组合)、染料激光器(例如芪、香豆素或罗丹明激光器)、金属蒸气激光器(例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合)、固态激光器(例如红宝石激光器、Nd：YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd：YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器，钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb2O3激光器或掺铈激光器及它们的组合)、半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(OPSL)或将上述任何激光器实施为倍频或三倍频。
在其他实施例中，光源为非激光光源，例如灯，包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、发光二极管，发光二极管例如具有连续光谱的宽带LED、超亮发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱LED白光源、多LED集成。在一些实例中，非激光光源是稳定的光纤耦合宽带光源、白光源以及其他光源或它们的任何组合。
在某些实施例中，光源是配置为产生两个或更多个频移光束的光束发生器。在一些实例中，光束发生器包括配置为向声光设备施加射频驱动信号以产生两个或更多个角度偏转的激光束的激光器、射频发生器。在这些实施例中，激光器可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，感兴趣的光束发生器中的激光器可以是气体激光器(例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、CO2激光器、CO激光器、氩-氟(ArF)准分子激光器、氪-氟(KrF)准分子激光器、氙氯(XeCl)准分子激光器或氙氟(XeF)准分子激光器或它们的组合)、染料激光器(例如芪、香豆素或罗丹明激光器)、金属蒸气激光器(例如氦镉(HeCd)激光器、氦汞(HeHg)激光器、氦硒(HeSe)激光器、氦银(HeAg)激光器、锶激光器、氖铜(NeCu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合)、固态激光器(例如红宝石激光器、Nd:YAG激光器、NdCrYAG激光器、Er:YAG激光器、Nd:YLF激光器、Nd:YVO4激光器、Nd:YCa4O(BO3)3激光器、Nd:YCOB激光器，钛蓝宝石激光器、铥YAG激光器、镱YAG激光器、Yb2O3激光器或掺铈激光器及它们的组合)。
声光设备可以是任何方便的声光协议，该声光协议配置为使用施加的声波对激光进行频移。在某些实施例中，声光设备是声光偏转器。主题***中的声光设备配置为根据来自激光器的光和施加的射频驱动信号生成角度偏转的激光束。可以利用任何合适的射频驱动信号源(例如直接数字合成器(DDS)、任意波形发生器(AWG)或电脉冲发生器)向声光设备施加射频驱动信号。
在实施例中，控制器配置为向声光装置施加射频驱动信号以在输出激光束中产生期望数量的角度偏转的激光束，例如配置为施加3个或更多个射频驱动信号、例如4个或更多个射频驱动信号、例如5个或更多个射频驱动信号、例如6个或更多个射频驱动信号、例如7个或更多个射频驱动信号、例如8个或更多个射频驱动信号、例如9个或更多个射频驱动信号、例如10个或更多个射频驱动信号驱动信号、例如15个或更多个射频驱动信号、例如25个或更多个射频驱动信号、例如50个或更多个射频驱动信号以及包括配置为施加100个或更多个射频驱动信号。
在一些实例中，为了在输出激光束中产生角度偏转的激光束的强度分布，控制器配置为施加具有变化的幅度的射频驱动信号，变化的幅度例如约0.001V到约500V、例如约0.005V到约400V、例如约0.01V到约300V、例如约0.05V到约200V、例如约0.1V到约100V、例如约0.5V到约75V、例如约1V到50V、例如约2V到40V、例如3V到约30V以及包括约5V到约25V。在一些实施例中，每个施加的射频驱动信号具有约0.001MHz到约500MHz的频率，例如约0.005MHz到约400MHz、例如约0.01MHz到约300MHz、例如约0.05MHz到约200MHz、例如约0.1MHz到约100MHz、例如约0.5MHz到约90MHz、例如约1MHz到约75MHz、例如约2MHz到约70MHz、例如约3MHz到约65MHz、例如约4MHz到约60MHz以及包括约5MHz到约50MHz。
在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器产生具有期望的强度分布的角度偏转的激光束的输出激光束。例如，存储器可以包括用于产生具有相同强度的两个或更多个角度偏转的激光束的指令，角度偏转的激光束例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50个或更多个，并且包括存储器可以包括用于产生具有相同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令。在其他实施例中，存储器可以包括用于产生具有不同强度的两个或更多个角度偏转的激光束的指令，角度偏转的激光束例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如10个或更多个、例如25个或更多个、例如50个或更多个，并且包括存储器可以包括用于产生具有不同强度的100个或更多个角度偏转的激光束的指令。
在某些实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器产生强度沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心增加的输出激光束。在这些实例中，输出光束的中心处的角度偏转的激光束的强度范围可以为沿水平轴线的输出激光束的边缘处的角度偏转的激光束的强度的0.1％到约99％，例如0.5％到约95％、例如1％到约90％、例如约2％到约85％、例如约3％到约80％、例如约4％到约75％、例如约5％到约70％、例如约6％到约65％、例如约7％到约60％、例如约8％到约55％，以及包括沿水平轴线的输出激光束的边缘处的角度偏转的激光束的强度的约10％到约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器产生强度沿水平轴线从输出激光束的边缘到中心增加的输出激光束。在这些实例中，输出光束的边缘处的角度偏转的激光束的强度范围可以为沿水平轴线的输出激光束的中心处的角度偏转的激光束的强度的0.1％到约99％，例如0.5％到约95％、例如1％到约90％、例如约2％到约85％、例如约3％到约80％、例如约4％到约75％、例如约5％到约70％、例如约6％到约65％、例如约7％到约60％、例如约8％到约55％，以及包括沿水平轴线的输出激光束的中心处的角度偏转的激光束的强度的约10％到约50％。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器产生强度沿水平轴线以高斯分布进行分布的输出激光束。在其他实施例中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器产生沿水平轴线具有礼帽形(top hat)强度分布的输出激光束。
在实施例中，感兴趣的光束发生器可以配置为在输出激光束中产生在空间上分开的角度偏转的激光束。取决于施加的射频驱动信号和输出激光束的期望的照射分布，角度偏转的激光束可以分开0.001μm或更大，例如0.005μm或更大、例如0.01μm或更大、例如0.05μm或更大、例如0.1μm或更大、例如0.5μm或更大、例如1μm或更大、例如5μm或更大、例如10μm或更大、例如100μm或更大、例如500μm或更大、例如1000μm或更大以及包括5000μm或更大。在一些实施例中，***配置为在输出激光束中产生例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻的角度偏转的激光束重叠的角度偏转的激光束。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(例如束斑的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠、例如0.01μm或更多的重叠、例如重叠0.05μm或更多的重叠、例如0.1μm或更多的重叠、例如0.5μm或更多的重叠、例如1μm或更多的重叠、例如5μm或更多的重叠、例如重叠10μm或更多以及包括100μm或更大多的重叠。
在某些情况下，配置为产生两个或更多个频移光束的光束发生器包括如美国专利No.9423353、No.9784661和No.10006852以及美国专利公开No.2017/0133857和No.2017/0350803中所述的激光激发模块，其公开内容通过引用并入本文。
在实施例中，***包括具有用于检测和测量来自样品的光的一个或更多个光电检测器的光检测***。感兴趣的光电检测器可以配置为测量来自样品的光吸收(例如明场光数据的光吸收)、光散射(例如前向或侧向散射光数据)、光发射(例如荧光数据)或它们的组合。感兴趣的光电检测器可以包括但不限于光学传感器(例如有源像素传感器(APS)、雪崩光电二极管、图像传感器、电荷耦合器件(CCD)、增强型电荷耦合器件(ICCD)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热电检测器、光敏电阻、光伏单元、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管和它们的组合)以及其他光电检测器。在某些实施例中，利用电荷耦合器件(CCD)、半导体电荷耦合器件(CCD)、有源像素传感器(APS)、互补金属氧化物半导体(CMOS)图像传感器或N型金属氧化物半导体(NMOS)图像传感器测量来自样品的光。
在一些实施例中，感兴趣的光检测***包括多个光电检测器。在一些实例中，光检测***包括多个固态检测器，例如光电二极管。在某些实例中，光检测***包括光电检测器阵列，例如光电二极管阵列。在这些实施例中，光电检测器阵列可以包括4个或更多个光电检测器，例如10个或更多个光电检测器、例如25个或更多个光电检测器、例如50个或更多个光电检测器、例如100个或更多个光电检测器、例如250个或更多个光电检测器、例如作为500个或更多个光电检测器、例如750个或更多个光电检测器以及包括1000个或更多个光电检测器。例如，检测器可以是具有4个或更多个光电二极管的光电二极管阵列，例如10个或更多个光电二极管、例如25个或更多个光电二极管、例如50个或更多个光电二极管、例如100个或更多个光电二极管、例如250个或更多个光电二极管、例如500个或更多个光电二极管、例如750个或更多个光电二极管以及包括1000个或更多个光电二极管。
光电检测器可以根据需要设置成任何几何构型，其中感兴趣的设置包括但不限于正方形构型、矩形构型、梯形构型、三角形构型、六边形构型、七边形构型、八边形构型、九边形构型、十边形构型、十二边形构型、圆形构型、椭圆形构型以及不规则图案构型。光电检测器阵列中的光电检测器可以相对于另一个光电检测器(如在XZ平面中参考)以10°到180°的角度定向，例如15°到170°、例如20°到160°、例如25°到150°、例如30°到120°以及包括45°到90°。光电检测器阵列可以是任何合适的形状，可以是直线形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线型的底部部分)。在某些实施例中，光电检测器阵列具有矩形形状有源表面。
阵列中的每个光电检测器(例如光电二极管)可以具有宽度为5μm到250μm(例如10μm到225μm、例如15μm到200μm、例如20μm到175μm、例如25μm到150μm、例如30μm到125μm以及包括50μm到100μm)且其长度为5μm到250μm(例如10μm到225μm、例如15μm到200μm、例如20μm到175μm、例如25μm到150μm、例如30μm到125μm以及包括50μm到100μm)的有源表面，其中阵列中每个光电检测器(例如光电二极管)的表面面积为25μm2到10000μm2，例如50μm2到9000μm2、例如75μm2到8000μm2、例如100μm2到7000μm2、例如150μm2到6000μm2以及包括200μm2到5000μm2。
光电检测器阵列的尺寸可以根据光量和光的强度、光电检测器的数量和期望的灵敏度而变化，并且光电检测器阵列的尺寸的长度可以为0.01mm到100mm，例如0.05mm到90mm、例如0.1mm到80mm、例如0.5mm到70mm、例如1mm到60mm、例如2mm到50mm、例如3mm到40mm、例如4mm到30mm以及包括5mm至25mm。光电检测器阵列的宽度也可以从0.01mm到100mm变化，例如0.05mm到90mm、例如0.1mm到80mm、例如0.5mm到70mm、例如1mm至60mm、例如2mm至50mm、例如3mm至40mm、例如4mm至30mm以及包括5mm至25mm。因此，光电检测器阵列的有源表面可以为0.1mm2到10000mm2，例如0.5mm2到5000mm2、例如1mm2到1000mm2、例如5mm2到500mm2以及包括10mm2至100mm2。
感兴趣的光电检测器配置为测量在一个或更多个波长处收集的光，例如在2个或更多个波长处，例如在5个或更多个不同波长处、例如在10个或更多个不同波长处、例如在25个或更多个不同波长处、例如在50个或更多个不同波长处、例如在100个或更多个不同波长处、例如在200个或更多个不同波长处、例如在300个或更多个不同波长处，以及包括测量在400个或更多个不同波长处流动流中的样品发射的光。
在一些实施例中，光电检测器配置为测量在一定波长范围(例如200nm-1000nm)内收集的光。在某些实施例中，感兴趣的光电检测器配置为收集一定波长范围内的光谱。例如，***可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器配置为收集一个或更多个200nm-1000nm波长范围内的光谱。在其他实施例中，感兴趣的检测器配置为测量一个或更多个特定波长处的来自流动流中的样品的光。例如，***可以包括一个或更多个检测器，所述一个或更多个检测器配置为测量在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及它们的任何组合中一处或更多处的光。
光检测***配置为连续地或以离散的间隔测量光。在一些实例中，感兴趣的光电检测器配置为连续地测量收集的光。在其他实例中，光检测***配置为以离散的间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒以及包括每1000毫秒或以一些其他间隔测量光。
在实施例中，***配置为通过照射在流动流中具有颗粒的样品来生成频率编码的荧光数据。在一些实施例中，光源包括光发生器部件，该光发生器部件生成多个角度偏转的激光束，每个角度偏转的激光束均具有基于施加的射频驱动信号(例如来自耦合到声光设备的直接数字合成器)的幅度的强度。例如，主题***可以包括光发生器部件，该发生器部件生成2个或更多个角度偏转的激光束，例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个、例如7个或更多个、例如8个或更多个、例如9个或更多个、例如10个或更多个以及包括25个或更多个角度偏转的激光束。在实施例中，每个角度偏转的激光束具有不同的频率，这些频率从输入激光束的频率移位预定的射频。
根据某些实施例，主题***配置为生成角度偏转的激光束，所述角度偏转的激光束还在空间上彼此移位。取决于施加的射频驱动信号和输出激光束的期望的照射分布，主题***可以配置为生成角度偏转的激光束，该角度偏转的激光束分开0.001μm或更大，例如0.005μm或更大、例如0.01μm或更大、例如0.05μm或更大、例如0.1μm或更大、例如0.5μm或更大、例如1μm或更大、例如5μm或更大、例如10μm或更大、例如100μm或更大、例如500μm或更大、例如1000μm或更大以及包括5000μm或更大。在一些实施例中，角度偏转的激光束重叠，例如与沿输出激光束的水平轴线的相邻的角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(例如束斑的重叠)可以是0.001μm或更多的重叠，例如0.005μm或更多的重叠、例如0.01μm或更多的重叠、例如0.05μm或更多的重叠、例如0.1μm或更多的重叠、例如0.5μm或更多的重叠、例如1μm或更多的重叠、例如5μm或更多的重叠、例如10μm或更多的重叠以及包括100μm或更多的重叠。
在一些实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过计算流动流上入射的重叠的光子束的光学频率之间的差来生成频率编码的荧光数据。在一个示例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器计算流动流的水平轴线上的每个位置处的拍频。在这些实施例中，由颗粒发射的频率编码的荧光是对应于本振光束的频率(fLO)与射频移位子束的频率之间的差的拍频。例如，频率编码的荧光数据包括fLO-fRF移位子束的拍频。在对流动流的照射包括跨越流动流的宽度(例如整个水平轴线)的本地振荡器的情况下，频率编码的荧光数据包括对应于本振光束的频率(fLO)与每个射频移位子束的频率(f1、f2、f3、f4、f5、f6等)之间的差的拍频。在这些实施例中，频率编码的荧光数据可以包括各自对应于流动流的水平轴线上的位置的多个拍频。
在实施例中，***配置为根据检测到的来自流动流中的颗粒的光生成频率编码的荧光数据。荧光数据可以从一个或更多个荧光检测器(例如一个或更多个检测通道)生成，例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个以及包括8个或更多个荧光检测器(例如8个或更多个检测通道)。在一些实施例中，频率编码的荧光数据包括从来自其他检测器的光获取(或导出)的数据分量，例如检测到的光吸收或检测到的光散射。在一些实例中，***配置为根据从样品中检测到的光吸收(例如来自明场光检测器)生成频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。例如，***可以配置为根据来自明场检测器的信号生成相位校正分量。在某些实施例中，***配置为生成相位校正的空间数据，该相位校正的空间数据是对根据频率编码的荧光数据计算的空间数据进行干涉相位调整的解释。在其他实例中，***配置为根据从样品中检测到的光散射(例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)生成频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。
在实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器根据频率编码的荧光数据计算空间数据。根据本公开的实施例的空间数据是***通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来进行相位校正的。在一些实施例中，空间数据包括颗粒的水平尺寸维度、颗粒的垂直尺寸维度、沿两个不同维度的颗粒尺寸比率、颗粒组成的尺寸比率(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比率)。
在一些实施例中，***配置为计算修正变换系数，用于将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据。例如，相位校正分量可以包括2个或更多个修正变换系数，例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个修正变换系数。在通过执行傅立叶变换来计算空间数据的情况下，相位校正分量包括傅立叶变换仅生成实数数学计算分量(即，不生成虚数数学计算分量)的修正变换系数。
在一些实例中，***配置为确定包括第一相位调整和第二相位调整的相位校正分量。每个相位调整可以是频率编码的荧光数据中不同相位源的结果。在一个示例中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，第一相位调整可以包括来自明场光电检测器的输出信号。在一些实施例中，***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过以下方式计算第一相位调整：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以生成相位调整值；并计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
在其他实例中，***配置为基于样品中荧光团的荧光寿命来计算第二相位调整。在这些实例中，***配置为通过如下方法计算第二相位调整：获取来自所有荧光检测器的信号以确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。主题***可以配置为使用不同的检测器通道来计算荧光寿命，例如通过使用2个或更多个检测通道、例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个检测器通道来计算荧光寿命。
在实施例中，主题***包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施例中，为了计算相位校正的空间数据，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)。在其他实施例中，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换(DFT)。在其他实施例中，***配置为利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差并解复用该频率编码的荧光数据。
在一些实施例中，***配置为在将频率编码数据变换成空间数据之前考虑相位校正分量，使得与将原始频率数据变换成空间数据相比(即，不先考虑相位)，变换的输出在计算上的复杂度更低。在一些实施例中，***配置为对频率编码的荧光数据进行变换而不进行任何数学虚数计算(即，仅进行用于变换的数学实数计算的计算)，以根据频率编码的荧光数据生成空间数据。
主题***可以配置为根据频率编码的荧光生成流动流中的颗粒的一个或更多个图像。在一些实施例中，可以根据频率编码的荧光结合检测到的光吸收、检测到的光散射或其组合生成颗粒的图像。在某些实例中，仅根据频率编码的荧光生成颗粒的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光和从样品中检测到的光吸收(例如来自明场光检测器)生成目标的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光与从样品中检测到的光散射(例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或者侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)生成颗粒的图像。在其他实例中，根据频率编码的荧光以及检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合生成颗粒的图像。
根据一些实施例的***可以包括显示器和操作员输入设备。例如，操作员输入设备可以是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问其上存储有指令的存储器，以用于进行主题方法的步骤。处理模块可以包括操作***、图形用户界面(GUI)控制器、***存储器、存储器存储设备以及输入-输出控制器、高速缓存存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是可商购的处理器，或者其可以是可用的或将可用的其他处理器之一。如本领域已知的，处理器执行操作***，操作***以众所周知的方式与固件和硬件交互，并且有利于处理器协调和执行各种计算机程序的功能，这些计算机程序可以用多种编程语言(例如Java、Perl、C++、其他高级或低级语言及它们的组合)编写。操作***通常与处理器协作，协调和执行计算机其他部件的功能。操作***还提供调度、输入-输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关服务，所有这些都是根据已知技术进行的。处理器可以是任何合适的模拟或数字***。在一些实施例中，处理器包括提供反馈控制(例如负反馈控制)的模拟电子设备。
***存储器可以是多种已知的或未来的存储器存储设备中的任何一种。示例包括任何常用的随机存取存储器(RAM)、磁性介质(例如常驻硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)、闪速存储器设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是多种已知或未来设备中的任何一种，其包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常分别从程序存储介质(未示出)中读取和/或向程序存储介质写入，该程序存储介质例如是光盘、磁带、可移动硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一种，或者现在使用的或以后可以开发的其他程序存储介质，都可以被认为是计算机程序产品。应当理解的是，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序(也称为计算机控制逻辑)通常存储在***存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
在一些实施例中，描述了一种计算机程序产品，其包括具有计算机可用介质，该计算机可用介质具有存储在其中的控制逻辑(包括程序代码的计算机软件程序)。控制逻辑在由计算机处理器执行时使处理器进行本文描述的功能。在其他实施例中，一些功能主要使用例如硬件状态机在硬件中实施。实施硬件状态机以便执行本文描述的功能对相关领域的技术人员来说是显而易见的。
存储器可以是处理器能够在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁性、光学或固态存储设备(其包括磁盘或光盘或磁带或RAM或任何其他合适的固定的或便携式设备)。处理器可以包括通用数字微处理器，该通用数字微处理器能够通过携带必要程序代码的计算机可读介质适当地编程。编程能够通过通信信道远程提供给处理器，或者使用与存储器相关的那些设备中的任何一个预先保存在计算机程序产品(诸如存储器或一些其他便携式或固定计算机可读存储介质)中。例如，磁盘或光盘可以携带编程，并且能够由盘写入器/读取器读取。本发明的***还包括用于实践上述方法的编程，例如以计算机程序产品、算法的形式的编程。根据本发明的编程能够记录在计算机可读介质上，例如能够由计算机直接读取和访问的任何介质。这种介质包括但不限于：磁性存储介质，例如软盘、硬盘存储介质、磁带；光学存储介质，例如CD-ROM；电存储介质，例如RAM和ROM；便携式闪速存储器驱动器；以及这些类别的混合体，例如磁/光存储介质。
处理器还可以访问通信信道以与在远程位置的用户进行通信。远程位置是指用户不直接与***接触，而是将输入信息从外部设备(例如连接到广域网(“WAN”)、电话网络、卫星网络或包括移动电话(即智能电话)任何其他合适的通信信道的计算机)中继到输入管理器。
在一些实施例中，根据本公开的***可以配置为包括通信接口。在一些实施例中，通信接口包括用于与网络和/或另一个设备通信的接收器和/或发射器。通信接口可以配置为有线或无线通信，该有线或无线通信包括但不限于射频(RF)通信(例如射频识别(RFID)、Zigbee通信协议、WiFi、红外线、无线通用串行总线(USB)、超宽带(UWB)、
Figure BDA0003343075980000351
通信协议)和蜂窝通信(例如码分多址(CDMA)或全球移动通信***(GSM))。
在一个实施例中，通信接口配置为包括一个或更多个通信端口(例如物理端口或接口(如USB端口、RS-232端口或任何其他合适的电连接端口))以允许主题***与其他外部设备(例如配置用于类似的互补数据通信的计算机终端(例如在医生办公室或医院环境中的计算机终端))之间的数据通信。
在一个实施例中，通信接口配置用于红外通信、
Figure BDA0003343075980000352
通信或任何其他合适的无线通信协议，以使主题***能够与其他设备(例如计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助理或用户可以结合使用的任何其他通信设备)通信。
在一个实施例中，通信接口配置为利用互联网协议(IP)，通过蜂窝电话网络、短消息服务(SMS)、到连接到互联网的局域网(LAN)上的个人电脑(PC)的无线连接或在WiFi热点处连接到互联网的WiFi连接来提供数据传输连接。
在一个实施例中，主题***配置为经由通信接口与服务器设备进行无线通信，例如使用如802.11或
Figure BDA0003343075980000361
RF协议或IrDA红外协议的通用标准经由通信接口与服务器设备进行无线通信。服务器设备可以是另一个便携式设备，例如智能电话、个人数字助理(PDA)或笔记本电脑；或者较大的设备，例如台式计算机、电器等。在一些实施例中，服务器设备具有显示器(例如液晶显示器(LCD))以及输入设备(例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏)。
在一些实施例中，通信接口配置为使用上述的一个或更多个通信协议和/或机制与网络或服务器设备自动或半自动地通信存储在主题***中(在可选数据存储单元中)的数据。
输出控制器可以包括用于向用户(无论是人还是机器，无论是本地的还是远程的)呈现信息的多种已知显示设备中的任何一种的控制器。如果显示设备之一提供视觉信息，则该信息通常可以逻辑地和/或物理地组织为图片元素阵列。图形用户界面(GUI)控制器可以包括用于在***与用户之间提供图形输入和输出界面以及用于处理用户输入的多种已知或未来软件程序中的任何一种。计算机的功能元件可以通过***总线彼此通信。这些通信中的一些可以在替换的实施例中使用网络或其他类型的远程通信来实现。根据已知技术，输出管理器还可以例如通过因特网、电话或卫星网络向远程位置的用户提供由处理模块生成的信息。输出管理器对数据的呈现可以根据多种已知技术来实施。作为一些示例，数据可以包括SQL、HTML或XML文档、电子邮件或其他文件或者其他形式的数据。数据可以包括互联网URL地址，以便用户可以从远程源检索附加的SQL、HTML、XML或其他文档或者数据。主题***中存在的一个或更多个平台可以是任何类型的已知计算机平台或未来要开发的类型，尽管它们通常属于一般称为服务器的一类计算机。然而，它们也可以是主机计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以经由任何已知或未来类型的电缆或其他通信***(包括无线***)连接，无论是联网的还是其他方式。它们可以处于相同位置，也可以在物理上分离。可以在任何计算机平台上采用各种操作***，这可能取决于选择的计算机平台的类型和/或结构。适当的操作***包括Windows 10、Windows NT、Windows XP、Windows 7、Windows 8、iOS、Sun Solaris、Linux、OS/400、Compaq Tru64 Unix、SGI IRIX、SiemensReliant Unix、Ubuntu、Zorin OS等。
在某些实施例中，主题***包括一个或更多个光学调整部件，所述一个或更多个光学调整部件用于调整光，例如照射到样品上的光(例如来自激光)或从样品中收集的光(例如荧光)。例如，光学调整可以是增加光的维度、光的聚焦或使光准直。在一些实例中，光学调整是放大协议，以便增加光(例如束斑)的维度，例如增加5％或更多、例如增加10％或更多、例如增加25％或更多、例如增加50％或更多的维度以及包括增加75％或更多的维度。在其他实施例中，光学调整包括聚焦光以便减小光的维度，例如减少5％或更多、例如减少10％或更多、例如减少25％或更多、例如减少50％或更多的光的维度，以及包括减小75％或更多的束斑维度。在某些实施例中，光学调整包括使光准直。术语“准直”在其传统意义用于指光学调整光传播的准直性或减少来自公共传播轴线的光的发散。在一些实例中，准直包括使光束的空间横截面变窄(例如减小激光的光束轮廓)。
在一些实施例中，光学调整部件是放大率为0.1到0.95的聚焦透镜，例如放大率为0.2到0.9、例如放大率为0.3到0.85、例如放大率为0.35到0.8、例如放大率为0.5到0.75，并且包括放大率为0.55到0.7，例如放大率为0.6。例如，在某些实例中，聚焦透镜是放大率约0.6的双消色差缩小透镜。聚焦透镜的焦距可以从5mm到20mm变化，例如焦距为6mm到19mm、例如焦距为7mm到18mm、例如焦距为8mm到17mm、例如焦距为9mm到16mm，并且包括焦距为10mm到15mm。在某些实施例中，聚焦透镜的焦距约13mm。
在其他实施例中，光学调整部件是准直器。准直器可以是任何方便的准直协议，例如一个或更多个反射镜或曲面透镜或其组合。例如，准直器在某些实例中是单个准直透镜。在其他实例中，准直器是准直反射镜。在其他实例中，准直器包括两个透镜。在其他实例中，准直器包括反射镜和透镜。在准直器包括一个或更多个透镜的情况下，准直透镜的焦距可以从5mm到40mm变化，例如焦距为6mm到37.5mm、例如焦距为7mm到35mm、例如焦距为8mm到32.5mm、例如焦距为9mm到30mm、例如焦距为10mm到27.5mm、例如焦距为12.5mm到25mm，并且包括焦距为15mm到20mm。
在一些实施例中，主题***包括流动池喷嘴，该流动池喷嘴具有配置为使流动流流过流动池喷嘴的喷嘴孔口。主题流动池喷嘴具有将流体样品传播到样品询问区域的孔口，其中在一些实施例中，流动池喷嘴包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止于具有横向于纵向轴线的喷嘴孔口的平坦表面的远端截头圆锥形部分。近端圆柱形部分的长度(沿纵轴测量)可以从1mm到15mm变化，例如1.5mm到12.5mm、例如2mm到10mm、例如3mm到9mm以及包括4mm到8mm。远端截头圆锥部分的长度(沿纵轴测量)也可以从1mm到10mm变化，例如2mm到9mm、例如3mm到8mm以及包括4mm到7mm。在一些实施例中，流动池喷嘴室的直径可以从1mm到10mm变化，例如2mm到9mm、例如3mm到8mm以及包括4mm到7mm。
在某些实例中，喷嘴室不包括圆柱形部分，并且整个流动池喷嘴室是截头圆锥形的。在这些实施例中，截头圆锥形喷嘴室的长度(沿横向于喷嘴孔口的纵向轴线测量)可以为1mm到15mm，例如1.5mm到12.5mm、例如2mm到10mm、例如3mm到9mm以及包括4mm到8mm。截头圆锥形喷嘴室的近端部分的直径可以为1mm到10mm，例如2mm到9mm、例如3mm到8mm以及包括4mm到7mm。
在实施例中，样品流动流从流动池喷嘴远端处的孔口流出。根据流动流的期望特性，流动池喷嘴孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线型底部部分)。在某些实施例中，感兴趣的流动池喷嘴具有圆形孔口。在一些实施例中，喷嘴孔口的尺寸可以从1μm到20000μm变化，例如2μm到17500μm、例如5μm到15000μm、例如10μm到12500μm、例如15μm到10000μm、例如25μm到7500μm、例如50μm到5000μm、例如75μm到1000μm、例如100μm到750μm以及包括150μm到500μm。在某些实施例中，喷嘴孔口是100μm。
在一些实施例中，流动池喷嘴包括配置为将样品提供给流动池喷嘴的样品注入口。在实施例中，样品注入***配置为将合适的样品流提供给流动池喷嘴室。根据流动流的期望特性，由样品注入口向流动池喷嘴室输送样品的速率可以是1μL/sec或更高，例如2μL/sec或更高、例如3μL/sec或更高、例如5μL/sec或更高、例如10μL/sec或更高、例如15μL/sec或更高、例如25μL/sec或更高、例如50μL/sec或更高、例如100μL/sec或更高、例如150μL/sec或更高、例如200μL/sec或更高、例如250μL/sec或更高、例如300μL/sec或更高、例如350μL/sec或更高、例如400μL/sec或更高、例如450μL/sec或更高以及包括500μL/sec或更高。例如，样品流量可以为1μL/sec到约500μL/sec，例如2μL/sec到约450μL/sec、例如3μL/sec到约400μL/sec、例如4μL/sec到约350μL/sec、例如5μL/sec到约300μL/sec、例如6μL/sec到约250μL/sec，例如7μL/sec到约200μL/sec、例如8μL/sec到约150μL/sec、例如9μL/sec到约125μL/sec，以及包括10μL/sec到约100μL/sec。
样品注入口可以是位于喷嘴室壁中的孔口或者可以是位于喷嘴室近端处的导管。在样品注入口是位于喷嘴室壁中的孔口的情况下，样品注入口的孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形等)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线型底部部分)。在某些实施例中，样品注入口具有圆形孔口。样品注入口的孔口的尺寸可以根据形状变化，在某些实例中，该孔口具有0.1mm到5.0mm的开口，例如0.2mm到3.0mm、例如0.5mm到2.5mm、例如0.75mm到2.25mm、例如1mm到2mm，并且包括1.25mm到1.75mm，例如1.5mm的开口。
在某些实例中，样品注入口是位于流动池喷嘴室近端处的导管。例如，样品注入口可以是定位成使样品注入口的孔口与流动池喷嘴孔口成直线的导管。在样品注入口是与流动池喷嘴孔口成直线定位的导管的情况下，样品注入管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线型底部部分)。导管的孔口可以根据形状变化，在某些实例中，该孔口的开口为0.1mm到5.0mm，例如0.2mm到3.0mm、例如0.5mm到2.5mm、例如0.75mm到2.25mm、例如1mm到2mm，并且包括1.25mm到1.75mm的开口，例如1.5mm的开口。样品注入口的尖端形状可以与样品注入管的横截面形状相同或不同。例如，样品注入口的孔口可以包括斜角尖端，该斜角尖端具有1°到10°的斜角角度，例如2°到9°、例如3°到8°、例如4°到7°的斜角角度，并且包括5°的斜角角度。
在一些实施例中，流动池喷嘴还包括配置为向流动池喷嘴提供鞘液的鞘液注入口。在实施例中，鞘液注入***配置为将鞘液提供给流动池喷嘴室，例如将鞘液与样品一起提供给流动池喷嘴室以产生围绕样品流动流的层状鞘液流。根据流动流的期望特性，向流动池喷嘴室输送鞘液的速率可以是25μL/sec或更高，例如50μL/sec或更高、例如75μL/sec或更高、例如100μL/sec或更高、例如250μL/sec或更高、例如500μL/sec或更高、例如750μL/sec或更高、例如1000μL/sec或更高以及包括2500μL/sec或者更高。例如，鞘液流速可以为1μL/sec到约500μL/sec、例如2μL/sec到约450μL/sec、例如3μL/sec到约400μL/sec、例如4μL/sec到约350μL/sec、例如5μL/sec到约300μL/sec、例如6μL/sec到约250μL/sec、例如7μL/sec到约200μL/sec、例如8μL/sec到约150μL/sec、例如9μL/sec到约125μL/sec以及包括10μL/sec到约100μL/sec。
在一些实施例中，鞘液注入口是位于喷嘴室壁中的孔口。鞘液注入口的孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线横截面形状(例如圆形、椭圆形)以及不规则形状(例如耦合到平面顶部部分的抛物线型底部部分)。在某些实例中，样品注入口的孔口的尺寸可以根据形状变化，具有0.1mm到5.0mm的开口，例如0.2mm到3.0mm、例如0.5mm到2.5mm、例如0.75mm到2.25mm、例如1mm到2mm以及包括1.25mm到1.75mm的开口，例如1.5mm的开口。
在某些实例中，主题***包括与流动池喷嘴孔口流体连通的样品询问区域。在这些实例中，样品流动流从流动池喷嘴远端处的孔口流出，并且可以在样品询问区域处利用光源照射流动流中的颗粒。询问区域的尺寸可以根据流动喷嘴的特性(例如喷嘴孔口的尺寸和样品注入口的尺寸)而变化。在实施例中，询问区域的宽度可以为0.01mm或更大，例如0.05mm或更大、例如0.1mm或更大、例如0.5mm或更大、例如1mm或更大、例如2mm或更大、例如3mm或更大、例如5mm或更大以及包括10mm或更大。询问区域的长度也可以变化，在一些实例中，该长度为0.01mm或更大，例如0.1mm或更大、例如0.5mm或更大、例如1mm或更大、例如1.5mm或更大、例如2mm或更大、例如3mm或更大、例如5mm或更大、例如10或更大、例如15mm或更大、例如20mm或更大、例如25mm或更大以及包括50mm或更大。
询问区域可以配置为有利于对流出的流动流的平面横截面进行照射，或者可以配置为有利于对预定长度的漫射场(例如利用漫射激光器或灯)进行照射。在一些实施例中，询问区域包括有利于对流出的流动流的预定长度进行照射的透明窗，该预定长度例如1mm或更长、例如2mm或更长、例如3mm或更长、例如4mm或更长、例如5mm或更长以及包括10mm或更长。根据用来照射流出的流动流的光源(如下所述)，询问区域可以配置为使100nm到1500nm的光通过，例如150nm到1400nm、例如200nm到1300nm，例如250nm到1200nm，例如300nm到1100nm，例如350nm到1000nm，例如400nm到900nm以及包括500nm到800nm的光。因此，询问区域可以由通过期望波长范围的任何透明材料形成，该透明材料包括但不限于光学玻璃、硼硅玻璃、派热克斯玻璃、紫外石英、红外石英、蓝宝石以及塑料，塑料例如聚碳酸酯、聚氯乙烯(PVC)、聚氨酯、聚醚、聚酰胺、聚酰亚胺或这些热塑性塑料的共聚物，例如PETG(乙二醇改性聚对苯二甲酸乙二醇酯)，以及包括聚酯的其他聚合物塑料材料，其中感兴趣的聚酯可以包括但不限于聚对苯二甲酸亚烷基酯，例如：聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、瓶级PET(基于单乙二醇、对苯二甲酸和其他共聚单体(例如如间苯二甲酸、环己烯二甲醇等)制成的共聚物)，聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(PBT)和聚(对苯二甲酸六亚甲基酯)；聚(亚烷基己二酸酯)例如聚(己二酸乙烯酯)、聚(1,4-己二酸丁二醇酯)和聚(己二酸六亚甲基酯)；聚(亚烷基辛二酸酯)，例如聚(亚乙基辛二酸酯)；聚(癸二酸亚烷基酯)，例如聚(癸二酸乙二醇酯)；聚(ε-己内酯)和聚(β-丙内酯)；聚(间苯二甲酸亚烷基酯)，例如聚(间苯二甲酸乙二醇酯)；聚(亚烷基2,6-萘-二羧酸酯)例如聚(亚乙基2,6-萘-二羧酸酯)；聚(亚烷基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)例如聚(亚乙基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)；聚(对亚苯基亚烷基二羧酸盐)例如聚(对亚苯基亚乙基二羧酸盐)；聚(反式-1,4-环己二基亚烷基二羧酸酯)例如聚(反式-1,4-环己二基亚乙基二羧酸酯)；聚(1,4-环己烷-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)例如聚(1,4-环己烷-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；聚([2.2.2]-双环辛烷-1,4-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)如聚([2.2.2]-双环辛烷-1,4-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；乳酸聚合物和共聚物，例如(S)-聚丙交酯、(R，S)-聚丙交酯、聚(四甲基乙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)；和双酚A、3,3'-二甲基双酚A、3,3',5,5'-四氯双酚A、3,3',5,5'-四甲基双酚A的聚碳酸酯；聚酰胺，例如聚对苯二甲酰胺；聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯，例如MylarTM聚对苯二甲酸乙二醇酯；等等。在一些实施例中，主题***包括位于样品询问区域中的比色皿。在实施例中，比色皿可以使100nm到1500nm的光通过，例如150nm到1400nm、例如200nm到1300nm、例如250nm到1200nm、例如300nm到1100nm、例如350nm到1000nm、例如400nm到900nm以及包括500nm到800nm的光。
在一些实施例中，主题***包括用于分选样品颗粒(例如细胞)的颗粒分选部件。在某些实例中，颗粒分选部件是颗粒分选模块，例如在2017年3月28日提交的美国专利公开No.2017/0299493和2018年10月30日提交的美国临时专利申请No.62/752793中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。在某些实施例中，颗粒分选部件包括一个或更多个液滴偏转器，例如在2017年6月14日提交的美国专利公开No.2018/0095022中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
在一些实施例中，主题***是流式细胞术***。合适的流式细胞术***可以包括但不限于在Ormerod(编)，Flow Cytometry:A Practical Approach，牛津大学出版社(1997)；Jaroszeski等人(编)，Flow Cytometry Protocols,Methods in MolecularBiology第91期，Humana出版社(1997)；Practical Flow Cytometry，第3版，Wiley-Liss(1995)；Virgo等人(2012)Ann Clin Biochem.1月；49(pt 1):17-28；Linden等人，SeminThrom Hemost.2004年10月；30(5):502-11；Alison等人，J Pathol，2010年12月；222(4):335-344；以及Herbig等人(2007)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.24(3):203-255中描述的那些；其公开内容通过引用并入本文。在某些实例中，感兴趣的流式细胞术***包括BDBiosciences FACSCantoTM II流式细胞仪、BD AccuriTM流式细胞仪、BD BiosciencesFACSCelestaTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSLyricTM流式细胞仪、BD BiosciencesFACSVerseTM流式细胞仪、BD Biosciences FACSymphonyTM流式细胞仪、BD BiosciencesLSRFortessTM X-20流式细胞仪和BD Biosciences FACSCaliburTM细胞分选仪、BDBiosciences FACSCountTM细胞分选仪、BD Biosciences FACSLyricTM细胞分选仪和BDBiosciences ViaTM细胞分选仪BD Biosciences InfluxTM细胞分选仪、BD BiosciencesJazzTM、BD Biosciences AriaTM细胞分选仪和BD Biosciences FACSMelodyTM细胞分选仪等。
在一些实施例中，主题颗粒分选***是流式细胞术***，例如美国专利No.10006852；No.9952076；No.9933341；No.9784661；No.9726527；No.9453789；No.9200334；No.9097640；No.9095494；No.9092034；No.8975595；No.8753573；No.8233146；No.8140300；No.7544326；No.7201875；No.7129505；No.6821740；No.6813017；No.6809804；No.6372506；No.5700692；No.5643796；No.5627040；No.5620842；No.5602039中描写的那些；它们的公开内容通过引用整体并入本文。
在某些实例中，主题***是流式细胞术***，该流式细胞术***配置为通过使用射频标记发射(FIRE)的荧光成像来表征流动流中的颗粒和对流动流中的颗粒进行成像，例如在Diebold等人在Nature Photonics第7卷(10)；806-810页(2013)中描述的以及美国专利No.9423353、No.9784661和No.10006852中描述的以及美国专利公开No.2017/0133857和No.2017/0350803中描述的那些，它们的公开内容通过引用并入本文。
集成电路设备
本公开的各个方面还包括集成电路设备，该集成电路设备编程为：根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施例中，集成电路设备编程为分选颗粒，例如分选到样品收集容器或废物收集容器。在某些实例中，感兴趣的集成电路设备可以包括现场可编程门阵列(FPGA)、专用集成电路(ASIC)或复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
在实施例中，集成电路设备被编程以生成频率编码的荧光数据。荧光数据可以从一个或更多个荧光检测器(例如一个或更多个检测通道)生成，荧光检测器是例如2个或更多个、例如3个或更多个、例如4个或更多个、例如5个或更多个、例如6个或更多个，并且包括8个或更多个荧光检测器(例如8个或更多个检测通道)。在一些实施例中，频率编码的荧光数据包括从来自其他检测器的光中获取(或导出)的数据分量，例如检测到的光吸收或检测到的光散射。在一些实例中，***配置为根据从样品中检测到的光吸收(例如来自明场光检测器)生成频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。例如，***可以配置为根据来自明场检测器的信号生成相位校正分量。在某些实施例中，***配置为生成相位校正的空间数据，该相位校正的空间数据是对根据频率编码的荧光数据计算的空间数据进行干涉相位调整的解释。在其他实例中，根据从样品中检测到的光散射(例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合)生成频率编码的荧光数据的一个或更多个数据分量。
在实施例中，主题集成电路设备被编程以根据频率编码的荧光数据计算空间数据。根据本公开的实施例的空间数据是通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来进行相位校正的。在一些实施例中，空间数据包括颗粒的水平尺寸维度、颗粒的垂直尺寸维度、沿两个不同维度的颗粒尺寸比率、颗粒组成的尺寸比率(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比率)。
在一些实施例中，集成电路设备编程以计算用于将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据的修正变换系数。例如，相位校正分量可以包括2个或更多个修正变换系数，例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个修正变换系数。在通过执行傅立叶变换来计算空间数据的情况下，相位校正分量可以包括修正变换系数，其中傅立叶变换仅生成实数学计算分量(即，不生成虚数学计算分量)。
在一些实例中，集成电路设备被编程以确定包括第一相位调整和第二相位调整的相位校正分量。每个相位调整可以是频率编码的荧光数据中不同相位源导致的结果。在一个示例中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。例如，集成电路设备可以被编程以基于来自明场光电检测器的输出信号确定第一相位调整。在一些实施例中，集成电路设备被编程以通过以下方式计算第一相位调整：将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以生成相位调整值；并计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整值。在这些实施例中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
在其他情况下，集成电路设备编程以计算基于样品中荧光团的荧光寿命的第二相位调整。在这些实例中，集成电路设备被编程以通过如下方法计算第二相位调整：获取来自所有荧光检测器的信号来确定信号中存在的相位，并根据荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。主题集成电路设备可以编程以使用不同的检测器通道来计算荧光寿命，例如通过使用2个或更多个检测通道、例如3个或更多个、例如4个或更多个以及包括5个或更多个检测器通道来计算荧光寿命。
在实施例中，主题集成电路设备被编程以通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施例中，为了计算相位校正的空间数据，***配置为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，集成电路设备被编程以利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施例中，集成电路设备被编程以利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)。在其他实施例中，集成电路设备被编程为利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换(DFT)。在其他实施例中，集成电路设备被编程以利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差并解复用该频率编码的荧光数据。
在某些实施例中，集成电路设备被编程以基于频率编码的荧光数据、计算的空间数据、生成的图像、根据计算的空间数据或生成的图像确定的颗粒的一个或更多个确定的特性(例如尺寸、质心、偏心率)或它们的一些组合来做出分选决策(如上所述)。在这些实施例中，分析包括对颗粒进行分类和计数，使得每个颗粒作为一组数字化的参数值存在。主题集成电路设备可以被编程以基于选择的参数触发分选部件，以便将感兴趣的颗粒与背景和噪声区分开。
套件
本公开的各个方面还包括套件，其中套件包括本文所述的集成电路设备中一个或更多个。在一些实施例中，套件还可以包括用于主题***的编程，该编程例如为计算机可读介质(例如，闪速存储器驱动器、USB存储器、光盘、DVD、蓝光光盘等)或用于从互联网网络协议或云服务器下载编程的指令的形式。套件还可以包括用于实践主题方法的指令。这些指令可以多种形式存在于主题套件中，形式中一种或更多种可以存在于套件中。这些指令可以存在的一种形式是作为在合适的介质或基材上(例如在其上印刷有信息的一张或多张纸、在套件的包装中和在包装说明书中等)的印刷的信息。这些指令的又一种形式是已经在其上记录信息的计算机可读介质，例如软盘、光盘(CD)、便携式闪存驱动器等。可以存在的这些指令的又一种形式是网站地址，可以经由互联网使用该网站地址来访问远程站点处的信息。
应用
本主题***、方法和计算机***用于期望对流体介质中的样品(例如生物样品)中的颗粒组成进行分析和分类的多种应用。在一些实施例中，本文描述的***和方法可用于利用荧光标签标记的生物样品的流式细胞术表征。在其他实施例中，***和方法用于发射的光的光谱学。此外，本主题***和方法用于增加可以从样品(例如在流体流中的样品)中收集的光中获得的信号。本公开的实施例期望提供一种如下应用，在细胞分选期间具有改进的细胞分选准确度、增强的颗粒收集、颗粒装载效率、较准确的颗粒装载和增强的颗粒偏转的流式细胞仪。
本公开的实施例还用于提供如下应用，可以期望将从生物样品中制备的细胞用于研究、实验室测试或用于治疗。在一些实施例中，主题方法和设备可以有利于获得从目标流体或组织生物样品中制备的个体细胞。例如，主题方法和***有利于从流体或组织样品中获得细胞以用作疾病(例如癌症)的研究或诊断标本。同样，主题方法和***可以有利于从流体或组织样品中获得细胞以用于治疗。与传统的流式细胞术***相比，本公开的方法和设备允许以提高的效率和低成本从生物样品(例如器官、组织、组织碎片、流体)中分离和收集细胞。
尽管有所附的权利要求，但本公开还由以下条款限定：
1、一种方法，包括：
根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据；以及
通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
2、根据条款1的方法，其中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换来计算空间数据。
3、根据条款2的方法，其中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换来计算空间数据。
4、根据条款2的方法，其中，通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)来计算空间数据。
5、根据条款1的方法，其中，利用数字锁相放大器来计算空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差并解复用频率编码的荧光数据。
6、根据条款1至5中任一项的方法，其中，相位校正分量包括用来将频率编码的荧光数据变换成相位校正的空间数据的修正变换系数。
7、根据条款1至6中任一项的方法，其中，根据颗粒生成频率编码的荧光数据包括利用光检测***检测来自样品中的颗粒的光。
8、根据条款7的方法，其中，从颗粒检测到的光包括光吸收、光散射、发射的光或它们的组合。
9、根据条款8的方法，其中，利用明场光电检测器检测光吸收。
10、根据条款8至9中任一项的方法，其中，利用荧光检测器检测发射的光。
11、根据条款1至10中任一项的方法，其中，相位校正分量包括第一相位调整和第二相位调整。
12、根据条款11的方法，其中，第一相位调整包括来自光检测***的输出信号。
13、根据条款12的方法，其中，第一相位调整包括来自明场光电检测器的输出信号。
14、根据条款13的方法，其还包括通过以下方式计算第一相位调整：
将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以生成相位调整值；以及
计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。
15、根据条款14的方法，其中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
16、根据条款11至15中任一项的方法，其中，第一相位调整是干涉相位调整。
17、根据条款16的方法，其中，干涉相位调整包括来自经配置为对流动流中的样品进行照射的光源的相移。
18、根据条款17的方法，其中，光源包括光束发生器部件，该光束发生器部件配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束。
19、根据条款18的方法，其中，光束发生器包括声光偏转器。
20、根据条款18至19中任一项的方法，其中，光束发生器包括直接数字合成器(DDS)RF梳状发生器。
21、根据条款18至20中任一项的方法，其中，光束发生器部件配置为生成频移的本振光束。
22、根据条款17至21中任一项的方法，其中，光源包括激光器。
23、根据条款22的方法，其中，激光器是连续波激光器。
24、根据条款17至23中任一项的方法，其中，干涉相位调整包括由光源的部件之间的振动引起的相移。
25、根据条款11至24中任一项的方法，还包括基于样品中荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。
26、根据条款1至25中任一项的方法，其中，通过集成电路设备根据频率编码的荧光数据计算颗粒的相位校正的空间数据。
27、根据条款26的方法，其中，集成电路设备是现场可编程门阵列(FPGA)。
28、根据条款26的方法，其中集成电路设备是专用集成电路(ASIC)。
29、根据条款26的方法，其中集成电路设备是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
30、根据条款1至29中任一项的方法，还包括利用光源照射流动流。
31、根据条款30的方法，其中，利用波长为200nm到800nm的光源照射流动流。
32、根据条款30至31中任一项的方法，其中，方法包括利用第一频移光束和第二频移光束照射流动流。
33、根据条款32的方法，其中第一频移光束包括本振(LO)光束，并且第二频移光束包括射频梳状光束。
34、根据条款32至33中任一项的方法，还包括：
向声光设备施加射频驱动信号；以及
利用激光器照射声光设备以生成第一频移光束和第二频移光束。
35、根据条款34的方法，其中激光器是连续波激光器。
36、根据条款1至35中任一项的方法，其还包括根据相位校正的空间数据生成颗粒的图像。
37、根据条款36的方法，还包括生成颗粒的图像掩模。
38、根据条款1至37中任一项的方法，还包括分选颗粒。
39、一种***，包括：
光源，其配置为照射包括流动流中的颗粒的样品；
光检测***；以及
处理器，其包括可操作地耦合到处理器的存储器，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器配置为：
根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；
通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
40、根据条款39的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
41、根据条款40的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
42、根据条款40的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)。
43、根据条款40的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器利用数字锁相放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
44、根据条款39至43中任一项的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器利用包括修正变换系数的相位校正分量将频率编码的荧光数据变换成空间数据。
45、根据条款39至44中任一项的***，其中，光检测***包括配置为检测光吸收、光散射和荧光中的一种或更多种的光电检测器。
46、根据条款45的***，其中，光检测***包括明场光电检测器。
47、根据条款39至46中任一项的***，其中，光检测***包括荧光检测器。
48、根据条款44至47中任一项的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器计算包括第一相位调整和第二相位调整的相位校正分量。
49、根据条款48的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器通过以下方式计算第一相位调整：
将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以生成相位调整值；以及
计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。
50、根据条款49的***，其中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
51、根据条款48至50中任一项的***，其中，第一相位调整是干涉相位调整。
52、根据条款51的***，其中，干涉相位调整包括来自光源的相移。
53、根据条款39至52中任一项的***，其中，光源包括光束发生器部件，该光束发生器部件配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束。
54、根据条款53的***，其中，光束发生器包括声光偏转器。
55、根据条款53至54中任一项的***，其中，光束发生器包括直接数字合成器(DDS)RF梳状发生器。
56、根据条款53至55中任一项的***，其中，光束发生器部件配置为生成频移的本振光束。
57、根据条款39至56中任一项的***，其中，光源包括激光器。
58、根据条款57的***，其中，激光器是连续波激光器。
59、根据条款51至58中任一项的***，其中，干涉相位调整包括由光源的部件之间的振动引起的相移。
60、根据条款39至59中任一项的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器基于样品中荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。
61、根据条款39至60中任一项的***，其包括集成电路部件，该集成电路部件编程用于：
根据流动流中的样品颗粒生成频率编码的荧光数据；
通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
62、根据条款61的***，其中，集成电路设备是现场可编程门阵列(FPGA)。
63、根据条款61的***，其中，集成电路设备是专用集成电路(ASIC)。
64、根据条款61的***，其中，集成电路设备是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
65、根据条款39至64中任一项的***，其中，***是流式细胞仪。
66、根据条款39-65中任一项的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器根据相位校正的空间数据生成颗粒的图像。
67、根据条款66的***，其中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时使处理器生成颗粒的图像掩模。
68、根据条款39至67中任一项的***，还包括细胞分选部件，该细胞分选部件配置为基于计算的相位校正的空间数据分选样品中的细胞。
69、根据条款68的***，其中，细胞分选部件包括液滴偏转器。
70、一种集成电路，其被编程以执行以下操作：
根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；
通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。
71、根据条款70的集成电路，其中，集成电路被编程以利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅立叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
72、根据条款71的集成电路，其中，集成电路被编程以利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
73、根据条款71的集成电路，其中集成电路被编程以利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
74、根据条款70的集成电路，其中，集成电路被编程以利用数字锁相放大器来计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差并解复用频率编码的荧光数据。
75、根据条款70至74中任一项的集成电路，其中，集成电路编程为利用包括修正变换系数的相位校正分量将频率编码的荧光数据变换成空间数据。
76、根据条款70至75中任一项的集成电路，其中，集成电路编程为计算包括第一相位调整和第二相位调整的相位校正分量。
77、根据条款76的集成电路，其中，集成电路编程为通过以下方式计算第一相位调整：
将来自明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘以产生相位调整值；以及
计算相位调整值的反正切以生成第一相位调整。
78、根据条款77的集成电路，其中，相位调整值是频率编码的荧光数据的离散傅立叶变换中所有频点的总和。
79、根据条款76至78中任一项的集成电路，其中，第一相位调整是干涉相位调整。
80、根据条款79的集成电路，其中，干涉相位调整包括来自配置为对流动流中的样品进行照射的光源的相移。
81、根据条款80的集成电路，其中，光源包括光束发生器部件，该光束发生器部件配置为生成至少第一频移光束和第二频移光束。
82、根据条款81的集成电路，其中光束发生器包括声光偏转器。
83、根据条款81至82中任一项的集成电路，其中，光束发生器包括直接数字合成器(DDS)RF梳状发生器。
84、根据条款81至83中任一项的集成电路，其中，光束发生器部件配置为生成频移的本振光束。
85、根据条款80至84中任一项的集成电路，其中，干涉相位调整包括由光源的部件之间的振动引起的相移。
86、根据条款76至85中任一项的集成电路，其中，集成电路编程为基于样品中荧光团的荧光寿命计算第二相位调整。
87、根据条款69至86中任一项的集成电路，其中，集成电路是现场可编程门阵列(FPGA)。
88、根据条款69至86中任一项的集成电路，其中，集成电路设备是专用集成电路(ASIC)。
89、根据条款69至86中任一项的集成电路，其中，集成电路设备是复杂可编程逻辑器件(CPLD)。
90、根据条款69至89中任一项的集成电路，其中，集成电路编程为根据相位校正的空间数据生成颗粒的图像。
91、根据条款90的集成电路，其中，集成电路编程为生成颗粒的图像掩模。
92、根据条款69至91中任一项的集成电路，其中，集成电路编程为基于相位校正的空间数据生成分选决策。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和示例的方式对上述发明进行了一些详细的描述，但根据本发明的教导，对本领域的普通技术人员来说是显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些改变和修改。
因此，前述内容仅说明了本发明的原理。应当理解，尽管在本文中没有明确描述或示出，但是本领域技术人员将能够设计出体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内的各种布置。此外，本文中叙述的所有示例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为推动本领域所贡献的概念，并且应被解释为不限于这种具体叙述的示例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施例及其具体示例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能的等同物。此外，此类等同物旨在包括当前已知的等同物和未来开发的等同物，即，无论结构如何，开发的执行相同功能的任何元件。此外，无论该公开是否在权利要求书中明确叙述，本文所公开的任何内容均不旨在供公众使用。
因此，本发明的范围并不旨在限于本文所示和描述的示例性实施例。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求书体现。在权利要求书中，35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)被明确定义为仅当在权利要求中的此类限制的开头引用了确切的短语“用于……的手段”或确切的短语“用于……的步骤”时才被援引为对权利要求的限制；如果在权利要求的限制中未使用此类确切短语，则35 U.S.C.§112(f)或35 U.S.C.§112(6)没有被援引。

Claims (15)

1.一种方法，包括：
根据流动流中的样品的颗粒生成频率编码的荧光数据；以及
通过利用相位校正分量对所述频率编码的荧光数据进行变换来计算所述颗粒的相位校正的空间数据。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述空间数据是通过利用所述相位校正分量或利用数字锁相放大器对所述频率编码的荧光数据进行傅立叶变换以使所述频率编码的荧光数据产生外差并解复用所述频率编码的荧光数据来计算的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述空间数据是通过利用所述相位校正分量对所述频率编码的荧光数据进行离散傅立叶变换或者利用所述相位校正分量对所述频率编码的荧光数据进行短时傅立叶变换(STFT)来计算的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述相位校正分量包括用来将所述频率编码的荧光数据变换成所述相位校正的空间数据的修正变换系数。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，根据所述颗粒生成所述频率编码的荧光数据包括利用光检测***检测来自所述样品中的颗粒的光。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，从所述颗粒检测到的光包括光吸收、光散射、发射的光或其组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，所述相位校正分量包括第一相位调整和第二相位调整。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述第一相位调整包括来自所述光检测***的输出信号，例如来自明场光电检测器的输出信号，所述方法还包括通过以下方式计算所述第一相位调整：
将来自所述明场光电检测器的输出信号与预定的恒定信号相乘，以产生相位调整值；以及
计算所述相位调整值的反正切，以生成所述第一相位调整。
9.根据权利要求8中任一项所述的方法，其中，所述第一相位调整是干涉相位调整。
10.根据权利要求9中任一项所述的方法，其中，所述干涉相位调整包括由光源的部件之间的振动导致的相移。
11.根据权利要求7中任一项所述的方法，还包括基于所述样品中的荧光团的荧光寿命来计算所述第二相位调整。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，通过集成电路设备根据所述频率编码的荧光数据计算所述颗粒的相位校正的空间数据。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，还包括根据所述相位校正的空间数据生成所述颗粒的图像。
14.一种***，包括：
光源，其配置为照射包括流动流中的颗粒的样品；
光检测***；以及
处理器，其包括可操作地耦合到所述处理器的存储器，其中，所述存储器包括存储在其上的指令，所述指令在由所述处理器执行时使所述处理器执行以下操作：
根据所述流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；
通过利用相位校正分量对所述频率编码的荧光数据进行变换来计算所述颗粒的相位校正的空间数据。
15.一种集成电路，被编程为执行以下操作：
根据流动流中的颗粒生成频率编码的荧光数据；
通过利用相位校正分量对所述频率编码的荧光数据进行变换来计算所述颗粒的相位校正的空间数据。
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